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硕士论文 纳米金聚吡咯在d n a 电化学传感器中的应用 摘要 d n a 探针的固定是d n a 电化学生物传感器制作的首要问题，它的固化量和 活性将直接影响传感器的灵敏度。本论文主要采用自组装法固定d n a ，并结合 纳米材料的应用以制备d n a 电化学生物传感器。主要包括以下三个部分的内容： 1 、运用了恒电位的方法在氧化铟锡玻璃电极( i t o ) 上合成了导电纳米聚 吡咯薄膜，并将其作为基底，通过循环伏安和恒电位两种不同的电化学方法在该 聚吡咯修饰电极表面电化学制备纳米金颗粒，讨论了实验各参数对其电化学性能 的影响。通过电化学测试、扫描电子显微镜和原子力显微镜等表征手段对其性能 进行了分析，结果发现，有聚吡咯基底的纳米金修饰电极较无聚吡咯基底的纳米 金修饰电极的电信号强，纳米金颗粒更小，比表面积更大，这将有利于构建d n a 生物传感器的功能敏感膜。 2 、构建了以上述i t o p p y a u 修饰电极为基底，基于 f e ( c n ) 6 】3 非体系下的单 链d n a 探针。通过自组装的方法确定了其最佳自组装时间和浓度，通过循环伏 安法( c v ) 和差分脉冲伏安法( d p v ) 研究了测试溶液的离子强度，p h 及c v 扫速对其电化学信号的影响，确定了单链d n a 探针在 f e ( c 1 叼6 】3 - 4 - 体系中的最佳 检测条件，并分析了单链d n a 修饰电极表面的动力学参数。 3 、构建了基- 于 f e ( c n ) 6 】3 槔体系下d n a 生物传感器，讨论了互补链d n a 的最佳杂交时间，分析了双链d n a 修饰电极表面的动力学参数，通过d p v 法 测试了该d n a 生物传感器的线性范围为1 0 * 1 0 m o l l 一，检测下限为 1 8 x 1 0 l o m o l l 1 ，并研究了该传感器的再生性及稳定性。 关键词：聚吡咯纳米金d n a 电化学生物传感器 a b s t r a c t硕士论文 a b s t r a c t t h ei m m o b i l i z a t i o no ft h es i n g l e s t r a n d e d d n a ( s s d n a ) p r o b e s o nt h e e l e c t r o d ei st h ek e ys t e pi nt h ep r e p a r a t i o no fd n ae l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s i t s i m m o b i l i z a t i o nq u a n t i t ya n da c t i v i t yw i l ld i r e c t l ya f f e c tt h es e n s i t i v i t yo ft h es e n s o r i nt h i sp a p e r , t h es s d n ai si m m o b i l i z e dt h r o u g hs e l f - a s s e m b l y , c o m b i n e dw i t l lt h e a p p l i c a t i o no fn a n o - m a t e r i a l st op r e p a r ea ne l e c t r o c h e m i c a ld n ab i o s e n s o f t h e p a p a rc a nb es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 c o n d u c t i v en a n o - p o l y p y r r o l ef i l m sa s t h es u b s t r a t ea r es y n t h e s i z e do nt h e i n d i u m - t i no x i d eg l a s se l e c t r o d e ( i t o ) t h r o u g hc o n s t a n tp o t e n t i a lm e t h o d t h e n ，t w o e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d sa r eu s e dt os y n t h e s i z en a n o g o l dp a r t i c l e so nt h es u r f a c eo f t h ei t o p p ym o d i f i e de l e c t r o d e t h ei n f l u e n c eo ft h ee x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r so nt h e e