（应用化学专业论文）基于酰胺基喹啉的锌离子荧光分子探针的研究.pdf

大连理工大学博士学位论文 摘要 ：锌是人体内第二富集的过渡金属，在诸如基因转录、金属酶调控、神经信号传输等 许多生命过程中起着关键性作用。荧光显微成像技术作为最有效的检测手段已广泛用于 生物体内锌离子的研究。成功利用此项技术的关键是设计、合成适当的锌离子荧光成像 试剂。尽管已有一些商业化的锌离子探针，人们还是在努力设计、合成新的此类荧光分 子，不断发现新的荧光识别原理，提高灵敏度、选择性和可靠性等，以满足各种不同的 研究需要。 本文基于分子内电荷转移原理设计、合成了一系列新的酰胺基喹啉衍生物，研究了 这类化合物在中性缓冲溶液中对金属离子的识别性能。 通过分别在酰胺基瘌卢位引入2 ( 2 。羟基乙氧基) 乙胺、n - ( 2 。羟乙基) 乙二胺、一- - ( 2 羟乙基) 胺、苯并氮杂1 5 一冠5 等脂肪胺，设计、合成了七种酰胺基喹啉衍生物荧光分子 探针，从中发现n - ( t r - ( 2 ( 2 羟乙氧基) 乙胺基) 乙酰基) 一8 胺基喹啉( 2 a - 1 ) 可以比率荧光 识别锌离子。2 a 1 与锌离子形成1 ：1 型络合物后，其荧光量子产率增强8 倍，发射波长 红移7 51 3 m ；荧光颜色由青紫色变为蓝绿色，可直接观察识别过程；在活细胞内能够对 锌离子进行荧光成像检测。 通过分别在2 a - 1 分子中的喹啉2 和4 位引入甲基、氰基、甲氧基、- 吗啉基等取 代基，设计、合成了十一种酰胺基喹啉衍生物荧光分子探针。光谱研究表明，喹啉2 位 取代基的空阻效应将降低酰胺基喹啉与锌离子络合的稳定性；而喹啉4 位取代基则导致 酰胺基喹啉对锌离子检测的灵敏度最高。在喹啉2 和4 位引入的取代基随着其给电子能 力的增加，使锌离子诱导的酰胺基喹啉的发射波长红移幅度逐渐减小，直至荧光识别信 号由双波长比率变化转化为单波长强度变化。其中，吗啉基取代的3 a - 7 和4 a _ 4 几乎 没有背景荧光，可以线性、等比例、化学计量地荧光增强响应锌离子，其荧光量子产率 分别增强1 4 1 和2 3 9 倍。核磁实验证实了锌离子可以诱导4 a 4 的酰胺基团发生去质子 化，并与其形成1 ：l 型络合物。 研究了表面活性剂胶束对酰胺基喹啉识别性能的影响。在十二烷基硫酸钠胶束溶液 中，2 a 1 的识别选择性比在常规溶液中得到迸一步提高，能够专一选择性比率荧光识别 锌离子；同时，荧光响应锌离子浓度范围由1 1 0 9 m 拓宽至1 1 0 0 0 9 m 。 关键词：酰胺基喹啉；锌离子；荧光分子探针 基于酰胺基喹啉的锌离子荧光分子探针的研究 z i n ci o nf l u o r e s c e n ts e n s o r sb a s e do nc a r b o x a m i d o q u i n o l i n e a b s t r a c t z i n ci st h es e c o n dm o s ta b u n d a n tt r a n s i t i o nm e t a li o ni nt h eh u m a nb o d ya n dp l a y sa l l 蜥砌mr o l e i nv a r i o u sb i o l o g i c a l p r o c e s s e ss u c ha sg e n et r a n s c r i p t i o n , r e g u l a t i o no f m e t a l l o e n z y m e s ，n e u r a ls i g n a lt r a n s m i s s i o n , a n do t h e r s t h ef l u o r e s c e n c ei m a g i n gt e c h n i q u e ， w h i c hi st h em o s te f f e c t i v ew a y , i sw i d e l yu s e df o rt h es t u d yo fz n z + i nv i v o t h ek e yt o s u e e e s s f u u ya p p l yt h i st e c h n i q u ei st od e v e l o pa p p r o p r i a t ef l u o r e s c e n tz ni m a g i n gr e a g e n t s d e s p i t eh a v i n gm a n yc o m m e r c i a lz n 2 + s e n s o r s ，p e o p l ec o n t i n u ee n d e a v o r i n gt od e s i g na n d s y n t h e s i z en e wo n e s ，t of i n dn e wf l u o r e s c e n c er e c o g n i t i o np r i n c i p l e s ，a n dt oi m p r o v et h e s e n s i t i v i t y , s e l e c t i v i t y , a n dr e l i a b