（应用化学专业论文）蜂花粉抗氧化性研究.pdf

摘要 近2 0 年来，活性氧和自由基研究成为现代生命科学的前沿和 热点，评价和筛选具有强抗氧化活性的天然产物己成为生物学、医 学和食品科学研究的新趋势。蜂花粉作为重要的人类资源，因其富 集有黄酮类化合物，是开发天然抗氧化剂的重要来源。本文采用正 交实验法优化出蜂花粉黄酮的提取工艺条件。针对蜂花粉提取物， 主要采用化学体系产生三种自由基和脂质过氧化体系，研究其清除 自由基和抑制脂质过氧化的能力。利用大孔树脂纯化蜂花粉提取 物，提高黄酮的纯度，探讨蜂花粉提取物的黄酮纯度对抗氧化性的 影响，主要结果如下： 1 通过正交实验优化出蜂花粉黄酮的最佳工艺提取条件为： 以油菜蜂花粉为材料，以6 0 醇为溶剂，超声功率1 7 5 w ，提取 时间1 5 m i n ，提取温度5 0 。 2 5 种蜂花粉提取物有较强的清除超氧阴离予自由基、羟基自 由基、d p p h 自由基和抑制脂质过氧化的能力。其中，荞麦蜂花粉 提取物清除超氧阴离子自由基能力最强；茶叶蜂花粉提取物清除羟 基自由基能力最强；油菜蜂花粉提取物清除d p p h 自由基和抑制 脂质过氧化的能力最强。 3 将蜂花粉抗氧化提取物分为甲醇部、乙醇部和水部溶剂萃 取物，经抗氧化活性比较，3 个部分均表现出较强的体外抗氧化作 用，其强弱顺序为甲醇部 乙醇部 水部。 4 通过静态和动态吸附性能比较，筛选出对蜂花粉黄酮类化 合物选择性最好的大孔吸附树脂为a b - 8 。经a b 8 吸附纯化后， 蜂花粉提取物清除自由基能力有很大的提高。 关键词：蜂花粉，黄酮类化合物，自由基，抗氧化作用， 大孔吸附树脂 a b s t r a c t i nt h el a s t2 0y e a r s a c t i v eo x y g e na n df r e er a d i c a lh a v eb e c o m e t h eh o tt o p i c so fm o d e ml i f es c i e n c ea n da p p r a i s a la n ds e l e c t i o no f n a t u r a lr e s o u r c e sw i t hs t r o n ga n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e sh a v eb e c o m et h e n e wt r e n d so fb i o l o g y ，m e d i c a ls c i e n c ea n df o o ds c i e n c ea n d t e c h n o l o g y a sa ni m p o r t a n tr e s o u r c ef o rh u m a nb e i n g s ，b e ep o l l e ni s a ni m p o r t a n ts o u r c ef o rt h ed e v e l o p m e n to fn a t u r a la n t i o x i d a n t sd u et o i t sr i c hn a t u r a lf l a v o n e s t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e d e t e r m i n e db yo r t h o g o n a lt e s t t h ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e se f f e c t si n v i t r oo fb e ep o l l e ne x t r a c t sw a ss t u d i e db yu s i n gt h et h r e ek i n d so ff r e e r a d i c a l sa n d l i p i dp e r o x i d a n t i o n t h a tw e r ep r o d u c e db yc h e m i c a l m e t h o d s t h ef l a v o n e so fb e ep o l l e nw e r ep u r i f i e db yu s i n gk i n d so f r e s i na n dt h er e l a t i o no fp u r i f i c a t i o na n dt h ei m p a c to fa n t i o x i d a t i v e a c t i v i t i e sw a s a p p r a i s e d t o p u r i f i c a t i o n o ft h eb e e p o l l e n f l a v o n i o d t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s 1 。