（应用化学专业论文）具有多种生物活性的GRGD四肽和GRGDS五肽的合成研究.pdf

四川大学硕士学位论文 鬻s 3 2 8 t 具有多种生物活性的g r g d 四肽和g r g d s 五肽的合成研究 应用化学专业 研究生付清泉指导教师李天全教授 含r g d 序列的活性短肽是各种基质蛋白中最常见的结构单元，也是广泛存 在的细胞间识别系统的基本单位。r g d 序列作为细胞表面整合素受体与细胞外 基质配体的一种可识别位点，在一定条件下，使供体与受体结合，并能介导细 胞外信息的传递，从而引起细胞内一系列重要的生物化学变化。r g d 序列的一 种重要生物功能是促进细胞与基质的粘附，这种粘附性成为药物设计，特别是 生物医学材料研究的新靶点。目前发现r g d 序列可广泛用于提高医学材料生物 相容性、抗血凝、治肿瘤、舒血管、材料表面内皮化等方面，是一种极具发展 潜力的肽类药物。 本论文用液相法合成四肽甘氨酰精氨酰甘氨酰天冬氨( g l y - a r g g l y a s p , g r g d ) 和五肽甘氨酰- 精氨酰一甘氮酰天冬氨酰- 丝氨( o l y - a r g - o l y - a s p - s e t , g r g d s ) 。 关键工作是氨基酸的保护。本文成功地对氨基酸的氨基，羧基以及精氨酸 的胍基进行了保护，得到了b o c g l y ；b o c a r g ( n 0 2 ) o h ；s e r o b z l ，b o c a s p ( o b z l ) o f l a s p ( o b z l ) 2 中间体。这些中间体通过t l c 、熔点、红外分析确认。在合成b o c g i y 时，考查了温度对反应的影响，结果表明，温度是影响反应进行的重要的因素。 利用优选法从三个方面考查了s e r o b z l 的合成，即温度，原料与催化剂配料比 以及反应时间，找到了合成s e r o b z l 的条件：以苯为共沸混舍物溶剂 原料与 催化剂的配料比为1 ：1 2 ；油浴1 1 0 0 c 回流6 小时。 接肽反应采用从末端氨基酸开始的反向合成路线，以n 羟基苯并三唑 ( h o b t ) 、n ，n - 二环己基碳二酰亚胺( d c c ) 为复合缩合剂，n 甲基吗啉( 删) 四川大学硕士学位论文 调节反应体系p h ，t h f 和d m f 为溶剂，叔丁氧羰基( b o c ) 用三氟乙酸去掉， 最后在p d c 催化下氢解去掉所有的保护基团。反应后得到的粗品用硅胶柱色谱 纯化，粗品肽用乙醇和水重结晶。所得的化合物经t l c 、熔点、红外分析、质 谱、氨基酸分析确认。实验表明，在液相法逐步按肽中，用三氟乙酸去叔丁氧 羰基( b o c ) ，在n 一羟基苯并三唑( h o b o 、n n 二环己基碳二酰亚胺( d c c ) 及n - 甲基吗啉( n m m ) 存在下接肽，是一种可供选择的方法。 关键词：活性短肽多肽合成氨基酸保护g r g dg r g d s 四川大学硕士学位论文 s t u d i e so nt h es y n t h e s i so f t e t r a p e p t i d eg r g d a n d p e n t a p e p t i d eg r g d s a b s t r a c t 1 h eb i o a c t i v er g dr e l a t e dp e p t i d e sa r et h eb a s i cc o n f o r m a t i o ni na l lk i n d so f m a t r i xp r o t e i na n dt h eb a s i cr e c o 班i z e ds i t eb e t w e e nc e l l s r g d ，a st h er e c o g n i z e d s i t eb e t w e e nt h ei n t e g r i na n dt h ee x t r a c e l l a rm a t r i x ，s e n dt h el i g a n da n dt h ea e c e p t o r t oc o m b i n es oa st ob r i n gas e r i e so fb i o c h e m i c a l c h a n g e s t h ei m p o 砘m t f u n c t i o no f r g di st oa d v a n c et h ec e l la d h e s i o n , t h i sa d h e s i o nh a sb e c o m et h en e w t a r g e ti nd r u g d e s i g n ，e s p e c i a l l yi nt h eb i o m a t e r i a l s i np r e s e n t ，r g d i su s e da st h ec o m p a t i b i l i t yo f t h eb i o m a t e r i a l s ，a n t i - t h r