i l i t yi no r d e r t os a t i s f yv a r i o u sn e e d s i n p r e s e n tw o r k , as e r i e s o fn e wc a r b o x a m i d o q u i n o l i n ed e r i v a t i v e sb a s e do nt h e i n t r a r n o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e rm e c h a n i s mh a v eb e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d a n dt h e r e c o g n i t i o np e r f o r m a n c ef o rm t f , a li o n si nb u f f e rs o l u t i o nh a s b e e ns t u d i e s s e v e nc a r b o x a m i d o q u i n o l i n ed e r i v a t i v e sw i t hv a r i o u s a l i p h a t i c r i t 血es u c ha s 2 - ( 2 - h y d r o x y e t h o x y ) e t h y l a m i n e ，n - ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) e t h y l d i a m i n e ，b i s ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) a m i n e ， b e n z o a z a c t o w ne t h e r ，a n do t h e r sa tp o s i t i o n 口o rpo ft h ea m i d eg r o u p ，h a v eb e e nd e v e l o p e d a m o n gt h e m , - ( 弘( 2 - ( 2 - h y d r o x y e t h o x y ) e t h y l a m i n o ) a c e t y l ) 一8 一a m i n o q u i n o l i n e ( 2 a - 1 ) c o u l d e x h i b i tr a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n ts i g n a l sf o rz n - 2 + a f t e rf o r m i n gt h ei ：1c o m p l e xb e t w e e n2 a - 1 a n dz n 2 + ，t h e r ea r ea b o u ta l l8 - f o l di n c r e a s ei nf l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l da n da7 5n mr e d - s h i f t o ff l u o r e s c e n c ee m i s s i o n a n da no b v i o u s l yc o l o rc h a n g ef r o mb l u e - p u r p l et ob l u e - g r e e n e m i s s i o no f t h es o l u t i o nc o u l de a s i l yb eo b s e r v e db yt h en a k e de y e m o r e o v e r , 2 a - 1c o u l de n t e r l i v i n gc e l l sa n ds i g n a lt h ep r e s e n c eo fz n 2 + e l e v e nf l u o r e s c e n ts e n s o r sw i t hd i f f e r e n ts u b s t i t u e n t ss u c ha sm e t h y l ，c a y n o ，m e t h o x y l ， n - m o r p h o l i n y l ，a n do t h e r sa tp o s i t i o n2o r4o ft h eq u i n o l i n er i n go f2 a - 1 ，h a v eb e e n s y n t h e s i z e d t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ez n 2 + - b i n d i n gs t a b i l i t yo fc a r b o x a m i d o q u i n o l i n ec o u l d b ed e c r e a s e db yt h es t e r i ch i n d