l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h ee l e c t r o d e si sd i s s c u s s e d t h ee l e c t r o c h e m i c a l p e r f o r m a n c ea n dm o r p h o l o g yo ft h ef i l m sa r ec h a r a c t e r i z e dt h r o u g he l e c t r o c h e m i c a l t e s t s ，s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) a n da t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) t h e r e s u l t sr e v e a lt h a tt h ee l e c t r i c a l s i n g a lo fi t o p p y a ui sm u c hs t r o n g e r ；t h es i z eo f a u n po ni t o p p y a ui ss m a l l e r , a n dt h es u r f a c ea r e ao ft h es a m ee l e c t r o d ei sm u c h l a r g e rt h a nt h ei t o a ue l e c t r o d e t h e s ep e r f o r m a n c e sw i l lh e l pt ob u i l dt h ef u n c t i o n a l s e n s i t i v em e m b r a n eo fd n ab i o s e n s o r 2 t h es s - d n ap r o b eo ni t o p p y a um o d i f i e de l e c t r o d em e n t i o n e da b o v eh a s b e e nc o n s t r u c t e do nt h eb a s i so f f e ( c n ) 6 州”s y s t e m t h eo p t i m a lt i m ea n dt h eb e s t c o n c e n t r a t i o no fa s s e m b l ya r ed e t e r m i n e d c y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n dd i f f e r e n t i a l p u l s ev o l t a m m e t r y ( d p v ) a r ea p p l i e dt oi n v e s t i g a t et h ei n f l u e n c eo fi o n i cs t r e n g t h , p hv a l u eo ft h e f e ( c n ) 6 】纠4 s o l u t i o n ，a n dt h ec vs c a nr a t eo nt h ee l e c t r o c h e m i c a l p r o p e r t i e s t h ed e t e c t i o nc o n d i t i o no fs s d n ap r o b eu n d e rt h e f e ( c n ) 6 3 棒s y s t e m h a sb e e no p t i m i z e d m o r e o v e r , t h ek i n e t i cp a r a m e t e r so ft h es s - d n am o d i f i e d e l e c t r o d ea r ea n a l y z e di nd e t a i l 3 ad n ae l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rb a s e do n f e ( c n ) 6 】3 社s y s t e mh a sb e e n f a b r i c a t e d t h eh y b r i d i z a t i o nt i m eo fc o m p l e m e n t a r y d n ai so p t i m i z e d t h ek i n e t i c p a r a m e t e r so ft h ed o u b l e - s t r a n d e dd n a m o d i f i e de l e c t r o d ea l ea n a l y z e d t h el i n e a r r a n g ef r o m10 8t o10 - 6m o l l - 1o ft a r g e td n a