o m b u s ，a n t i - t u m o r , v a s o d i l a t i o na n d 也ee n d o t h e l i a lc e l l s g r o w t ho nt h em a t e r i a ls u r f a c e r g de o n l a i n i n gp e p t i d e sa n dd e r i v a t i v e sa r et h e p o t e n t i a lp e p t i d e d r u g s i nt h e p r e s e n tp a p e r , t w op e p t i d e s t e t r a p e p t i d eg t y a r g - o l y - a s p a n d p e n t a p e p t i d eg l y - a r g - g i y a s p s e r , w e r es y n t h e s i z e dt h r o u g hl i q u i d - p h r a s e s y n t h e s i s t h i s s y n t h e s i ss t a r t e dw i t l lt h ep r o t e c t i o no ft h e 龇n i r l oa c i d s u c c e s s f u l l y p r o t e c t i n gt h ea m i n o ，t h ec a r b o n y la n dt h eg u a n i d i n eo fa r g i n e ，g a i n i n gt h e s e i n t e r m e d i a t e s ：b o c g l y , b o e a r g ( n 0 2 ) o h ，s e r o b z l ，b o c a s p ( o b z l ) o h ，a s p ( o b z l ) t h e s ei n t e r m e d i a t e sw e r ec o n f i r m e db yt l c ，i n f r a r e ds p e c t r aa n d m e l t i n gp o i n t i n s y n t h e s i z i n gt h eb o c g l y , r e s e a r c h e dt h a tt e m p e r a t u r ei n f l u e n c e st h er e a c t i o n n e e x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a tt e m p e r a t u r ei st h ei m p o r t a n tf a c t o rt h a ti n f l u e n c e st h e r e a c t i o n r e s e a r c h e dt h es y n t h e s i so fs e r o b z li nt h r e e a s p e c t s ：t e m p e r a t u r e ，r a t i oo f t h em a t e r i a la n dt h ec a t a l y s t , t i m e f o u n do u tt h eo p t i m a l r o u t e ：s e l e c t i n gt h eb e n z e n e a st h ec o - b o i l i n gt h i n g ；r e f l u x i n ga t1 0 5 c - l1 0 ( 2o f t h eo i l - b a t ht e m p e r a t u r e ；t h e r a t i o o f t h e m a t e r i a l a n d t h e c a t a l y s t i s1 ：1 1 2 四川大学硕士学位论文 s e l e c t e dt h er e v e r s es y n t h e t i c a lr o u t eb e g i n n i n gf r o mt h el a s ta m i n oa c i d h o b t ， d c cu s e da st h ec o u p l i n ga g e n t s ，n m mu s e dt or e g u l a t ep h ，t h fa n dd m fu s e da s s o l v e n t ，t f au s e da sd e p r o t e c f i n gr e a g e n t ，i nt h el a s t a l l p r o t e c t i n gg r o u p sw e r e r e m o v e df r o mt h e p r o t e c t e dp e p t i d eb yc a t a l y t i