r a n c ee f f e c to f2 s u b s t i t u e n t s a n dt h eh i g h e s ts e n s i t i v i t yt oz n 2 + o fc a r b o x a m i d o q u i n o l i n ec o u l db eo b s e r v e db yi n t r o d u c i n g4 一s u b s t i t u e n t s w i t hi n c r e a s i n gt h e e l e c t r o n - d o n a t i n gi n t e n s i t yo fs u b s t i t u e n t s a tp o s i t i o n2o r4o ft h eq u i n o l i n er i n g , t h e r e d - s h i f t e de m i s s i o nw a v e l e n g t ho fc a r b o x a m i d o q u i n o l i n ei n d u c e db yz n z 十i sg r a d u a l l y d e c r e a s e du n t i lf l u o r e s c e n c es i g n a l sa r et r a n s f o r m e df r o mt h ed u a l w a v e l e n g t hr a t i o m e t r i c c h a n g e st ot h es i n g l e w a v e l e n g t hi n t e n s i t yo n e s a m o n gt h e m , 3 a - 7a n d4 a - 4 、玩t l lt h e n - m o r p h o l i n y lg r o u ps h o wl i n e a r , s t o i c h i o m e t r i c a l ，a n de n h a n c e df l u o r e s c e n c er e s p o n s et o i i 大连理工大学博士学位论文 z 1 1 2 + w i t h o u tb a c k g r o u n df l u o r e s c e n c e t h e r ea r ea b o u t1 4 1a n d2 3 9 f o l de n h a n c e m e n ti n f l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d ，r e s p e c t i v e l y 1 h 姗t i t r a t i o ns t u d i e si n d i c a t et h ed e p r o t o n a t i o n o f t h ea m i d eg r o u pb yc o o r d i n a t e dz n 2 + a n dt h ef o r m a t i o no f t h e1 ：1c o m p l e xb e t w e e n4 a 4a n d z n 2 + 乃ei n f l u e n c eo i lt h ed e t e e t i o np e r f o r m a n c eo f c a r b o x a i n i d o q u i n o l i n ei ns u r f a c t a n tm i c e l l e h a sb e e ns t u d i e s i ns d sm i c e u es o l u t i o n , t h es e l e c t i v i t yo f2 a 一1c o u l db ei m p r o v e di n c o m p a r i s o nw i t ht h a to fi nc o n v e n t i o n a ls o l u t i o n 2 a - 1s h o w st h eu n i q u e l yr a f t o m e t r i cz 矿 i d e n t i f i c a t i o n a n dt h er e c o g n i z i n gz n 2 + r a n g e sa r ee x p a n d e df r o m1 - 1 0 mt o1 1 0 0 0 t m k e yw o r d s ：c a r b o x a m i d o q u i n o l i n e ；z i n ci o n ；f l u o r e s c e n ts e n s o r 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目：蠢幽壅幽毖量型至盥堑越 一7 ，向v 作者签名：么。查日期：型12 年上月_ _ 生日 大连理工大学博士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目：盘睦邀重趟毖主丝苤量型垫丝 作者签名_ 丞。