t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n sd e t e r m i n e db yo r t h o g o n a lt e s t w e r e ：m a t e r i a l ：b e ep o l l e n ；s o l v e n t ：6 0 e t h a n o l ；t e m p e r a t u r e ：5 0 c ； a n de x t r a c t i o nt i m e ：1 5 r a i n 2 t h ee t h a n o le x t r a c t so ff i v ek i n d so fb e ep o l l e ns h o w e ds t r o n g e r s c a v e n g i n g e f f e c t so n h y d r o x y l f l e er a d i c a la n d 1 , 1 一d i p h e n y l - 2 - p i c r y l h y r a z y l f r e er a d i c a la n d r e s t r a i n i n g l i p i d p e r o x i d a n t i o n t h eb e ep o l l e no fb u c k w h e a te x t r a c t ss h o w e ds t r o n g s c a v e n g i n ge f f e c t so nt h e a n t i o x i d a t i o no fs u p e r o x i d i z e da n i o n i ca n d t h eb e ep o l l e no ft e as h o w e ds t r o n gi n h i b i t o r ye f f e c to nt h eh y d r o x y l r a d i c a la n dt h eb e ep o l l e no fr a p ee x t r a c t ss h o w e ds t r o n gi n h i b i t o r y e f f e c to nt h el i p i dp e r o x i d a n t i o n 3 ：a 】le x t r a c t i o n so b t a i n e db yu s i n gd i f f e r e n to fs o l v e n t s ，s u c ha s w a t e r , a l c o h o l ，m e t h a n o lh a v et h ep o w e rt os c a v e n g eo nf r e er a d i c a l s ， w i t ht h eo r d e ro fm e t h a n o l ，a l c o h o l ，w a t e r 4 ：b yc o m p a r i n gs t a t i ca n dd y n a m i ca b s o r p t i o np e r f o r m a n c e ，w ef o u n d t h a tm a c r o p o r ea d s o r p t i v er e s i na b - 8h a dh i g h e s tp e r f o r m a n c ei n a b s o r b i n gf l a v o n e s a f t e ra b s o r p t i o na n dp u r i f i c a t i o nb ya b 一8 ，t h e e x t r a c t i o no fb e ep o l l e nh a v eg r e a ti m p r o v e m e n to fp o w e rs c a v e n g i n g o nf r e er a d i c a l s l i t i a n ( a p p l i e dc h e m i s t r y ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rc a ow e i k e y w o r d s ：b e ep o l l e n ，f l a v o n e s ，f r e er a d i c a l s ，a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e s m a c r o p o r ea d s o r p t i v er e s i n 主要英文缩略语 t a ct o t a la n t i o x i d a n t i cc a p a c i t y总抗氧化能力 s f r c s c a v e n g i n gf r e er a d i c a lc a p a c i t y清除自由基能力 t g t c t r i g l y c e r i d e t o t a lc h o l e s t e r o l 甘油三脂 总胆固醇 l d l cl o w d e n s i t yl i p o p r o