i so b t a i n e db ym e a n so fd p va n dt h e d e t e c t i o nl i m i to f t h ed n ae l e c t r o c h e m i c a ls e n s o ri s1 8 x 1 0 q o m o l l m o r e o v e r , t h e r e g e n e r a t i o na n dt h es t a b i l i t yo ft h es e n s o ra r ea l s os t u d i e d k e yw o r d s ：p o l y p y r r o l e ，n a n o g o l d ，d n ae l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：乏量盈 年6 月媚 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名： 年6 月徊 硕士论文纳米金聚吡咯在d n a 电化学传感器中的应用 1 绪论 核酸是生物体内的一类含有磷酸基团的重要生物大分子，担负着生命信息的 储存和传递，是生命科学研究中的一个重要领域。脱氧核糖核酸 ( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 是核酸中的一种，是主要的遗传物质。对它的 研究在科学中具有重要意义。 d n a 的测定主要是指靶d n a 的检测、d n a 序列的测定和d n a 突变的测 定。这些测定在分子生物学及其基因操作研究、临床诊断、反恐侦检、食品安全、 检疫等方面有广泛用途。传统的d n a 检测主要依靠膜分子杂交和电泳。近十多 年来，d n a 传感器和d n a 阵列的出现克服了传统方法耗时、费力、低效率的缺 点。 1 1 生物传感器 1 1 1 生物传感器概述 生物传感器是一类特殊形式的传感器，是一个典型的多学科交叉的产物，结 合了生物学、化学、物理学、信息科学及相关技术，能够对所需要检测的物质进 行快速分析和追踪，现己发展成为一个活跃的研究领域，并展现出了广阔的应用 前景。 生物传感器的构成主要包括生物敏感膜和换能器两部分。生物敏感膜 ( b i o s e n s i t i v em e m b r a n e ) 又称分子识别元件( m o l e c u l a rr e c o g n i t i o ne l e m e n t ) ，它 是生物传感器的关键元件，直接决定了传感器的功能与质量。因其所选材料不同， 其组成可以是酶、核酸、免疫物质、全细胞、组织、细胞器等其它不同组合。而 换能器的作用是将各种生物的、化学的和物理的信息转变成为电信号，以便于人 们进行后期数据分析。所以当待分析物扩散进入固定化生物敏感膜层，经分子识 别，发生生物学反应，产生的信息继而被相应的化学换能器或物理换能器转变成 可定量和可处理的电信号，再经过二次仪表( 检测放大器) 放大并输出，这就是 生物传感器的工作原理。 根据分子识别元件的不同和按所用换能器的不同均可以将生物传感器分为 七大类( 如图1 1 和1 2 ) 。 i 绪论硕士论文 脚蒜巳，燃。卜 图1 i 生物传感器分类图1 2 生物传感器分类 1 1 2 电化学生物传感器概述 电化学生物传感器是以电化学传感器作为基础电极与生物活性材料组成的 生物传感器，简称为生物电极。这类传感器发展最早，研究内容也十分丰富，取 得了大量的研究成果，并已经获得了广泛应用。 电化学生物传感器主要包括酶电极、微生物电极、免疫电极、组织电极、细 胞器电极和d n a 电极。与酶电极、微生物传感器和免疫电极等相比较，d n a 传 感器的研究起步比较晚，直到2 0 世纪9 0 年代中期以后才有陆续报道。 1 1 3d n a 电化学生物传感器的工作原理 d n a 电化学传感器通常由已知序列的单链d n a 分子和电极组成。该单链 d n a 分子称为d n a 探针，一般为寡聚核苷酸。按照d n a 碱基配对原理，探针 能够识别样品中的靶d n a ( 变性为单链) 并与之杂交。这一过程可以通过包括 电化学在内的各种方法进行检测。d n a 电化学传感器的原理如下图( 1 3 ) 所示。 2 一一一一一一一一一一一一一一 硕士论文纳米金聚吡咯在d n a 电化学传感器中的应用 电学信号测定 图1 3d n a 电化学传感器的一般原理 1 1 4d n a 电化学传感器的类型： d n a 电化学传感器有多种类型，根据作用原理不同，可以分为五大类：直 接d n a 电化学( d i r e c td n ae l e c t r o c h e m i s t r y ) 、间接d n a 电化学( i n d i r e c td n a e l e c t r o c h e m i s t r y ) 、特异性氧化还原指示剂型( s p e c i f i cr e d o xi n d i c a t o r ) 、d n a 介 导的带电传输( d n a m e d i a t e dc h a r g et r a n s p o r t ) 、纳米颗粒电化学放大 ( n a n o p a r t i c l e se l e c t r o c h e m i c a le n h a n c i n g ) 。 