ch y d r o g e n o l y s i s o v e r p a l l a d i u m - c a r b o n t h ec r u d e sw e r ep u r i f i e db ys i l i c ag e lt h i nl a y e rp l a t e sa n dt h e c r u d ep e p t i d e sw e r ep u r i f i e d b yr e c r y s t a l l i z a t i o nu s i n g e t o ha n dh 2 0 t l c ， p r o d u c t sw e r ec o n f i r m e d b y i n f r a r e ds p e c t r a , m a s ss p e c t r o m e t r y , m e l t i n g p o i n t ，t l c t h es e q u e n c eo fa m i n oa c i dw a sc o n f i r m e d b yt h e f l n i n oa c i d a n a l y s i s t h e e x p e r i m e n t a ld a t ai n d i c a t e dt h a ti nt h el i q u i d - p h r a s es y n t h e s i su s i n gh o b t , d c c a n d n m ma sc o u p l i n ga g e n t sa n dt f af o rd e p r o t e c t i o no fb o c m i g h tb eag o o dw a y o f c o m b i n a t i o nf o rs y n t h e s i s k e yw o r d s ：b i o a c t i v ep e p t i d e s y n t h e s i so fp e p t i d ep r o t e c t i o no ft h e q i n o a c i d g l y - a r g g l y a s pg l y a r g - g l y - a s p - s e r 四川大学硕士学位论文 弟一草刚置 1 1 多肽合成的沿革 多肽合成的历史大约1 0 0 多年的时间，但多肽合成的发展速度却是惊人的。 多肽合成的第一个阶段大约从1 9 0 1 年得到第一个自由肽开始到1 9 5 4 年合成催 产素止，可以说这5 0 来年是多肽合成的基础阶段。在这段时间里，积累了大量 合成方法，并合成了不少有特定顺序和功能的多肽片段。催产素的合成开创了 多肽合成的第二个阶段。这段时期不仅人工合成了许多活性多肽，并且开拓了 用合成方法研究活性多肽的结构和功能关系的新领域，此阶段的一个重要特点 是发现并合成了一些活性可与天然肽相比但结构却远为简单的肽段。这一阶段 可以说多肽合成取得了丰硕的成果，无论是在缩合剂、保护基团、反应条件以 及产物的分离和纯化等方面都有新的突破和发现。液相合成法、固相合成法相 继发展为多肽的常用合成方法。最近二、三十年来，由于越来越多的具有重要 生物功能的活性多肽被发现和被合成，使得活性多肽已经成为一个非常活跃的 领域。这阶段的典型成果如1 9 8 3 年b o l d l l 】等人首次从心肌匀浆中分离得到的 具有利尿和促尿钠排泄功能的心房肽。它的发现修正了人们对心脏功能的传统 观念一认为心脏仅为一个单纯的血泵，而现在认为，除了泵的功能外，心脏还 有内分泌功能。多肽生长因子【2 】( p o l y p e p t i d eg r o w t hf a c t o r ) 是近年发现的另一 类活性肽。它对细胞分裂、增殖具有重要作用。正常细胞的增殖是一个高度有 序的过程，其中生长因子起着十分重要的调控作用。现已发现的有皮下生长因 子、自细胞间介素、转化生长因子、神经生长因子等，从分子水平研究它们在 细胞调控过程中的作用，将使我们对正常细胞和肿瘤细胞的增殖机理有进一步 的了解，从而对战胜肿瘤起重要作用。在多肽的分离纯化方面，除层析和电泳 技术外，高效液相色谱( h p l c ) 的应用为多肽的分离和纯化提供了一个新的更 加有效的手段。 多肽合成的方法学在不断的创新 3 1 。肽的化学合成至今一直是肽研究的一个 重要方面，近年来新一代的保护基如胍基保护基( m 灯) ，脱保护基剂如三氟甲 磺酸脂硫代苯甲醚系列以及新一代缩合剂如三氮唑的二甲胺代磷化物b o p 等 不断出现，使合成方法不断丰富和完普，合成的总收率大大提高。无疑，肽合 成方法的不断创新，必将进一步促进活性肽的结构和功能关系的研究，开拓多 肽生物学研究的新领域。 殴川大学硬士学位论文 尽管如此，目前液相多肽合成中存在的“困难肽段”【4 】以及因缩合组分溶解 度低引起的反应不完全的问题依然存在，m e r r i f i e d 【5 】的多肽固相合成法提供了一 种快速、有效合成各种活性肽的有用方法。固相合成解决了液相合成中繁冗的 分离工作，减少了氨基酸的保护，得到一种最少保护的接肽方法，这也解决了 液相合成中肽段的溶解度问题。