t e i nc h o l e s t e r o l 低密度脂蛋白胆固醇 h d l - c h i g hd e n s i t yl i p o p r o t e i nc h o l e s t e r o l 高密度脂蛋白胆固醇 a i a t h e r o s c l e r o s i si n d e x动脉硬化系数 s o d s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 超氧化物歧化酶 g s h p xg l u t a t i o n ep e r o x i d a s e谷胱甘肽过氧化物酶 m d a m a l o n y l d i a l h y d e 丙二醛 o x l d lo x i d i z e d l o wd e n s i t y l i p o p r o t e i n氧化低密度脂蛋白 l d ll o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n低密度脂蛋白 d p p h 1 , 1 d i p h e n y l - 2 - p i c r y l h y d r a z y l 二苯代苦味肼基 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课 题再撰写的文章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：指导教师签名： 年月日年月 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进 行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特 别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 年月 日 第一章文献综述 心血管疾病，尤其是冠心病，日益严重地威胁着人类的健康，在美国、欧 洲和许多亚洲国家( 包括中国) 已成为居民死亡的主要原因【1 一。虽然现在可采取 多种医疗手段，但人们仍没有找到有效的治疗药物来控制这些疾病，只能以预 防为主。由于预防药物必须长期使用于健康的高危人群，故而要求其无大的副 作用。现代医学证明，占当前医学研究领域前三位的肿瘤、冠心病和衰老均与 自由基引起的膜脂质氧化性损伤有关阿】。同时研究也表明，天然抗氧化剂可 消除由人体产生的内源性活性氧自由基，阻断自由基对人体生物大分子如 d n a 和低密度脂蛋白旺d l l 的损伤和氧化，减少癌及心血管疾病的发病【5 1 。因 此，从食源性物种筛选天然、高效的抗氧化物质，并用于上述疾病的预防将具 有重要的意义。 1 1 自由基对生物大分子的损伤及其与疾病的关系 1 1 1 生物体内的自由基及其产生机制 自由基( f r e er a d i c a l ，f r ) 是指独立带有不配对电子( 即奇数电子) 的原予、 分子、离子或化学基团，因含有一个未成对电子而具有顺磁性和很高的反应活 性【】。生物体内常见的自由基是超氧阴离子自由基( 0 2 一) ，即自由基态氧接受 电子后形成的。此外还有分子氧( 0 2 ) 、一单线态氧( 1 0 2 ) 、过氧化氢( h 2 0 9 、羟 自由基r o h ) 和脂过氧化物( r 、r o 、r 0 0 、r o o h ) 1 0 埘】。其中，超氧阴离 子自由基形成最早，羟自由基( 0 h ) 作用最强，r o o h 链锁反应循环最持久 6 - 1 1 l 。 生物体内自由基的产生机制在于，生物体内具有共价键的有机分子发生均 裂后使带有成对电子的原子、原子团、分子转变为带有奇数电子的自由基，或 带有成对电子的化合物，多获得一个电子后，也转变为带有奇数电子的自由基。 生物体内自由基生成反应的一大特点是它们往往以链式反应进行2 4 3 1 。 生物体内自由基来源虽与紫外线、电离辐射和环境污染等因素有关，但其 主要来源于细胞的生化反应。很多细胞酶、电子转移过程和细胞成分的自氧化 都可以产生氧自由基，活化的巨噬细胞可以释放氧自由基。 6 , 1 4 q 9 1 1 2 氧自由基的检测方法 自由基的性质一般很活泼，绝大多数的自由基不稳定，存在时间很短， 很容易与其它物质反应生成新的自由基或两个自由基结合成分子而碎灭，因 此，它们的浓度极低f 1 0 4 1 0 。9 m o u l ) ；准以测定。但因自由基含有一个未成对电 子，具有顺磁性和很高的反应活性，故基于自由基这两个特性而建立和发展了 自由基的检测方法。目前，氧自由基的检测方法主要有电子自旋共振光谱法 2 0 , 2 1 1 、高效液相色谱法【2 2 】、化学发光法【2 3 甜】和比色法 2 6 以8 】等。 1 1 3 自由基对生物大分子的损伤 在正常生理情况下，自由基在体内不断生成，又不断地被清除，维持着动 态平衡，少量自由基的生成是机体维持正常新陈代谢所必需的。但是，过量的 自由基会引起广泛的损伤效应。自由基可引起蛋白质、核酸、脂类等生物大分 子结构与功能的改变，从而导致许多临床疾病的发生【6 , 2 9 - 3 2 】。