1 1 5d n a 电化学传感器的特征： 特异性好；d n a 分子双链之间具有非常高的特异性识别能力。 稳定性好：虽然各种d n a 酶( 内切酶或外切酶) 能够水解d n a 分子， 但离体d n a 比多数蛋白质( 酶) 分子的热稳定性更好，所制成的传感器贮存时 间比一般酶电极长。 制备简单；d n a 的获得比酶或抗体等蛋白质获得要容易得多，既可以通 过微生物大量表达，又可以用仪器批量合成。 d n a 的操作方法具有通用性，容易标准化。 结合芯片技术，容易制备d n a 阵列，实现高通量测定。 灵敏度高，可以达到1 0 。1 1 m o l l 1 以上。 用途极其广泛。 1 1 6d n a 在电极上的固定方法： 3 l 绪论硕士论文 探针d n a 在电极表面的固定是整个电化学d n a 生物传感器中一个非常关 键的步骤，而其固定方法却是多种多样。目前的方法主要有吸附法、共价键合法、 自组装法、聚合法、组合法等。各种方法的特点如下表l l 所示。检测结果的高 灵敏度要求杂交效率的最大化，高选择性则要求非特异性吸附的最小化。而在固 定过程中对界面化学和表面覆盖率进行很好地控制，能够确保固定在界面上的探 针保持较高的反应活性、最优的方向性和可接近性以及长时间的稳定性，同时避 免在检测过程中非特异性吸附的发生。 表1 1d n a 固定方法 其中自组装法是在金电极上固定d n a 的一个普遍方法。将一端带有巯基的 d n a 通过a u - s 键化学吸附到金电极表面上【l 叫。化学吸附能使一端带有巯基的 探针完成单点结合。这种固定的结合作用较强，方法也简单，同时探针在结构上 的灵活性也很好。巯基化的d n a 被运用得最多，且己被商品化。 1 2 导电聚合物 1 2 1 导电聚合物概述 导电聚合物是指一类具有共轭链结构、氧化或还原掺杂后具有导电性的聚合 物。其导电率可从绝缘体延伸到导体范围。2 0 世纪7 0 年代，美国的a l a nj h e e g e r 教授、a l a ng m a c d i a r m i d 教授和日本的白川英树教授合作研究发现，聚乙炔薄 膜经电子受体掺杂后电导率可提高9 个数量级，进而可以达到1 0 3 s c m 7 - 钔，这一 重大发现打破了有机高分子聚合物都是绝缘体的传统观念，并开创了导电聚合物 4 硕士论文 纳米金聚吡咯在d n a 电化学传感器中的应用 的研究领域。在早期的研究中，人们提出了导电聚合物电荷载流子的孤子理论和 极化子、双极化子理论，发展了导电聚合物的氧化聚合和电化学氧化聚合制备方 法并开展了导电聚合物在化学电源、修饰电极、电致变色显示等方面的应用研究。 导电聚合物的特点是共轭链结构和共轭链的p 型( 或n 型) 掺杂结构，本征态共 轭聚合物属于绝缘体或半导体，掺杂后变为导电态。因此，导电高分子除了具有 高分子本身特性之外，还兼具了因掺杂而带来的半导体或导体的特性。 导电高分子主要有：聚吡咯( p p y ) 、聚苯胺( p a n i ) 、聚噻吩( p t h ) 等。 其中聚吡咯由于其较低的成本、较好的导电性、光电性、热电性、可以方便的沉 积在各种基片上、可与其它功能材料共聚和复合、可在常温或低温下使用等优点 而倍受关注。聚吡咯的应用研究也全面展开。 1 2 2 聚吡咯的结构 斗 n 吡咯单体含氮的五元杂环分子，室温下为无色油状液体，沸点1 2 9 8 ，密 度比水略轻，为0 9 7 0 9 m l 1 ( 2 0 ) ，微溶于水，与大多数有机溶剂可以互溶， 无毒，在空气中易氧化成褐色。在导电聚合物系列中，聚吡咯除了具有导电聚合 物共同的特征以外，还因具有容易制备，所制备的膜电导率高，机械性能好且在 空气中稳定性好等优点，逐渐成为了导电聚合物中研究的重点【9 以们。吡咯单体在 电场或氧化剂( 如：h e 0 2 、1 2 、b r 2 、c 1 2 、f e c l 3 等) 的作用下均可将其氧化成聚 吡咯。聚吡咯中每1 2 个吡咯单元中有1 个单元参加反应。当电位向正方向阶跃 时，吡咯链中的共轭双键、c - n 和n - n 键的吸收峰增强，分子结构式发生醌式 变化。 1 2 3 导电聚吡咯的电化学性质 聚吡咯的p 型( 氧化) 掺杂电位较低，其p 型掺杂态最稳定，而中性态极易 被氧化到p 型掺杂状态。所以，聚吡咯的电化学性质主要是指其p 型掺杂态的还 原( 脱掺杂) 和再氧化( 掺杂) 特性。 聚吡咯的电化学性质与其合成的条件密切相关，如温度、时间、p h 值等均 能影响聚吡咯的结构与性能。y u r t s e v e r 等人【1 1 】对p p y 的结构进行了分析，结果 表明，不同的合成条件下，p p ) r 会形成不同的分支，其能量上的差异使得聚吡咯 具有不同的性能。而作为一种导电的有机材料，电导率则是衡量其性能的一个主 5 h l 1 绪论硕上论文 要指标，并且在许多实际应用中也往往要关注其导电能力。所以如何有效地提高 其导电率正是关键所在。