但固相合成也有缺陷，最大的问题是“缺陷肽” 的积累。所谓缺陷肽是由于每步反应不可能1 0 0 地进行，导致肽段中某些氨基 酸的弄失。当合成肽越大时，缺陷肽的积累就越多。另外合成产量过低也是问 题之一。本课题通过液相法合成四肽甘氨酰糖氨酰一甘氨酰天冬氨酸 ( g l y a r g g l y a s p ，g r g d ) 和五肽甘氨酰精氨酰甘氨酰。天冬氨酰丝氨酸 ( g l y - a r g - g l y - a s p s e r , g r g d s ) 序列，为进一步研究其生物功能提供物质基础。 1 2 课题意义及合成路线的选择 精氨酰甘氨酰一天冬氨酸( a r g - g l y - a s p ，r g d ) 是各种基质蛋白中最常见 的基本构成成分，也是广泛存在的细胞间识别系统的基本单位。r g d 序列最早 由p i e r s e h b a c h e r 等【6 l 在纤维连结蛋白( f n ) 中发现， 7 1 目前已知含有此序列或 相关序列的基质蛋白有纤维连接蛋白( f n ) 、玻连蛋白( v n ) 、胶原、凝血栓蛋 白、层连蛋白( l n ) 、纤维蛋白原等。这些基质蛋白是细胞外基质( e c m ) 的 组成成分，它们将功能和性质不同的的细胞有序联系起来成为一个整体，并协 调其功能。r g d 序列，作为细胞表面整合素受体与细胞外基质( e c m ) 配体或 基膜成分配体相结合的识别位点在一定条件下，使受体与配体( 含r g d 序列) 结合，将细胞外信息传入细胞内，引起细胞内一系列病理生理变化。人工合成 或生物提取物中含有r g d 序列的可溶性小分子肽能够竞争性地与细胞表面的 整合素受体结合，抑制细胞与细胞、细胞与基质之间的粘附，进而阻止细胞的 增殖、迁移、分化。由于许多病理过程与正常的细胞外基质( e c m ) 有关，因 此r g d 序列肽可望治疗一些疾病，该类肽的粘附性也就成为药物设计的新靶 点。目前发现的r g d 序列肽在医药上的用途有：抗血小板聚集及抑制血栓形成、 治疗肿瘤转移、舒血管、治疗眼科疾病川、材料表面内皮化嘲等。在肽类药物研 究中，r g d 序列肽受到广泛重视。肽的化学合成是肽研究的基础，因此化学合 成r g d 类多肽具有十分重要的现实意义。 本论文研究甘氨酰- 精氨酰甘氨酰天冬氨酸( g i y a r g - g l y a s p ，g r g d ) 四 2 四川大学硕士学位论文 肽和甘氨酰精氨酰甘氨酰天冬氨酰一丝氨酸( g l y - a r g - g l y a s p s e r ，g r g d s ) 五肽序列的液相合成。理论上讲这两个肽的合成可以有三条路线一j ，以合成 g r g d s 五肽为例。第一条路线从甘氨酸的羧基端出发一步一步后接氨基酸( 见 图1 1 ) 得到目标分子；第二条路线分别同时从甘氨酸的羧基端和丝氨酸的氮基 端出发，先合成两个带保护的肽片段，然后再将这两个肽片段缩合起来成五肽 ( 见图1 2 ) ；第三条路线从丝氨酸的氨基端出发一步步往前面接氨基酸( 见 图1 3 ) 得到目标分子。 g i v a r g g l ya s ps o f ，： p 鬟一d i 2 l 2 u y 0 h一刍 z ， z 0 h 一 y z l 图1 1 第一条路线( s y n t h e t i cr o u t e1 ) o h 一名 强 儡一o yx -锦 一 zl o y z l 0 h zl 图1 2 第二条路线( s y n t h e t i cr o u t e2 ) 3 四川大学硕士学位论文 v 、 瑞一 。l l 沙o * x o zo 2o 2y o y zl 图1 3 第三条路线( s y n t h e t i cr o u t e3 ) 按照第一条路线从甘氨酸的羧基端出发逐步往后面接氨基酸，一方面由于 甘氨酸、精氨酸的极性较大，其保护后的氨基酸衍生物在有机溶剂中的溶解度 相对较低，而液相接肽反应又多在在无水非质子溶剂中进行，这样就难以找到 反应所需溶剂。使缩合反应不能进行完全；另一方面这条路线还涉及天冬氨酸 的两个羧基的选择性保护，即在反应前天冬氨酸的两个羧基要用不同保护基分 别保护( 图l 中的y 和l 要不同) ，而在肽键形成以后，又要选择性地去掉d 一 羧基上的保护基( 即图l 中的y ) 同时要保留b 羧基上的保护基f 即图l 中的 l ) 以便实现肽链的定向延长，这在目前还是相当麻烦的( 图1 4 所示) 。 删一卿i y 删+ 2 7 1 洲- c h 2 c o o l 挪l r a f g _ g l y _ 啼i h h c 0 0 y c h 2 c o o l ，卜x q l y _ 一 r 量广g l y 州1 c 冒卜0 0 h c h 2 c o o l 图1 4 天冬氨酸选择性保护示意式 按照第二条路线同时从甘氨酸的羧基端和丝氨酸的氨基端出发，两边向中 4 四川大学硕士学位论文 间靠拢，一方面会遇到第一条路线中的溶解度较差的问题，另一方面，当皂化 掉羧基的酯以便实现肽链的增长时，肽键也有短裂危险。 