兰 一 日期：型乏年l 月_ - 生日 导师签名：镁监竺_ 一日期2 孚年- l 月笪日 大连理工大学博士学位论文 1 前言 1 1 绪论 1 9 8 7 年，诺贝尔化学奖获得者l e h n 在其获奖演讲中，首次明确提出了超分子化学 的概念，即超分子化学是研究分子组装和分子间键的化学【l 】。自此，化学实现了由分子 层次向分子以上层次跨越的历史性转变。相对于以共价键为基础、以分子为研究对象的 分子化学而言，超分子化学是研究分子间相互作用缔结而形成复杂有序且具有特定功能 的分子聚集体的科学，即超分子化学是研究通过非共价键作用形成功能体系的科学【2 翔。 超分子化学改变了人们对分子认识的经典理论，分子不再是保持物性的最小单位； 分子间弱的相互作用可由几种非共价键的分子间作用力协同、加和，并且还具有一定的 方向性和选择性，其总的结合力强度不亚于共价键 4 1 。超分子化学作为- - 1 7 新兴的分子 信息化学，主要包括在分子水平和结构特征上的信息存储，以及通过特异性相互作用的 分子识别过程，实现在超分子尺寸上的修正、传输和处理【l 】 分子识别是生命活动中一个至关重要的现象，是超分子化学研究的基础。分子识剧 是分子之间的一种特殊的、专一性的相互作用，是主体( 受体) 对客体( 底物) 选择性 结合并产生某种特定功能的过程【5 】。但分子识别作为分子之间发生的事件，其产生的微 观环境的变化需要借助特殊的工具才能转换为外界所感知的信号。而这种信号需要具有 对识别事件不同发生地点或环境的选择性，满足不同检测距离( 原位或远程检测) 的便 捷性，以及对外界干扰因素所产生的噪音信号的免疫性【6 】。 荧光检测技术可以将分子识别信息转换成荧光信号传递给外界，实现人与分子间的 对话，而将荧光作为传感信号具有如下优点：最高可达单分子检测的高灵敏度、能够实 现开关操作、原位检测( 荧光显微成像技术) 以及利用光纤进行远程检测掣7 1 。能够：执 行荧光传感任务的分子被称作荧光分子探针。目前，设计和合成专业化、特殊化的荧光 分子探针已经引起了广泛的关注，成为了一个世界性的研究课题f 7 1 。 本文主要是研究基于酰胺基喹啉的z n 2 + 荧光分子探针，因此本章阐述了z n 2 + 在生物 体内的重要作用及喹啉类z f + 荧光分子探针的作用机制、检测性能和取得的主要进展。 1 2 锌离子在生物体内的重要作用 在自然界元素的丰度顺序中，锌排在第2 5 位，在地壳中的平均含量波动于0 0 0 4 o 0 2 之间。锌是位于元素周期表第1 i 副族的过渡金属元素，具有3 d 1 d 4 s 2 的价电子结 构，通常只失去s 电子而成+ 2 氧化态。z n 2 + 的原子半径较小，且因其带两个正电荷，所 以它对电子的亲和力很高，是一个强的质子受体。 。 基于酰胺基喹啉的锌离子荧光分子探针的研究 z i l 2 + 是人体内第二富集的过渡金属，广泛分布于人体内部。例如，成年人体内共含 有2 3g 锌，而铜的含量仅为2 5 0m g 。更有趣的是，大量的z n 2 + 存在于神经组织中，如 在脑组织中z n 2 + 的浓度达到了0 1 0 5m m t 引。目前，已知在其活性中心包含z n 2 + 的酶的 数目超过了1 0 0 0 种【9 1 ，六大类酶中均存在z i l 2 + ，z n 2 + 参与了细胞的所有代谢过程。2 0 0 7 年，在b r o o k h a v e n 蛋白质数据库展示的4 0 0 0 0 种蛋白质结构中，超过5 0 0 0 种蛋白质中 存在z n 2 + 1 0 1 ，并且大约3 的人类遗传基因中含有锌指蛋白【1 1 1 。 迄今为止，人们已经认识到z n 2 + 在诸如基因转录、金属酶调控、神经信号传输等许 多生命过程中起着关键性作用【1 2 】，其中最重要也是最广为人知的作用就是在金属蛋白中 作为一种构造因子【1 3 】。在最初发现的转录因子i i i a ( t f i i i a ) 中，c y s 2 h i s 2 和z n 2 + 作用形 成一种核酸键联域，即锌指蛋白【1 4 1 。在锌指蛋白的折叠过程中，z a 2 + 首先与c y s 配位， 继而伴随着z n 2 + 与m s 的配位，蛋白的结构由f l - s t r a n d 型转化为a h e l i x 型，其具有生 物功能的多级结构的形成完全依赖于z n 2 + 的键合。同时，由于水合锌或氢氧化锌都是良 好的亲核试剂，且许多水解酶在其活性位点上都含有z n 2 * ，因此z n 2 + 可以通过金属调整 蛋白直接参与调整基因表达【1 5 1 。例如，人体中碳酸醉酶的催化中心就是由z n 2 + 和三 个组氨酸残基及一个水分子配位所构成的【1 6 】。事实上，生物体内外的大量证据都表明在 细胞凋亡过程中z n 2 + 是一种重要的调整元素【1 7 】。z n 2 + 能够从突触囊中释放出来并通过电 位调控型c a + 信道进入细胞，这表明游离z n 2 + 还具有神经调节功斛1 8 】。此外，z n 2 + 新陈 代谢的紊乱还会造成很多疾病，例如a l z h e i m e r 氏病、肌萎缩性( 脊髓) 侧索硬化、癫 痫症和帕金森氏病等【1 9 】。 然而，由于z n 2 + 没有空的d 轨道，所以不具有过渡金属通常所具有的d d 电子跃迁， 在可见光区域，含锌酶也不具有可见光谱。