研究表明，掺杂和形成复合膜是提高电导率的重要方法。 采用平面型或部分平面型结构的掺杂离子( 如苯磺酸盐、萘磺酸盐等) ，有利于 提高产物的导电能力及增强其电导率的各向异性。这是因为吸附于电极表面的阴 离子为吡咯的聚合提供了一种有序的“模板”，有助于改善微观结构的有序性。 1 2 4 聚吡咯的电化学制备 聚吡咯的合成方法一般有化学氧化法和电化学聚合法。 ( 1 ) 化学氧化法： 化学氧化法通常得到的是黑色粉末( 一般称为吡咯黑) ，由于吡咯黑不溶、 不熔的特性，使其难以用一般高分子加工方法加工成型，实际应用受到限制。 ( 2 ) 电化学聚合法： 电化学聚合是制备导电聚吡咯的主要方法，通过聚合条件的优化，可以得到 柔韧、光滑、电导率较高的导电聚吡咯膜。吡咯电化学聚合的聚合电位是0 7 v ( v ss c e ) ，因此有机电解液和水溶液都可以用作吡咯电化学聚合的电解液。其 中在水溶液中进行电化学聚合时，溶液p h 值、支持电解质阴离子等对吡咯电化 学聚合过程有重要影响，在电化学合成方法中大部分导电聚合物的合成和掺杂也 是同时完成的。所得到的产品多为聚合物薄膜，而且可以通过改变电极电位、电 流、时间等控制薄膜生成的过程和薄膜的厚度。 与化学氧化法相比，用电化学聚合( e c p ，e l e c t r o c h e m i c a l l yp o l y m e r i z e ) 的 优势在于能改变聚合时间、电位、电量，能控制高聚物膜的厚度；膜的再现性高； 可以合成各种导电性聚合物；改变电极、溶剂、p h 值、支持电解质或电聚合方 式，可得到结构不同、性质不同的功能膜。而用该聚合导电高分子聚合物的方法 制备的生物传感器的优势存在于：方法简单，聚合物聚合和酶的固定可同步完 成并直接固定于电极表面；聚合物膜的厚度和聚合物上修饰物的量易于控制和 调节，可使所制的传感器的重现性得到提高；聚合高分子膜只在电极的有限表 面上生成，因而有利于微电极的固定化；不少高分子膜具有选择性透过某些物 质的功能，可以降低干扰。 6 硕士论文 纳米金聚吡略在d n a 电化学传感器中的应用 2 2 h h - - - - - - - - - - - - - - - - 一1 1 ) - c h 2 h + h o x c h h h h n h h - 2 h + 电寸： 图1 4 吡咯电聚合机理 1 la i j yl jn 吡咯单体电聚合的过程一般公认的历程属于e ( c e ) n ( 见图1 4 ) 。第一步是 7 h i h l h i h i l h l h h l h l l h h i-_l i h l h i h h i h i h l 一 l 绪论硕士论文 吡咯单体被电氧化成离域的自由基阳离子，在口位上有很高的自旋密度。第二步 是单体吡咯自由基通过口位的自由基耦联形成二聚体，然后放出2 个质子，同时 产生中性二聚体，接着二聚体被氧化为二聚体自由基，与其他单体自由基或二聚 体自由基、低聚物自由基反应，使聚合物链增长。关于聚吡咯的的电化学氧化还 原机理的报道较多，但是由于反应的复杂性，至今对机理的认识尚不一致。目前 已经提出的理论还有锂离子嵌入理论【1 2 l 、阴离子嵌入机理及极化子理论【1 3 】等。 吡咯的电化学聚合方法一般分为恒电流和恒电压聚合两种。恒电流聚合时电 流密度一般控制在1 2 m a c m 2 ，而恒电压聚合时电压一般控制在0 6 0 8 v 。当电 极体系不同，掺杂剂不同时其聚合电流或电压也有一定差异。可掺杂的对阴离子 可以是无机、有机阴离子、也可以是聚电解质等大分子。因掺杂阴离子种类的不 同，聚吡咯的电导率也会相差若干个数量级。除此之外，溶剂、温度、电解质等 因素也会对聚吡咯薄膜的形成造成一定影响。 1 2 5 聚吡咯在生物传感器中的应用 图1 5 导电聚合物生物传感器工作原理示意图 作为一种可靠性强、精确度高、消耗量低的新型检测手段，生物传感器的应 用研究得到了广泛的重视，人们对聚吡咯传感器的研究也越来越多。以聚吡咯为 基底制备的多种无机小阴离子传感器，普遍具有响应速度快、线性范围广且制备 容易等优点。聚吡咯高的导电性能有利于保持酶蛋白的生物催化活性，可以通过 聚吡咯膜的氧化还原态之间的相互转化将各种生物酶掺杂进聚吡咯膜中；由于生 物酶是以带负电的粒子形式掺杂于带正电荷的聚吡咯膜中的，因此，酶与聚吡咯 膜的结合是相对稳定而牢固的。基于以上优点，人们已经成功地制备了以聚吡咯 为基底的具有生物催化活性的葡萄糖氧化酶修饰电极【1 4 】、胆固醇氧化酶修饰电极 8 硕士论文纳米金聚吡咯在d n a 电化学传感器中的应用 【1 5 】、过氧化氢酶修饰电极i l6 j 等，此类电极都是基于反应产物为电活性物质的酶 促反应的。对于反应产物为非电活性物质的酶促反应，目前却少有报道。主要是 因为未能发现合适的指示电极。而聚吡咯在d n a 电化学生物传感器中的应用更 是近年来的研究热点，其中将d n a 固载到聚吡咯( p p y ) 膜中制备传感器【1 7 , 1 8 】 的报道更是倍受关注，这些工作均是在p p y 膜的导电状态下进行的。与此同时， 也有尝试将聚吡咯过氧化，变成了一种具有疏松多孔结构的绝缘膜，可以以此为 模版引导d n a 固载。 