自由基对生物大 分子的损伤主要表现如下： 对蛋白质分子的损伤【3 3 枷】：自由基对蛋白质的主要作用是修饰氨基酸残 基，引起结构和构象的改变，造成肽链断裂、聚合、交联等损伤。o h 是化学 性质最活泼的活性氧，几乎能与所有氨基酸反应，尤其是含不饱和键或疏基的 氨基酸更容易受自由基攻击，使蛋白质的氨基酸链断裂；。o h 也可直接攻击肤 链中的a 一碳原子，生成n c 过氧化自由基，进而转化为亚氨基肽，导致肽链 易于断裂。许多酶和受体分子上的活性基团疏基易受氧自由基氧化成二硫键， 使蛋白质分子内或分子间发生交联，蛋白质结构的改变进而引起酶和受体等的 生物学活性改变、功能破坏。 对d n a 的损伤【4 2 瑚】：自由基可引起细胞内d n a 的氢键断裂、碱基降解 和主链解旋，所有核酸成分均可受到自由基的攻击。因此，当细胞d n a 受损 时，轻者可引起细胞的生物学活性改变，重者造成基因突变、致癌和细胞死亡。 结构研究表明，d n a 上结合的金属离子( 如f e 2 + 和c u 2 + ) 与h 2 0 2 发生f e n t o n 反 应产生的。o h 是造成链断裂的主要原因。自由基攻击脱氧核糖时也能引起链断 裂，d n a 修复系统虽然可修复这类损伤，但修复过的d n a 突变率却远远大于 正常的突变。 对脂类的损伤【6 ，5 4 j 5 】自由基对不饱和共价键具有一种特殊的亲和力，因此， 在机体内，自由基最容易攻击生物膜磷脂中的多不饱和脂肪酸( p u e a ) ，从而 引起膜脂质过氧化反应。丙二醛( m d a ) 是脂质过氧化的终产物，它可与蛋白质、 磷脂酸乙醇胺及核酸等形成s c h i f f 碱，而使生物大分子之间发生反应，进而导 致其结构和功能受到损伤，使正常不能透过膜的物质f 如c a 2 + ) 的通透量增加， 酶活性发生改变，膜上受体失活，导致细胞代谢、功能和结构发生改变。 1 1 4 外源性抗氧化剂对生物大分子自由基损伤的防护 研究己表明，虽然机体内有一套清除自由基的酶系f 超氧化物歧化酶s o d 和谷肌甘肽过氧化物酶g s h p x ) ，生理条件下体内自由基处于低浓度动态平 衡，但因某种因素使得自由基产生过多或清除自由基能力下降时，适当补充外 源性抗氧化剂或给予能使机体内源性自由基清除剂恢复到一定水平的药物，可 有效改善与自由基过多有关的疾病1 s 6 - 5 9 1 。 外源性抗氧化剂主要包括天然产物类f 酚羟基化合物、木脂素类、皂类化 合物和生物碱) 、维生素类( 维生素e 、维生素c 和且一胡萝b 素) 、合成抗氧化 剂( b u t 和a l i a ) 、铁螫合剂以及微量元素( 硒、锰、锌) 等。这些外源性抗氧化 剂防护的一般原则为：( 1 ) 减少局部氧气浓度：( 2 ) 清除启动脂质过氧化的引 发剂：( 3 ) 结合金属离子，使其不能产生启动脂质过氧化的羟基自由基或使其 不能分解脂质过氧化产生的脂过氧化氢；( 4 ) 将脂质过氧化物分解为非自由基 产物；( 5 ) 阻断脂质过氧化的反应链，即清除脂质过氧化中间自由基，如脂质 自由基、脂氧自由基和脂过氧自由基f 5 6 州】。 1 1 5 自由基与心血管疾病的关系 随着人们生活水平提高和生活方式的改变，心m 管疾病，尤其是高脂血症 3 和动脉粥样硬化所致的冠心病，日益严重威胁着人类的健康，在美国、欧洲和 许多亚洲国家( 包括中国) ，它已成为居民死亡的主要原因【7 4 , 7 5 。 引起动脉粥样硬化、心血管疾病的危险因素相当广泛，其中，高血脂、高 血压、糖尿病、低水平的高密度脂蛋白胆固醇( h i e , hd c n s r yl i p o p r o t e i n c h o l e s t e r o l ，h d l - c ) 、高水平的低密度脂蛋白胆固醇0 0 wd e n s i t yl i p o p r o t e i n c h o f e s t e r o l ，l d l - c ) 等是主要诱因。大量研究显示，氧化应激的增强在动脉粥 样硬化的起始阶段起着关键性作用，自由基和脂质过氧化是其主要原因。自由 基、脂质过氧化物对于血管壁细胞具有毒性作用。实验动物和患者的血液中自 由基水平以及脂质过氧化物浓度增加，某些血液成分容易被自由基、脂质过氧 化物攻击和修饰，而修饰后这些成分的致动脉粥样硬化作用更强，另外，在患 者和动物的血液、病灶处也可检测到这些被修饰后的成分，证实自由基、脂质 过氧化物是致动脉粥样硬化的更可能途径1 7 6 埘i 。 自由基、脂质过氧化造成损伤时重要的靶细胞是内皮细胞。动物实验表明 氧自由基可以与内皮细胞胞膜的p u f a 反应生成l p o ，其后果是：( 1 ) 脂质自 由基或者l p o 可以与邻近的p u f a 分子发生连锁反应，从而改变细胞膜不饱 和脂肪酸与磷脂的比例，降低其流动性；( 2 ) 脂质自由基或l p o 也可以通过 引起膜蛋白与磷脂之间的交联而破坏膜蛋白功能；( 3 ) 氧自由基可以直接与膜 内的琉基基团结合导致多种酶类的失活，尤其是维持离子乎衡的葡萄糖。6 磷酸 脱氢酶和n a + k + a t p 酶的失活，增加胞膜对离子的通透性，导致内皮细胞肿 胀甚至死亡【9 1 哪! 。 