按照第三条路线，首先将丝氨酸用苄脂保护，此衍生物( 图1 5 ) 在有机溶 剂中的溶解度较大，而前一个氨基酸即天冬氨酸的保护衍生物( 图1 6 ) 在有机 溶剂中的溶解度也较大，这就使整个反应在有机溶剂中容易缩合。当前面的甘 氨酸与天冬氨酸和丝氨酸连接起来后，整个有机分子的极性也因丝氨酸和天冬 氨酸的衍生物的极性大而较大，这给整个反应的进行，反应的后处理都带来了 方便。 o 图1 5 ( s o r 0 b z i ) 一e 一葚一一。 图1 6 ( b o o s o ( 0 b z i ) 旬h ) 将这三条合成路线进行分析比较后，我们选择了从丝氨酸出发一步一步向 前面接氨基酸的逐步合成路线。合成g r g d 四肽也是采用从天冬氨酸开始的反 向合成路线。 1 3 工作概述及总结 g l y a r g - g l y a s p ( g r g d ) 和g l y - a r g - g l y - a s p - s e r ( g r g d s ) 的合成是基 于以上分析进行的。氨基酸的氨基用叔丁氧羰基( b o c ，图1 7 ) 保护，反应以 叔丁氧甲酸酐【( b o o ) 2 0 】作为导入叔丁氧羰基( b o c ) 的试剂，水和乙醇作溶剂， 氢氧化钠为碱。实验表明，将文献【1 0 1 1 “】中的四氢呋喃( t h f ) 和二氧六环换为 乙醇是可行的，可简化操作步骤：丝氨酸的羟基不保护【l2 1 ，羧基以苄酯的形式 保护，通过实验找到了s e r o b z l 的合成条件：以苯作共沸混合物组分，苄醇既 作溶剂又作反应试剂，对甲苯瞬嘲屿丝氨酸1 ：1 2 作为反豳掰蝌比，油浴1 1 0 加 。 扣 刊o i 吒 ： 洲j 洲i 雠 一至| 四川大学硕士学位论文 热回流6 小时。在合成g r g d 四肽时，天冬氨酸的两个羧基不加选择地用苄酯保 护；合成g r g d s 五肽时，天冬氨酸的氨基用叔丁氧羰基( b o c ) 保护，b 羧基用 苄酯保护，o 一羧基不保护。精氨酸的氨基用叔丁氧羰基饵o c ) 保护，胍基用既经 济又易得的硝基保护“。 接肽反应采用逐步液相法，在n 一羟基苯并三氮唑( h o b t ，图1 7 ) ，n ，n - 二 环己基碳二酰亚胺( d c c ) 及n 一甲基吗啉( n m m ，图1 8 ) 存在下接肽，三氟乙酸 ( t f a ) 脱叔丁氧羰基( b o c ) ，实验表明，在液相逐步接肽中，这一体系具有操 作简单，易于纯化，收率较高等优点，是一种可供选择的方法。 圈1 7 ( f l o b t ) 圈1 8 ( n m m ) 6 一 。叱一强 甜i d i 6 酽 图 c z _ 四川大学硕士学位论文 第二章r g d 类多肽的研究进展 2 1 概述 多肽是由两个以上的氨基酸分子通过酰胺键联结而成，是构成蛋白质的结 构组分，其中的酰胺键称为肽键，由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由n 个氨基 酸组成的肽称为多肽。多肽和蛋白质具有十分重要的生理作用，是生命不可缺少 的物质。人体内的功能性蛋白质大多为载体，它们的生物作用通常由肽段来实 现。人体内还存在许多小分子肽，它们既是人体组织细胞再生的基本质，又具 有多种生物活性。这些活性短肽种类繁多，如：激活酶、抗体、担负转运功能 的白蛋白成分，调节代谢及信息的神经递质等等。人体内其他功能的调节，如 消化功能、心血管原血功能、内分泌和性功能的调节也都有肽类物质直接参与。 此外，肽还和免疫功能直接相关，是机体完成免疫功能和进行免疫调节的重要 活性物质。因此，科学界认为，肽是人体生命的反应体系。 近年来发现精氨酰天冬氨酰丝氨酸( a r g - g l y a s p 。r g d ) 序列肽是较重要 的一类肽，此序列最早由p i e r s e h b a e h e r 等 6 1 发现于纤维连结蛋白( f i b r o n e c t i n ， f n ) 。他们通过单克隆抗体抑制细胞粘连，从纤维连结蛋白( f n ) 中分离得到一个 仍具有粘连特性的分子量为1 1 5 k u 的多肽片段。通过合成小分子多肽的研究， 结果发现多肽片段中的精氨酰一甘氨酰一天冬氨酸( r g d ) 与纤维连结蛋白( f n ) 的粘连有着密切的关系，当用别的氨基酸取代其中的任何一个氨基酸都将丧失 其粘连活性。因此推测可能因为该部分有一个1 3 转角，从而形成一个亲水性环， 因而能与其它的细胞发生粘连。通过研究首次确认了r g d 序列为纤维连接蛋白 ( f i b r o n e c t i n ，简称f n ) 与其受体的位点。后来在多种粘附蛋白中都发现有r g d 序列，包括纤维连结蛋白，胶原，血管性假血友病因子。进一步研究发现，在 细胞外基质( e c m ) 中所有的这些糖蛋白都含有一个或多个r g d 序列为特异的识别 单位。1 9 8 7 年h y n e s 1 4 】在总结了己发现的r g d 受体、配体以及其它生物学性 质后，将r o d 受体统称为整合蛋白( i n t c g r i n ) 。整合蛋白( i n t e g r i n ) 介导着许 多种类的细胞一细胞以及细胞一底物之间的相互作用，参与许多生物学过程， 如：体内平衡、调节细胞粘附、细胞迁移、细胞信号传淋巴细胞的识别、血小 板的聚集、肿瘤细胞转移等。