1 3 贵金属纳米材料 1 3 1 贵金属纳米材料概述 贵金属包括金、银、铂、钯、钌、铑、锇和铱八种元素，是有色金属的重要 组成部分。贵金属在工业上的应用领域很广，遍及电子、化工、医药、机械、能 源、冶金、陶瓷和交通等几乎所有行业，这些行业所使用的贵金属通常都是深加 工产品。在贵金属的深加工产品中，贵金属纳米材料近几年备受人们关注。贵金 属纳米材料是指运用纳米技术开发和生产贵金属制品，得到尺寸在1 0 0 n m 以下 ( 或含有相应尺寸纳米相) 的含有贵金属的新材料。这些新材料在光学、电学、 声学、磁学、催化和力学等性质上与传统的贵金属材料有很大差异。 1 3 2 纳米金的制备 纳米金是指金粒子直径在1 1 0 0 n m 之间的金材料，是最稳定的贵金属纳米粒 子之一。它属于介观粒子，具有特殊的电子结构，在一些特定的晶面上存在着表 面电子态，其费米能级恰好位于体能带结构沿该晶向的禁带之中。因此，处于此 表面态的电子由于功函数的束缚而不能逸出外围，又由于体能态的限制而不能深 入内层，形成了只能平行于表面方向运动的二维电子云。这就是纳米金颗粒所具 有表面效应、量子效应和宏观量子隧道效应等的物理基础。 金纳米粒子的制备方法可分为物理法和化学法。物理法是利用各种技术将块 状固体金分散为金纳米微粒。化学法是以金的化合物为原料，利用还原反应生成 金纳米微粒，在形成金纳米颗粒时控制粒子的生长，使其维持纳米尺度。而物理 法制备金纳米在制备生物电化学传感器方面的应用较少，一般采用化学的方法来 制备金纳米粒子，化学法有以下几种： l 、化学还原法：该法通常是在含a u ( 1 1 1 ) 的溶液中加入还原剂( 如柠檬酸、 鞣酸等) ，金离子被还原而聚集成直径为几纳米到几十纳米不等的金颗粒。在该 法中，柠檬酸三钠是较好的还原剂之一，在还原制备金纳米粒子时如果没有加入 其它稳定剂，柠檬酸三钠及其氧化产物也可以起到保护剂的作用【1 9 , 2 0 。故柠檬酸 9 1 绪论 硕士论文 盐还原法是比较传统的制备纳米金胶的方法。但这种方法制得的金纳米粒子因表 面吸附柠檬酸根而带负电，需通过复杂的表面分子交换或静电组装反转其表面电 荷，限制了金纳米粒子的进一步应用。目前最常用的方法之一是在硫醇类物质( 如 5 苯硫基咔唑、氟化烷醇类等) 作稳定剂，还原 a u c l 4 】。制得金纳米微粒【2 1 。2 4 1 。 另外，在制备纳米粒子时加入合适的保护剂如阴、阳离子聚电解质等，可获得稳 定胶粒，制备阴、阳离子聚电解质包裹的纳米金粒子【2 5 弓o 】。此外，还可用茴香胺、 用紫花苜蓿生物质、聚乙二醇等大分子、n a 2 c 2 0 4 、丝素蛋白质、1 ，3 。苯酮二羧酸、 聚苯胺等作还原剂来制备金纳米粒子1 3 l m j 。 2 、电化学法：电化学法也用于金纳米粒子的制备。如用十六烷基三甲基溴 化铵作分散剂，a g n 0 3 作电解液，将金片和铂片置于电解液中分别作为阳极和 阴极，在4 5 恒温条件下电解5 0 r a i n ，获得粒径约4 0 n m 的球状金颗粒1 3 副。w a n g 等提出了一种基于棒状胶束和阳极电解的方法【3 引，获得长径比可控的棒状金纳 米粒子溶胶。齐航等【3 9 】设计了电解的电极体系，成功地制备出棒状金纳米粒子溶 胶，并报道了合成的初步结果及相关的影响因素和现象。h o l t 等将氯金酸溶解到 稀释的王水溶液中，用掺有硼的金刚石电极进行电化学还原，制备出了金纳米粒 子。 3 、反胶团法或微乳液法：反胶团是指表面活性剂溶解到有机溶剂中，当其 浓度超过临界胶束浓度( c m c ) 后会形成亲水性头朝内、疏水链朝外的液体结 构。用于制备纳米胶团的反胶团一般有四部分组成：表面活性剂( 常见的是a o t ， s d s ，d b s ，c t a b ) 、助表面活性剂( 一般为脂肪醇) 、有机溶剂( 一般为非极 性溶剂) 和水。以反胶团或微乳作为制备纳米颗粒的介质，可以制出1 0 2 0 n m 、 分散均匀的金纳米粒子。适当调整反胶团或微乳的组成和反应物的浓度，可以控 制粒子的大小。如e s u m i t 4 3 1 在2 乙烯基吡啶调聚物的存在下，在水中用n a b i - 1 4 还原h a u c h 制得金纳米粒子。c h i a n g h 4 1 在异辛烷表面活性剂气溶胶和非离子表 面活性剂脱水山梨( 糖) 醇。油酸酯形成的微乳液中用肼还原氯金酸形成稳定的、 各向异性的金纳米粒子。l i n t 4 5 j 等在c t a b 辛烷+ 1 丁醇h 2 0 反向胶束中用n a b i - 1 4 还原h a u c h 制得金纳米粒子。 4 、晶种法：该法是以事先合成的金纳米粒子为晶种，再用还原剂在晶种表 面继续还原氯金酸使粒子生长，通过调节晶种和氯金酸的比例控制产物的粒径。 如n a t 锄【4 0 】以1 2 n m 的胶体金为晶种，加入适量的氯金酸及羟胺，利用金纳米粒 子表面的自催化反应使晶种逐渐长大，控制条件可制得3 0 1 0 0 n m 的金纳米粒子。 n i k h i l l 4 l j 以3 5 n m 的金粒子为晶种制备粒径范围为5 - 4 0 n m 的纳米粒子。