自由基、脂质过氧化除了可以直接导致内皮细胞的损伤之外，也可以通过 对l d l 和h d l 等进行氧化修饰或其他诸如m d a 等方式的修饰而增加它们的 致动脉粥样硬化作用。其中，关于l d l 被氧化修饰后形成。o x l d l 在动脉 粥样硬化发病中的作用主要表现为：( 1 ) 巨噬细胞通过清道夫受体大量摄取 o x l d l ，形成泡沫细胞，产生脂质条纹；( 2 ) o x l d l 可以释放对单核细胞 和t 淋巴细胞具有趋化作用的趋化因子；( 3 ) o x l d l 具有抑制巨噬细胞游走、 脱离动脉壁的功能；( 4 ) 细胞毒作用，如导致内皮细胞的凋亡、促进平滑肌缨 胞的增生等；等等 9 5 - - 9 9 】。 4 1 2 天然抗氧化剂一黄酮类化合物 黄酮类化合物在植物界分布很广泛，目前发现的已达5 0 0 0 余种，在植物 的叶子和果实中少部分以游离形成存在，大部分与糖结合成苷类的形式存在， 游离形式则为苷元。黄酮类化合物具有多种生物活性，如抗氧化、抗菌抗病毒、 抗癌症、抗衰老、抑制高血压、高血脂及预防心血管疾病等作用，因此，对黄 酮化合物的研究与利用越来越受到人们的重视，其在食品、医药、保健品和化 妆品等领域的应用具有广阔的前景。 1 2 1 黄酮类化合物的主要结构、种类【1 0 0 以0 3 】 表1 - 1 黄酮类化合物的主要结构 类型名称基本结构类型名称基本结构 黄酮 二氢黄酮 异黄酮 黄烷一3 ，4 二醇 查耳酮 花青素 双苯吡喃酮 黄酮醇 二氢黄酮醇 二氢异黄酮 二氢查而酮 黄3 醇 橙酮 哎p 吣 噶b n 8 f o 了“0 f 5 妒妒o碥 黄酮类化合物泛指两个苯环( a - 环与b - 环) 通过中央三碳链相互联接而成 的一系列c 6 c 3 c 6 化合物，主要指以2 苯基色原酮为母核的化合物，其基本结 构为： 2 苯基色原酮 根据中央三碳链的氧化程度、b 环联接位置( 2 - 或3 ) 以及三碳链是否构成环状 等特点，可将重要的天然黄酮类化台物分类如表1 - 1 所示。 1 2 2 黄酮类化合物的性质1 0 0 ，1 0 2 ，1 叫 1 2 2 1 性状 黄酮类化合物多为晶性固体，少数( 如黄酮苷类) 为无定型粉末。游离的苷 元中，除了二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇有旋光性外，其余则无；苷 类由于在结构中引入糖分子，故具有旋光性，且多位左旋。 1 2 2 2 溶解度 黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态( 苷或苷元、单糖苷、双糖苷或 三糖苷1 不同而有很大的差异。 一般游离昔元难溶于或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酷、乙醚等 有机溶剂及稀碱液中。其中黄酮、黄酮醇等具有平面结构的分子，分子间距离 比较小，使分子间的引力较大，使水分子难以进入，微溶于水；而异黄酮、二 氢黄酮f 醇1 因其结构的非平面的关系，而较易溶于水，其溶解度稍大。黄酮类 化合物成苷后，在水中溶解度增加，在有机溶剂中溶解度相应减少，黄酮苷类 一般溶于水、甲醇、乙醇等极性强的溶剂中，难溶于或不溶于石油醚、氯仿等 低极性有机溶剂中。 1 2 2 3 酸碱性 黄酮类化合物因分子中含有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、 甲酰胺及二甲酰胺中。由于酚经基数目及位置不同，酸性强弱也不同，以黄酮 为例，其酚羟基酸性强弱顺序依次为：7 , 4 一o h 7 o h 或4 - o h - - 般酚羟基 0 h 5 o h 。 1 2 2 4 黄酮类化合物的生物活性 黄酮类化合物具有多种生物活性功能，其在抗氧化、抗衰老、抑菌抗病毒、 抗癌症、抗肿瘤、护肝、抑制高血压、高血脂、调节内分泌系统、增强机体免 疫力、预防心血管疾病及止痛镇痛等多方面具有良好的作用【1 0 5 1 嘶1 ，下面重点 阐述黄酮类化合物在抗氧化、抗肿瘤和预防心血管疾病等方面的作用。 1 2 2 4 1 抗氧化和清除自由基作用 黄酮类化合物在油脂中的抗氧化活性的研究已有不少报道，芦丁和槲皮素 是较早用来作为食品抗氧化剂的黄酮类化合物。张鞍灵等【1 0 7 】在研究沙棘黄酮 的抗氧化作用过程中，比较了槲皮素、b h t 、银杏黄酮和沙棘黄酮在沙棘油中 的抗氧化能力，发现4 种抗氧化剂都能明显的延缓沙棘油的自动氧化过程，其 抗氧化顺序为槲皮素 b h t 银杏黄酮 沙棘黄酮。 人体内自由基是引起癌症、衰老、心血管疾病等疾病的罪恶之源。黄酮类 化合物种类繁多，并不是所有的黄酮类化合物都具有相同的清除自由基的功 效，而是和每种化合物的具体结构有关。目前普遍认为，黄酮类化合物分子中 心的a 、b 不饱和吡喃酮是其具有各种生物活性的关键，7 o h 糖苷化和2 、3 位双键氢化均易引起黄酮类化合物生物活性的降低，而a 、b 、c 三环上的各 种取代基则决定了其特定的生理功能。胡割1 吣1 叫等提出有效的酚羟基理论， 认为，b 环上的3 ，4 - 邻二羟基对清除自由基和机体中的脂质过氧化物起决定 作用，而在抑制油脂自动氧化中，3 o h 、5 o h 、4 - 羰基和2 、3 位的双键则起 主导作用，因此，就清除超氧阴离子自由基的能力来说，芦丁 槲皮素 桑色素 橙皮苷，而就抑制油脂氧化的能力来说，槲皮素 桑色素) 芦丁、橙皮苷。