由于许多病理过程与正常的细胞外基质( b c m ) 有关，因此r g d 序列肽可望成为治疗一些疾病的药物，因而该类肽的粘附性成 为药物设计的新靶点。 7 四川大学硕士学位论文 r g d 类多肽作为整合素受体与细胞外基质( e c m ) 配体或基膜成分配体 相结合的识别位点，在一定条件下，使受体与配体( 含r g d 序列) 相结合，将 细胞外信息传入细胞内，引起一系列病理和生理变化。含有r g d 序列的多肽与 含有r g d 序列的蛋白一样，也具有与细胞表面受体结合的能力。人工合成的含 有r g d 序列的小分子多肽能够竞争性地与细胞的整合素受体相结合，抑制细胞 与细胞、细胞与基质之间的粘附，进而阻止细胞的增殖、迁移、分化。因此r g d 类多肽的合成及应用研究成为当今的热门领域之一。 2 2 治疗肿瘤转移 肿瘤的浸润和转移是恶性肿瘤的生物学特征，是导致肿瘤患者失去生命的 重要原因，也是肿瘤临床治疗的难题。在肿瘤的浸润和转移过程中，肿瘤细胞的 粘连起着极为重要的作用，其中包括肿瘤细胞自身之间的粘连、肿瘤细胞与血小 板间粘连、肿瘤细胞与毛细血管或淋巴管内皮细胞及内皮下基底膜的粘连。这 种粘连是肿瘤细胞在淋巴管、毛细血管内停滞和进一步破坏管壁发生侵袭转移 的一个关键，而且还能促进肿瘤细胞蓍床，形成继发性肿瘤 l5 1 。药物预防和治 疗肿瘤转移的基本策略是影响和干扰肿瘤细胞转移中发生的生理和生化过程 【1 6 1 。 含r g d 序列的抗粘附肽能够影响肿瘤细胞膜的粘附分子与基底膜和细胞 外基质的粘附，干扰肿瘤细胞侵袭稿近组织、进入和穿出血管壁向远处转移等 肿瘤转移的关键环节。r g d 类多肽还能与血小板直接结合，封锁血小板与肿瘤 细胞粘连蛋白的结合部位，从而能有效地防止小瘤栓和血小板介导的粘连桥形 成；更重要的是r g d 类多肽能首先与血循环中的肿瘤细胞表面的整合蛋白受体 结合，从而有效的抑制肿瘤与细胞外基质的粘连，因此r g d 类多肽能有效防止 肿瘤转移。 自从p i e r s c h b a c h e r 等嘲发现水溶性小分子肽甘氨酰精氨酰甘氨酰天冬氨 酰- 丝氨酰- 脯氨酸( g l d s p ) 和精氨酰甘氨酰习t 冬氨酰丝氨酸( r g d s ) 能 抑制正常大鼠肾细胞与纤维连接蛋白( f n ) 粘连以来，在这方面作了大量工作。 h u m p h r i e s 等l l7 j 将g r g d s 五肽与黑瘤素细胞共同注入鼠体内，结果发现 g r g d s 能够显著地抑制肿瘤细胞在肺中的滞留，从而抑制了肿瘤细胞的肺转 移，并能延长鼠的存活期。为了能够证明g r g d s 五肽是细胞与蛋白相互作用 8 四川大学硕士学位论文 的关键位点，他们将g r g d s 中的某一特定的氨基酸用别的氨基酸替换或将其 中的氨基酸两两交换，合成了r g r e s 、g r d g s ，结果发现这两个相似肽都没 有抑制肿瘤转移的作用。他们还分别检测了g l y 、s e r 、a s p 、a r g 这四种游离的 氨基酸抑制肿瘤转移的作用，结果发现这四个氨基酸均无此活性，从而证明了 g r g d s 的活性并不是由其中的某一个单独的氨基酸引起的。s h a w nk s t i c k e l 等i l 圳将用荧光标记的a a c t i n i n 和v i n c u l i n 注入到3 t 3 细胞中，在注入5 0 u g m l 的g r g d s 前后用显微镜观察，结果发现在加入g r g d s 5 分钟后，带荧光标记 的a a c t i n i n 和v i n c u l i n 同时从连接位点离去，其作用机理在于g r g d s 竞争性 地与受体结合，从而达到抑制粘连的目的。 h a y m a n 等i l 州还研究了含r g d 序列的r g d s ，g r g d s p , g r g d s p c ， g r g d a p4 个多肽和不含r g d 序列的t g r g ，r g n s ，r v d s p a c ，d r e d s r c ， r v d s p a c 5 个肽，结果发现前者有抑制正常大鼠肾、变异的鼠肾、人骨肉瘤细 胞的粘连作用，其中尤以g r g d s p 的活性最强；后5 个多肽则没有这种抗粘连 活性。最近还报道了r g d 类多肽能抑制人黑素瘤细胞与局部淋巴道的粘连，从 而抑制肿瘤细胞淋巴道的转移【2 0 l 。 r g d 类的多肽能明显抑制肿瘤细胞与细胞外基质的粘连和肿瘤细胞诱导 的血小板凝集作用，从而有效地抑制肿瘤细胞的转移，目前人们已经注意到了 其在临床上治疗肿瘤转移的应用价值。继续寻找抑制粘连作用强，持续时间长， 能用于临床的r g d 类的多肽是今后的研究方向。 2 3 抗血小板聚集及抑制血栓形成的作用 血小板在血栓的形成过程中起着重要作用。o ”正常血小板在凝血酶原、二磷 酸腺苷或胶原诱导下被激活，释放花生四烯酸，花生四烯酸在环氧化酶催化下 转变为环内过氧化物，后者在异构酶作用下生成血栓素a ：，引起血小板凝聚和粘 附。