z h i m e i q i 【4 2 】先通过h a u c h 和蔗糖的固体混合物经热处理后形成金种，然后让其在室温 下长大。 1 0 硕士论文纳米金聚吡咯在d n a 电化学传感器中的应用 此外还有光化学合成法：利用紫外光照射技术制备金纳米粒子；相转移法： 将制得的无机胶体用表面活性剂处理后，用有机溶剂抽提，制得有机胶体，通过 脱水、脱有机溶剂，制得粒径均匀、分散性好的金纳米粒子 4 3 1 ；微波合成法：将 a u 3 + 、还原剂等混合溶液置于微波反应罐中，拧紧罐盖，混匀，再置于微波炉( 采 用4 8 0 w ) 中辐射几分钟后，取出冷却，便可获得不同粒径的金纳米粒子【删等。 1 3 3 纳米金在生物传感器中的应用 纳米金由于具有容易制备、良好的生物相容性和相对较大的比表面积等特 点。在生物体系中的应用引起了广大研究者的关注。利用其特殊性质构建新型的 生物传感器，在d n a 、免疫、酶、糖等各方面开展了广泛的研究。 在电化学传感器领域，纳米金的引入主要起到如下几种作用： ( 1 ) 加速电子传递速率，增加氧化还原物质在电极表面反应的可逆性 金属纳米粒子一般具有良好的导电性，可以作为电子导线，连接于生物分子 与电极之间。在电化学传感器的研究中，应用较多的主要是一些贵金属纳米粒子， 如金、银、铂、钯等。南京大学的赵微博士【4 5 j 就将1 7 n m 的金纳米粒子引入多层 组装复合膜，构建葡萄糖生物传感器。在多层膜中，金纳米粒子连接于g o x 与 电极之间，起到电子导线的作用，大大加快了膜的电子传递速率。除了作为电子 导线，金属纳米粒子还具有提高电化学敏感膜中电活性物质的电子转移速率和氧 化还原可逆性的功能。p a n d e y 研究组1 4 6 将钯纳米粒子、g o x 和二茂铁共同固定 到电极表面，制备了葡萄糖电化学传感器。在钯纳米粒子的作用下，二茂铁的氧 化还原可逆性增强，氧化还原电位差变小，实现了葡萄糖的选择性检测。 ( 2 ) 催化反应 由于纳米金属粒子大的比表面积，故金属纳米粒子有很好的催化活性。基于 金属纳米粒子制作的生物传感器的报道也很多，其中以金纳米颗粒研究最广。董 绍俊等【4 7 】人在金纳米颗粒的三维薄膜修饰电极上构建了第三代辣根过氧化酶传 感器，能很好的催化h 2 0 2 的还原，该电极响应快、灵敏度高、重现性和稳定性 好。 ( 3 ) 生物分子的固定 纳米金粒子在水中形成的分散系俗称胶体金。金颗粒可与氨基发生非共价的 静电吸附而牢固结合，与巯基之间形成很强的a u s 共价键，这使得胶体金可与 生物活性组分结合，如d n a 分子，形成的探针可用于生物体系的检测中。纳米 金引入电极表面后，增加了电极表面有效面积，又由于纳米颗粒本身特殊的性质， 如大的比表面积、尺寸量子效应和化学反应活性等，不仅可以提高电极的灵敏度， 还可以显著提高对d n a 分子的固载量。如k u ij i a 0 1 4 8 】等就用恒电位法将金纳米 粒子修饰到已有导电聚苯胺基底的玻碳电极表面，使得带有巯基的d n a 分子通 1 绪论硕士论文 过a u s 共价键自组装在纳米金修饰玻碳电极上，其自组装时间只需两小时，并 成功地构建了d n a 生物传感器，通过电化学阻抗法测试其检测下线能达到 3 1 x 1 0 。3 m o l l 。此外，金纳米粒子在固定生物酶方面具有独特的优点，如大的 比表面、能够保持酶的活性、加快酶的活性中心与电极之间的电子传递速率等， 一些蛋白质，如氧化酶【4 9 】也曾经依靠金纳米粒子固定到电极表面。研究表明，酶 等生物分子可以通过n h 2 及s h 等基团与金纳米粒子的相互作用而固定到金纳 米粒子上 5 0 , 5 1 j 。而且，由于金纳米粒子具有生物相容性，固定的生物分子能够较 好地保持生物活性。 ( 4 ) 标记生物分子 采用纳米材料作为生物分析的标记物质，可显著提高现有分析方法的灵敏 度。用于生物分析的纳米粒子标记物主要有金属纳米粒子和半导体纳米粒子。其 中以金纳米的为例，被其标记的生物分子能够保持活性并选择性地对应物质结 合，然后通过对金纳米粒子的分析，即可得到待测物信息。金纳米粒子修饰的 d n a 探针还被应用于d n a 阵列检测。基于金纳米颗粒标记d n a 探针用于电化 学检测d n a 还有很多报道。如c a i 等【5 2 】将已知序列的单链寡聚核苷酸( s s d n a ) 固载在电极表面，使用纳米金标记的互补d n a 与之杂交。然后，在纳米金表面 在位沉积银，在酸性条件下银溶出，通过电化学方法检测银，从而达到间接检测 d n a 的目的。 1 4 本论文主要研究目的和意义 综上所述，纳米材料的表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观隧道效应， 使其在电学、磁学、光学和化学性质方面呈现出常规材料不具备的优越性能。其 大比表面积、高活性特异性、极微小性等与传感器所要求的多功能化、微型化、 高速化相对应。因此，纳米材料是传感器方面最有应用前途的材料。利用它可以 研制出响应速度快、灵敏度高、选择性好的各种不同用途的传感器。 