由 7 此可见，应用黄酮类化合物时应视其结构、来源以及使用目的进行选择，而不 可一概而论。 黄酮类化合物清除自由基和抗氧化的能力，其作用机理在于它阻止了自由 基在体内产生的3 个阶段：即与0 2 反应阻止自由基引发；与金属离子鳌和阻 止o h 生成；与脂质过氧自由基( r o o 1 反应阻止脂质过氧化过程。 1 2 2 4 2 抗肿瘤作用 近年来有关黄酮类化合物抗肿瘤作用研究报道较多，其中槲皮素研究引人 关注。槲皮素( q u ) 能通过抑制促进肿瘤细胞生长的蛋白质活性而抑制肿瘤的生 长【1 1 0 】；q u 与高温联合应用可显著抑制白血病细胞的生长，诱导肿瘤细胞的凋 亡，其机理可能与影响蛋白激酶c ，c a m p 信息传递有关【l l l 】。金雀异黄素【儿2 】 可抑制动物肿瘤生长，对人体皮肤癌、乳腺癌生长也有抑制，其机制可能与提 高机体免疫能力、抗氧化和抑制血管增生有关，美国已将金雀异黄素作为抗癌 治疗药物列入临床研究发展计划。 黄酮类化合物能抑制化学致癌的毒性【1 0 5 】。如山奈素、芦丁和槲皮素可抑 制黄曲霉毒素b l 的致癌性；饲喂含5 槲皮素的饲料可使d m b a s f 7 ，1 2 二甲 苯葸) 诱发小鼠乳腺癌的机率降低4 8 ；槲皮素还可抑制偶氮甲醇诱发的大鼠 直肠癌等等。关于黄酮类化合物抑制化学致癌的毒性的机理，w a t t e n b e r g 认为， 它起到一种“阻断剂”的作用。因为所有化学致癌物进入人体内后，要在体内一 种依赖于细胞色素p 4 5 0 的酶的作用下活化为可以与d n a 反应或结合的中间物 才有致癌活性。黄酮类化合物作为“阻断剂”，可抑制该酶的活性，阻止化学致 癌物活化为有致癌活性的中间物，或者诱导某些酶的活性，使致癌物脱毒，也 可能与那些有致癌活性的中间体结合从而避免它们与d n a 结合或反应。 自由基和癌的关系密切，癌的发生和发展可分为：致癌的启动、促癌和癌 的形成和发展三个阶段，在每个阶段都有氧自由基的产生和参与，尤其在促癌 阶段，产生大量的活性氧自由基，能引起细胞d n a 、r n a 及蛋白质等生物大 分子的氧化应激损伤，导致细胞突变和癌变发生。 综合可知，黄酮类化合物主要通过清除自由基作用、直接抑制癌细胞生长、 抗致癌因子等途径而达到抗癌、防癌的作用。 1 2 2 4 3 预防心血管疾病作用 目前认为，低密度脂蛋白( l d l ) 的氧化修饰是动脉粥样硬化似s ) 发生发展 的主要原因之一，脂质过氧化是l d l 氧化修饰的主要因素。黄酮类化合物对 动脉粥样硬化预防和治疗作用主要是基于对l d l 氧化的防止。研究表明，非 瑟素、桑色素、槲皮素、棉皮素可在1 - 2 岸m o l l5 0 抑制体外巨噬细胞导致的 l d l 氧化 i 0 5 。v i s o n 等比较了黄酮化合物与几种天然及合成抗氧化剂对l d l 体外氧化的抗氧化特性，发现具有较强的抑l d l 体外氧化的黄酮类化合物大 都b 环上有邻二羟基结构，表明这些化合物清除自由基的作用，也许是构成了 它们抵抗l d l 氧化的重要原因。黄酮类化合物体外抑制l d l 氧化可能是由于 清除了巨噬细胞中产生的自由基，也可能是由于保护l d l 中固有的a 一生育酚 或者使氧化了的生育酚再生，从而间接抑制了l d l 的氧化。 此外，黄酮类化合物在扩冠和抗心律失常等方面具有明显的作用。如芦丁、 槲皮素、葛根素和三七黄酮等均有明显的扩冠作用，并已用于临床1 1 1 引。沙棘 总黄酮、苦参总黄酮、甘草黄酮和葛根素都具有类似抗心律失常作用【n t l l5 1 。 1 3 花粉研究 1 3 1 花粉主要化学成分与营养价值 花粉是有花植物雄蕊中的雄性生殖细胞。它不仅携带着生命的遗传信息， 而且包含着孕育新生命所必需的全部营养物质，是植物传宗接代的根本，热能 的源泉，同时花粉也是一种纯天然的绿色资源，含有蛋白质、氨基酸、糖类、 脂类、维生素、酶类、核酸、矿质元素、生长素、黄酮类、胡萝b 素等多种营 养成分，归纳起来由以下9 大类成分组成。 ( 1 ) 蛋白质、氨基酸类 花粉中含有相当丰富的蛋白质和多种游离氨基酸，总含量约占花粉干重的 8 一柏。在自然界中有2 2 种游离氨基酸，而花粉中就有2 0 种之多，而且 人体必需的8 种氨基酸在花粉中至少含有7 种。由此可见花粉在某种意义上说 可谓是氨基酸的浓缩物，而蛋白质是生命的物质基础，是人体生长发育中构成 新组织的原料，如人体缺乏蛋白质容易衰老和发生疾病。 ( 2 ) 糖类 花粉中的糖类约占花粉干重的l 3 ，包括单糖( 如葡萄糖、果糖、半乳糖) 、 低聚糖( 如蔗糖、麦牙糖、乳糖 和多糖( 如糖蛋白、蛋白聚糖) ，其中最有意义 的是花粉多糖。花粉中的多糖富集于花粉内壁之中，多达9 0 以上。近年来的 研究表明花粉多糖具有很强的免疫功能，并有抗癌、抗艾滋病的活性，具有十 分广阔的开发应用前景。 ( 3 ) 脂类 花粉中含有丰富的不饱和脂肪酸，约占脂类物质的6 0 9 1 。不饱和脂 肪酸是动物和人体不可缺少的营养物质，该物质在人体内不能合成，全靠从食 物中摄取。