血小板在外界的影响下被激活后，其表面的膜受体发生构象变化，使得表 面的i i b i i i a 受体暴露，而纤维蛋白的d 和y 链的r g d 序列肽可以被i i b i i i a 受 体特异地识别，介导纤维蛋白与血小板结合，结果犹如链条将相邻的血小板栓 在一起，从而形成血栓。 北京医科大学宣武医院的张滓等蚴采用r g d 序列肽r g d s 四肽，观察了r g d s 四肽对血小板聚集功能，实验性血栓形成以及对纤维蛋白溶解系统的影响。结 9 四川大学硕士学位论文 果表明，r g d s 四肽能够显著抑制血小板聚集功能，一分钟聚集抑制率，最大聚 集抑制率均随体外浓度增加而增加( o 0 5 1 0 m m o l l ) ，同时，聚集速率显著降 低。体内给予r g d s 能显著抑制颈总动脉旁路血栓形成，抑制率达5 1 ，但次浓 度对纤溶活性指标没有影响。赵明等”合成了r g d s ，r g d v ，r g d f 3 种四肽，测定了 它们的抗血栓活性，在5 u m o l k g 的剂量下，r g d s 和r g d v 的抗血栓活性与对照组 相比，抗血栓作用无统计学差异。在2 5 u m o l k g 的剂量下，r g d f 有明显的抗血 栓作用。该结果表明，羧端的氨基酸残基对生物活性有影响。由于g p 仅识别r g d 三个氨基酸残基，羧端残基的影响只能是调节四肽链的构象，构象进而影响肽链 与受体的络合水平。 r g d 序列与i ib i l i a 受体的特异性结合，构成了含r g d 序列肽与纤维蛋 白竞争受体的优秀性质，例如，r g d s 不仅可以抗血小板聚集，还明显抑制血栓 形成m 】。于是在肽的抗血栓药物研究中含r g d 序列的多肽受到广泛重视。r g d 序列肽抑制血栓形成的机制在于其抗血小板方面，即通过作用于i i b a 受体， 抑制血小板聚集而起作用。 2 4 舒血管作用 有关r g d 类多肽的舒血管活性的报道还很少，目前能查到的资料只有北 京医科大学的彭师奇所作的工作。1 9 9 3 年赵明等阴l 首先注意到了r g d 类多肽 的舒血管作用。【2 5 】为了研究r g d s 相关多肽的舒血管作用，研究了r o d f , a p l r v , a p l r v r g d s ，a p l r v r g d f , 在体外预处理大鼠的动脉肌条后观察了 上述合成多肽的舒血管作用，检测了三种剂量下收缩的肌条的舒张程度，发现 a p l r v r g d f 作用显著，并且a p l r v 和r g d f 对此作用都有影响。惦来他 们还研究了r g d v , r g d s 和r g d f 的舒血管活性，发现它们的活性依次降 低，r o d s 和r g d v 显示出明确的舒血管活性，j 、剂量时r o d f 的舒血管作用与 对照组相比，无统计学意义。 2 5 材料表面内皮化 随着现代医学的发展，人工器官的研制与临床应用也越来越广泛为了满足 人工器官的发展要求，研究开发高性能的生物医学材料成为关键问题之一。含 r g d 的多肽对内皮细胞有较强的识别作用在材料表面接枝r g d 短肽，能在一 四川大学硕士学位论文 定程度上促进细胞在材料表面的粘附，铺展，生长，最终成膜。实现在材料表 面形成具有生物活性的内皮细胞膜，提高生物材料组织相容性和材料界面与血 液的相容性的目的。y a m a o k a 等【2 6 】研究表明，r g d 肽固化的薄膜，能促进细胞在 薄膜表面的粘附并发现细胞在膜上粘附的数目随固r g d 的数目的增加而增加。 r o b i n a q u i r k 等【2 ”将g r g d s 粘附到p l l ( 聚亮氨酸) ，发现改性后的材料能明 显促进牛动脉内皮细胞的铺展，增加p l l 上g r g d s 的数目，能克服p l l 产生 的负效应 随着对r g d 类肽研究的不断深入，发现许多低构象能的r g d 类似肽和模 拟肽具有较高的生物活性，这使r g d 类多肽得到更广泛的应用。但是，大多数 内源性肽在循环过程中一般只有很短的半衰期，因而减弱了其治疗效果和生物 活性。为了获得可以接受的效果，往往需要高剂量的含r g d 序列的线形肽，这 无意增加了治疗费用并有可能导致不必要的副反应，因此，增加肽类化合物的 稳定性，提高肽的生物活性，是许多药物化学家对r g d 类肽进行改造的目标。 四川i 大学硕士学位论文 第三章氨基酸保护 3 1 前言 化学合成多肽的任务就是如何把各种氨基酸单元按照设定的次序和方式连 接起来。如果直接用氨基酸在1 0 0 下加热或在室温下长时间放置成肽，反应缺 乏定向性，将生成两种自缩合和两种混缩合序列的肽混合物。因此，为了得到 特定顺序的合成多肽，必须用保护氨基的氨基酸与保护羧基的氨基酸缩合。一 般模式如图3 1 所示，即先将不需要反应的氨基或羧基用适当的保护基团暂时保 护起来，然后再进行连接反应，以保证合成的定向进行。 r 宁f ，r 2 x n h c h c o y 。h 2 n c h c o o q + x n h c h c o h n c h c o o q 图3 1 接肽反应模式 图3 1 中的x 和q 分别是氨基和羧基的保护基，它不仅可以防止副反应的 发生，还具有降低氨基酸分子内两性离子的形成并使之在有机溶剂中的溶解度 增大。