根据纳米导电聚吡咯和功能纳米金的研究现状可以发现，将纳米导电聚吡咯 和功能纳米金同时用在d n a 电化学生物传感器中的工作鲜有报道，因此本论文 的研究思路是将这两种功能纳米材料同时用在d n a 电化学生物传感器中，借助 两组分之间的协同作用来达到提高传感器性能的目的。通过控制实验参数进而控 制聚吡咯的微结构及电化学性能，再将纳米聚吡咯薄膜层修饰上纳米金颗粒，使 得带巯基的d n a 分子通过a u - s 键共价结合，从而构建基于纳米聚吡咯与纳米 金复合的d n a 电化学生物传感器。 1 2 硕士论文 纳米金聚吡咯在d n a 电化学传感器中的应用 1 5 本论文主要研究内容 本论文的主要工作分为三部分： 第一部分研究了运用恒电位法合成纳米聚吡咯膜，并通过优化电化学参数的 设置来控制导电聚吡咯膜，另外，通过循环伏安和恒电位两种不同的电化学方法 在i t o p p y 修饰电极表面电化学合成纳米金颗粒，并讨论其电化学性能。通过扫 描电子显微镜( s e m ) 和原子力显微镜( a f m ) 研究了这两种修饰电极的微观 结构及形貌。通过循环伏安法( c v ) 和差分脉冲伏安法( d p v ) 研究了测试溶 液的离子强度，p h 值及c v 扫速对其电化学行为的影响。 第二部分探讨了基于 f e ( c n ) 6 】3 摊体系下单链d n a 探针的构建，通过自组装 的方法确定了其最佳自组装时间和浓度，利用多种电化学测试手段确定了单链 d n a 探针电极在 f e ( c n ) 6 】3 w 。体系中的最佳检测条件，并分析了单链d n a 修饰 电极表面的动力学参数。 第三部分研究t 基于 f c ( c n ) 6 】3 柞体系下d n a 电化学传感器的构建，讨论了 d n a 的最佳杂交时间，分析了双链d n a 修饰电极表面的动力学参数，通过比较 单、双链d n a 修饰电极的动力学参数，从而研究指示剂在各修饰电极表面的作 用机理。此外，通过差分脉冲伏安法计算出该传感器的检测下线，并研究了该传 感器的再生性及稳定性。 1 3 2 纳米金聚吡咯复合膜电极的电化学制备及表征硕士论文 2 纳米金聚吡咯复合膜电极的电化学制备及表征 2 1 引言 在诸多的导电聚合物中，由于掺杂态的聚吡咯( p p y ) 具有相对较高的电导 率、良好的环境稳定性以及易于采用化学或电化学法合成等特点，被认为是最有 商业前景的导电高分子材料之一，引起了人们的广泛关注。而关于d n a 与导电 高分子及功能化纳米粒子相互作用的研究工作已有相关报道，其中将d n a 固载 到聚吡咯( p p y ) 膜中从而制备传感器更是近年来的研究热点【5 3 1 ，这些工作均是 在p p y 膜的导电状态下进行的。 纳米微粒最具有前途的应用领域之- n 是传感器领域。纳米微粒的特点，如 大比表面积、高活性特异性、极微小性等与传感器所要求的多功能化、微型化、 高速化相对应，尤其是金纳米颗粒己经被应用到生物体系的分析检测中，已成为 了目前科学家研究的热点。 本章运用了恒电位法来合成导电纳米聚吡咯膜，并通过优化电化学参数的设 置来控制其导电性能。在此基础上，通过循环伏安和恒电位两种不同的电化学方 法在i t o p p y 修饰电极表面制备了纳米金颗粒，并讨论其电化学性能。通过s e m 和a f m 研究了这两种修饰电极的微观结构和形貌。通过循环伏安法( c v ) 、差 分脉冲伏安法( d p v ) 研究了测试溶液的离子强度，p h 值及c v 扫速对修饰电 极电化学性能的影响。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器 c h l 6 6 0 b 型电化学工作站( 上海辰华仪器公司) ，k q 2 5 0 b 型超声波清洗器 ( 4 0 k h z ，昆山市超声仪器有限公司) 、s g 2 型p h 计( m e t t l e rt o l e d o ) 、原子力 显微镜( a f m ，s p l 3 8 0 0 n ，日本精工) 、扫描电子显微镜( s e m ，j e o l j s m 6 3 8 0 l v ) 。实验用水均为m i l l i q 纯水系统制备。 2 2 2 试剂 1 4 乙醇 氢氧化钠 吡咯 氯金酸 分析纯 分析纯 化学纯 分析纯 南京化学试剂有限公司 南京化学试剂有限公司 上海科丰化学试剂有限公司 上海试剂一厂 硕士论文纳米金聚吡咯在d n a 电化学传感器中的应用 硝酸钾 铁氰化钾 亚铁氰化钾 氯化钾 h e p e s 2 2 3 溶液的配制 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 上海久亿化学试剂有限公司 广东汕头市西陇化工厂 上海凌峰化学试剂公司 南京化学试剂厂 上海q c b i o 科技有限公司 溶液1 ：0 1 m o l l d p p y + 0 1 m o l l 以k c i 溶液2 - 3 0 m m o l l h a u c h + 0 1m o l ld k n 0 3 测试溶液：l m m o l l 1 铁氰化钾亚铁氰化钾( 1 ：1 ) + 不同浓度k c i 所需各浓度i 约 f e ( c n ) 6 】3 棒测试溶液是由l