不饱和脂肪酸主要类型有亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、类脂类物 质( 如磷脂、糖脂、固醇及固醇醋) 。类脂物质可以与蛋白质结合形成脂蛋白， 是人体所有细胞一生物膜的组成部分，对大脑及整个神经系统的发育具有极为 重要的作用。 ( 4 ) 维生素类 花粉中含有十分丰富的维生素，可称多种维生素的天然浓缩物。花粉的 v a 可以防止夜盲症，v b 属维生素在花粉中更为丰富，常见的有v b l ，又称硫 胺素是脱羧酶的主要成分。缺乏v b z 可以引起肌肉萎缩、心力衰竭、四肢麻木 等多种疾病，又称核黄素，是脱氢酶的主要成分。v b 2 可以防治角膜炎、舌炎、 脂溢性皮炎等。v b s 又称泛酸，是辅酶a 的主要成分，主要用于治疗白细胞减 少、冠状动脉硬化及各种肝炎等，v 1 5 缺乏可引发消化不良、呕吐、头晕、迎 忆力减退等症。v a 6 有抗贫血作用。v a t 又称生物素，对机体代谢有重要作用。 v b c 又称叶酸v m ，它在核酸和蛋白质合成中具有重要作用。v c 能促进胶原蛋 白形成，可防治坏血病促进抗体形成，具有造血和解毒功效，v d 能促进c a ，p 的吸收。、，e 又称生育酚，是抗衰老的主要成分。 ( 5 ) 常量元素和微量元素 花粉不但有大量的k 、n a 、m n 、p 等常量元素，而且也含有种类繁多的 微量元素。目前有如下1 5 种微量元素被确认为人体生理所必需的物质：如f e ， l ，c e ，z n ，m ，c o ，m o ，s e ，c r ，s r ，n i ，s n ，b ，f ，v 和g e 等。以上的 1 0 任何一种微量元素缺乏即可引发各种疾病，如d , j l 缺乏z n 可引起发育不良， 缺i 可引起大脖子病等，而花粉中不但上述微量元素种类齐全，而且元素之间 配比非常均衡。 ( 6 ) 酶类 花粉中的酶类物质也相当丰富。据统计在各种植物的花粉中含有近9 0 种 酶。酶是对营养成分进行分解合成时起催化作用的物质。人体中缺乏任何一种 酶，都会使生理活动不能正常进行，如缺乏转化酶，蔗糖就不能被分解为葡萄 糖和果糖，因而也就不能为人体消化吸收。过氧化氢歧化酶( s o d ) 具有抗衰老 和恢复青春的功效。花粉中具有重要作用的酶类物质还有淀粉酶、还原酶、胃 蛋白酶、酒花酶、肠肽酶以及酸性磷酸酶等。 ( 7 ) 黄酮类物质 由于花粉是色素累积的特殊细胞，其类胡萝h 素和黄酮类物质尤为丰富。 据d s t r a c k ( 1 9 8 1 ) 报道，从郁金香花粉中分析出六种黄酮类物质。近年来从山 楂花粉中也分析出多种黄酮类物质。 ( 8 ) 有机酸类 经研究花粉中含有绿原酸及三萜烯酸，而且含量很高。绿原酸具有强壮毛 细血管和抗炎作用；三萜烯酸对抗炎、促进创伤愈合、强心和抗动脉粥样硬化 均具有明显效果。柳树花粉中绿原酸的含量很高，荞麦、野苦菜花粉中三萜烯 酸的含量很丰富( 每1 0 0g 中含8 5 7 0 - 1 1 0 6 0m g ) ，此外花粉中还含有甲酸、乙酸、 丙酸、丙酮酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸等多种有用的有机酸类。 ( 9 ) 其他生物活性物质 近年来花粉中所含韵核酸引起了科学家的关注。核酸为遗传基因物质，是 花粉的遗传信息，具有很强的生物活性，可促进细胞的再生和预防衰老。对多 种慢性疾病均具有疗效。 1 3 2 蜂花粉研究进展【1 1 6 】 f1 ) 花粉对机体免疫功能影响的研究 国外虽然对花粉的免疫功能进行了相当多的研究，但偏重于过敏性疾病的 花粉抗原成分的探讨，对于花粉全面的免疫功能的研究较少。国内近些年来， 由于花粉资源的开发利用，亦进行少量单种花粉的免疫效果的探讨，多种花粉 免疫功能的对比研究尚未见及。已研究的花粉免疫功能测试项目不多。而且多 限于动物模型试验，直接用于人体试验临床疗效的观察较少。当前国内外花粉 产品的开发皆已朝向有特殊功效方面研究。 ( 2 ) 花粉多糖的分离纯化及其免疫药理研究 当前关于多糖能增强机体免疫功能、抗老防衰、抗辐射、抗肿瘤的研究方 兴未艾，而且研究在不断深人，目前对真菌、藻类( 灵芝、木耳、螺旋藻、海 带等) 多糖研究较多，对高等植物也有一定的研究，但对花粉多糖的研究尚不 多见。 ( 3 ) 花粉饲料添加剂的研究 花粉作为饲料添加剂，能起到全面促进机体新阵代谢、提高免疫功能、促 生长、增重、促泌奶、抗菌、防病等综合效果的到特优点，而且国内资源丰富， 加工工艺简便，易于生产因此它具有明显的特色和广阔的前景。目前该实验还 在较大规模地进行中。 ( 4 ) 花粉产品的开发研究 目前国内对花粉的实用价值认识尚不足，因此花粉产品尤其是花粉食品未 被人们充分认识接受。国外许多花粉产品开发较早，花粉制品名目繁多，如德 国生产的“赛尔飞”牌盒装花粉、“花粉糖一号”、“前列腺维他”，瑞典的“寿尼尔 通”、“祛皱纹面霜”，罗马尼亚的“保灵花粉片”、“花粉晶”等颇为著名。我国花 粉产品大致可分为四种，即原花粉型、粉剂型、提取型、花粉片剂，这些类型 的花粉产品，深受人们的喜爱。 花粉资源是自然资源中的重要因子，目前人们还没有完全科学地认识到它 的巨大价值与潜能。