由此所得到的产物都是带有保护基的肽。如果肽链还要增长，即需要从 n 端或c 端延长肽链，则可以先选择性的脱去x 或q ，然后荐同新的n 保护氨 基酸( 或肽) 或c 保护氨基酸( 或肽) 进行连接，并依次不断重复下去，直到 所需要的肽链长度为止。 对于合成含有谷氨酸( o l u ) ，天冬氨酸( a s p ) ，赖氨酸( l y s ) ，精氨酸( a r g ) 等带侧 链功能团的氨基酸的肽来说，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般 也需要用适当的保护基将侧链基团暂时的保护起来。 氨基酸的保护主要涉及到羧基、氨基以及侧链基三个方面。保护氨基实际上 就是封闭氮原子上的未共用电子对，以降低氨基的亲核能力。一种方法是将氨 基酰化，这样氮原子上的孤电子对和羰基共轭，氮上的孤对电子离域，其亲核 性降低；另一种方法是使用体积大的基团如【( c h 3 ) 3 c 】，遮蔽氮原子上的电子。 已经使用过的氨基保护基团很多。归纳起来可以分为烷氧羰基，酰基和烷基三 大类a 其中由于烷氧羰基的共轭效应和空间位阻都将降低氮的亲核性，故较常 使用。例如苄氧羰基( z ，图3 2 ) 和叔丁氧羰基( b o c ) 。苄氧羰基( z ) 虽然1 9 3 2 四川大学硕士学位论文 年就由贝尔格曼发现，但至今还在普遍应用，其优点是：( a ) 试剂制备和导入 都比较容易；( b ) n 一苄氧羰基氨基酸和相应的肽容易结晶而且比较稳定；( c ) 在活化时不易消旋；( d ) 能用多种温和的方法选择性脱去。在多肽合成中苄氧 羰基( z ) 一般可用氢解的办法脱去，它对乙酸乙酯的h c l 溶液或三氟乙酸( t f a ) 是稳定的；叔丁氧羰基( b o c ) 具有如下优点：( a ) 叔丁氧羰基一氨基酸，除个别 外都能得到结晶。( b ) 叔丁氧羰基易于酸解除去，但也具有一定的稳定性。( c ) 对碱水解和肼解稳定。( d ) 对催化氢解稳定，但比苄氧羰基对酸要敏感得多。 叔丁氧羰基( b o c ) - - 般用乙酸乙酯的h c l ( h c l ，e a ) 溶液或三氟乙酸去除。因此在 多肽合成中这两种氨基保护基可以互补使用。其它常用的烷氧羰基保护基有： 联苯异丙氧羰基( b p o c ，图3 3 ) ，芴甲氧羰基【2 8 ( f m o c ，图3 4 ) ，乙烯氧羰基( v o c ， 图3 5 1 。 d c h 2 0 - - 8 一 吨土 h r o c 一 图3 4 ( f m o c ) 吣 ：卫 1 c r l 3 图3 3 ( b p o e ) c m 战一 图3 5 ( v o e ) 在多肽合成中，除了羧基组分的羧基需要活化以外，其它不反应的羧基都需 要保护。一般对羧基的保护采用成酯的形式。在多肽合成中用得最多的是苄酯、 甲酯和乙酯，根据不同的合成需要可以选择不同的酯。如果要得到的肽末端是 酰胺形式的，也可以采用酰胺的形式加以保护。氨基酸的侧链基在不同的合成 中对其保护的要求不一样，有些侧链基在合成中可以保护也可以不保护，如组 氨酸的咪唑基，而有些侧链基在合成时是必须要保护的，如半胱氨酸的巯基和 赖氨酸的u 氨基在合成时是毫无例外的必须加以保护的。 四川大学硕士学位论文 3 2课题设计 本课题的目标分子涉及到四种氨基酸：丝氨酸( s e r ，图3 6 ) ，甘氨酸( g l y ， 图3 7 ) ，精氨酸( a r g ，图3 8 ) 和天冬氨酸( a s p ，图3 9 ) ，它们的结构分别如下所 示。它们在接肽时需要保护。 n h 2 州一洲n h s _ c 髓c 兰o 一 = i o h 图3 8 ( a r g ) o h 2 n e h c o h h 图3 7 ( g i y ) 丝氨酸在接肽时有两个基团需要保护，即羧基和羟基。羧基的保护方法 是成酯。为了提高丝氨酸的酯化物在有机溶剂中的溶解度，同时也为了能够在 最后氢解去掉合成肽上的其它保护基时能够一起氢解去掉丝氨酸上的保护基， 我们采用苄酯保护丝氨酸上的羧基。在液相合成肽中，丝氨酸的羟基一般可以 不加以保护，但当丝氨酸的羧基被活化或缩合反应较慢以及羧基组分过量较多 时，也会发生由于羟基所带来的副反应；丝氨酸上的羟基有时也易被乙酰化从而 带来副反应。为了避免羟基所带来的副反应或改变反应物与产物的溶解性质，有 时也需要对羟基进行保护。本课题的目标分子中，丝氨酸处于肽链的末端，羟 基所能带来的副反应就是与氨基竞争发生对另一活化的羧基组分的羰基的亲核 反应，羟基与氨基相比，亲核性要弱得多，我们用d c c 和h o b t 组合接肽时， 反应也快，因此，我们就没有保护丝氨酸的侧链羟基。在遇到这种情况时，有 人对羟基没有加以保护【竭，也有人为了增加丝氨酸保护衍生物的溶解度，对羟 基也加以了保护【3 0 】f 2 3 l ，都获得了成功。 在合成g r g d s 五默时，天冬氨酸涉及n 羧基和b 一羧基的选择性保护，将 天冬氨酸的b 一羧基保护，a 羧基释放出来与后面的丝氨酸保护衍生物接肽， 1 4 ho o j c 2 h h hc c o n 2 h ho o_加c c c o n 2 h 四川大学硕士学位