花粉是一种微型的不同于其他宏观资源的巨大营养库，所 以容易被忽视，这无不与各国经济、科技水平、生态技术观念以及与资源环境 教育现状有关。资源环境教育在可持续发展中起着重要的宣传指导作用，所以 要求各行业进行全面的思想革命和观念更新，强调绿色科技为核心的科学技术 作为第一生产力，真正协调人类社会经济发展和自然的关系，才能解决人类生 存与发展问题。在经济发达的欧洲、美国、日本等地，花粉已广为人们所接受， 开发利用的技术水平也较高。而我国在这方面需大力加强，提高花粉的开发和 利用程度。为此应引起国家有关部门应有的重视，加大对绿色科技重要性的宣 传力度，在政策上给予一定的倾斜，在技术上予以引导和支持，使这种宝贵而 丰富的营养资源得到广泛利用，造福于人类。 因此，在这种背景下进行蜂花粉的抗氧化性的研究是一个十分有意义的课 题，具有非常明显的必要性和迫切性。 第二章蜂花粉的总黄酮提取工艺 黄酮类化合物因其结构和来源的不同，溶解特性差异较大。因此，应根据 其极性和水溶性的大小选择合适的溶剂进行提取。目前，对苷类和极性较大的 苷元，常用某些极性较大的混合溶剂( 如甲醇水、水、甲醇、乙醇、丙酮) 进行 提取，而对大多数苷元则采用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等极性较小的溶剂进行提 取。 ( 1 ) 醇类提取：甲醇和乙醇是常用的黄酮类化合物提取溶剂，高浓度的 醇( 如9 0 9 5 ) 适于提取苷元，6 0 左右浓度的醇适于提取苷类。提取次数 一般是2 4 次，可用冷浸法或加热抽提法提取。 ( 2 ) 热水提取：仅限于提取替类，但因提取杂质多，故不常使用。 ( 3 ) 碱性稀醇或碱性水提取：碱性提取时，所用碱的浓度不宜过高，以 免在强碱条件下加热破坏黄酮类化合物的母核。提取液中加入酸，黄酮苷类即 可沉淀析出，加酸酸化时，酸性也不易过强，以免生成盐，致使析出黄酮化合 物又重新溶解，降低产品收率。 ( 4 ) 系统溶剂提取：用极性由小到大的溶剂依次提取，可以提取出大多 数游离的黄酮类化合物，但此法目前仅用于实验室，很难工业化。 本试验利用超声波提取法，利用超声波的强大冲击波，加速花粉的活性物 质在乙醇中分散、溶解。对花粉的壁进行剥离，可加速分子在乙醇的溶解，明 显缩短提取时间，提高黄酮提取率。 2 1 材料与方法 2 1 1 实验材料 油菜花粉，由陕西老蜂农蜂业有限责任公司提供；芦丁，购自上海化学试 剂第二公司。 2 1 2 仪器、设备 k q - - - 2 5 0 d b 型数控超声波清洗器，d g x 一9 1 4 3 b - 1 型电热恒温鼓风干燥 箱；u v 7 5 1 g d 紫外可见分光广度计及其他实验室常规仪器、设备。 1 4 2 1 3 实验方法 蜂花粉干燥至恒重，称取1 9 ，放入l o m l 的容量瓶中，加入6 0 的乙醇定 容，超声处理，利用亚硝酸钠硝酸铝显色，波长5 l o a m 测定【1 1 7 i 其总黄酮含量。 2 2 结果与讨论 2 2 1 超声提取对黄酮得率的影响 准确称取1 o g 的油菜花粉，在温度4 0 。c ，进行常规提取与超声提取的对 比实验如表2 - 1 所示。 表2 - 1超声提取对黄酮得率的影响 从表2 1 表明：超声提取3 0 r a i n 与常规提取3 h 得率相近。在时间一致时， 超声提取得率远高于常规提取法。上述结果说明，利用超声提取，可以大量缩 短提取时间，且获得较高的提取率。 2 2 2 单因素对黄酮提取率的影响 2 2 2 1 超声作用时间对提取率的影响 准确称取1 9 油菜花粉样品，在温度3 0 。c ，功率l o o w 的条件下，不同 提取时间结果见图2 - 1 。 1 0 0 8 0 艰 赢6 0 层 骝 4 0 2 0 0 2 04 06 0 t m i n 图2 - 1 超声时间对提取率效果的影响 图2 - 1 表明，1 0 3 0 m i n 随着时问的增长，溶解度呈线性迅速增大，但到 3 0 - 4 0 r a i n 以后，溶解率增长逐渐缓慢。4 0 r a i n 以后，溶解量不再增大，说明 花粉中黄酮的溶解基本完全。由于本实验的所采用超声波的功率1 0 0 w 属于 小功率，超声对细胞壁的破碎作用较小，振动作用较弱，随着时间的增加，壁 破碎程度逐渐增强。因此，时间短，溶解的黄酮量少，得率低，随着时间增 加，壁破碎程度增强，溶解的黄酮量增多。 2 2 2 2 超声温度对提取率的影响 3 8 3 6 术 京3 4 盛 辎 3 2 3 0 2 04 06 08 0 1 y 图2 2 温度对提取率的影响 准确称取1 9 油菜花粉，在时间1 0 m i n ，功率1 0 0 w 的条件下，不同温度 下提取结果见图2 - 2 。 图2 2 表明：随着温度的升高，黄酮的提取率也随着增大。3 0 4 0 内， 随着温度的升高，黄酮的溶解量增长很快，4 0 7 04 c ，黄酮的溶解量的增长明 显变缓。上述结果表明黄酮提取率在较低温度段，温度的改变，加快了分子的 运动速度，则加速溶解速度。而在较高的温度段，温度的变化对黄酮提取率的 影响相对较小。 2 2 2 3 超声功率对提取率的影响 称取1 9 油菜花粉，在时间l o m i n ，温度3 0 。c 的条件下，不同超声功率对提 取结果的影响见图2 3 3 5 3 4 蓬