同时由于z t l 2 + 不存在未成对的电子，所以也 不表现任何磁信号，因此利用常规分析方法，如紫外可见光谱法、核磁共振法或电子 顺磁共振法均不能在生物体内有效地检测这种非典型的金属离子，这给人体内z n 2 + 的研 究带来了一定的困难【2 0 1 。近年来发展起来的z , n 2 + 荧光检测技术是完成上述研究工作最强 有力的手段之一，特别是该方法可以通过荧光成像技术原位检测生物体内的z n 2 + ，这是 其它方法目前所无法替代的【2 l ，2 2 】。 1 3 喹啉衍生物锌离子荧光分子探针 成功利用z n 2 + 荧光检测技术的关键是设计、合成适当的z i l 2 + 荧光成像试剂。近年来， 人们一直在努力设计、合成新结构的z i l 2 + 荧光分子探针，提高其选择性、灵敏度和可靠 性以满足各种不同的研究需要【”。2 7 】。其中，基于喹啉设计、合成的z n 2 + 荧光分子探针用 大连理工大学博士学位论文 于生物体内金属离子的检测已经取得了一些成功的范例，部分喹啉化合物已经实现了商 业化，如t s q ( 6 甲氧基8 节一甲苯磺酰胺基喹啉) 及其衍生物首次实现了大脑、心脏及 其它组织切片中2 1 1 2 + 的荧光成像检测，被视为生物体内压1 2 + 荧光分子探针发展史上的一 座里程碑。但是水溶性较低，需用紫外光激发，且结合z i l 2 + 后化合物荧光仍较弱、易受 细胞内背景荧光干扰等局限性给这类化合物在生物体内的应用带来一些不便。为解决上 述问题，人们利用喹啉构造了许多新的z n 2 + 荧光分子探针，取得了良好的识别效果。 1 3 1基于喹啉的锌离子荧光分子探针 喹啉作为有配位作用的荧光团已被广泛应用于z n 2 + 及其它一些金属离子的定量检 测中【2 8 1 。一般有两种说法可以解释这类荧光团的发光行为：一是认为此类化合物的最低 单线态& 为n ，7 c l ，而s 1 的玛兀1 能层与三线态乃的玛7 c l 能层间隔很小，导致墨一死的 系间窜越效率增大，同时由于存在光化学反应及较强的研一岛非辐射内转移，因此荧光 很弱：二是利用电子自旋轨函耦合作用进行说明。e 1 s a y e d 认为，有效的s l 一乃系间窜 越的先决条件是存在低于激发单线s 1 态n ，兀l 能层的激发三线兀态7 c ，兀l 能层。若低于s l 态i l ，兀l + 能层者是乃态玛冗1 。能层，而不是乃态兀，兀1 + 能层，则系间窜越效率低，可观测到 弱的荧光 2 9 】。络合z n 2 + 后，喹啉分子中的n 电子与z n 2 + 配位，其基态最高占有轨道由n 轨道转变为7 c 轨道，相应的s l 态由玛冗1 。能层转变为7 c ，冗l 能层，即受激发时电子发生自 旋允许的兀一兀l 跃迁，而不是自旋禁阻的n 一尢l + 跃迁，因此化合物发射强荧光【3 0 】。 n 1 9 9 8 年，c 趾a r y 等【3 l 】利用喹啉合成了三足型手性化合物1 1 ，并首次提出了利用化 合物分子的各向同性和各向异性吸收信号识别金属离子。在水溶液中，z n 2 + 、c d 2 + 均导 致化合物的荧光显著增强。而在圆二色光谱中，1 - 1 与z n 2 + 络合时可以产生强烈的吸收 信号，而结合c d 2 + 时则无信号产生，因此1 - 1 可以用于识别、区分多组分待测物。 h 缸c o c k 等【3 2 】则利用结构与1 - 1 相似的1 2 、1 3 研究三足型化合物对金属离子的络 合能力。1 - 3 与1 - 2 的区别仅在于1 3 分子中的吡啶基团可以参与金属离子配位，与其形 成六元螯合环，而1 - 2 则只能与金属离子形成类似的五元螯合环。对于直径较小的金属 基于酰胺基喹啉的锌离子荧光分子探针的研究 离子而言，增大配体螯合环尺寸可以增加化合物对其的选择性。与1 - 2 相比，1 3 络合 原子半径较小的z n 2 + 时结合常数较大，而与原子半径较大的c d 2 + 络合时结合常数则较 小。此外，与1 2 的金属离子络合物相比，1 3 z n 2 + 络合物的荧光较强，而c d 2 + 络合物 的荧光则较弱，这主要是由于六元螯合环中c d 2 + 的张力较大，c d 2 + 与n 原子所形成的配 位键重叠部分变小，导致溶液荧光猝灭。 it _ 、 汀l h 音节渤 n a g a n o 等【3 3 】将- - 7 , 烯三胺五乙酸的e u 3 + 络合物引入到喹啉分子设计中，合成了具 有较高信噪比、可用于生物体内z n 2 + 研究的镧系金属络合物1 _ 4 。与普通的非金属有机 荧光化合物相比，镧系金属络合物的引入使化合物分子具有荧光寿命长( 毫秒级) 、斯托 克斯位移大( 2 5 0r i m ) 、水溶性好等优点，并且在检测过程中可以通过设置适当的延迟 时间消除寿命较短的背景荧光及分散光衰减的干扰。络合z a 2 + 后，化合物分子中的喹啉 基团吸收能量后跃迁到激发单线态两，经系间窜越到激发三线态乃，由于喹啉基团激发 三线态乃能级略高于e u 3 + 的激发态能级5 d o ，因此可以产生无辐射能量传递过程，将能 量由喹啉基团传递给e u 3 + ，当电子由e u 3 + 的激发态5 风回到基态7 只( j = 0 ，1 ，2 ) 时，化 合物发射e u 3 + 的特征荧光( 图1 1 ) 。在水溶液中，z n 2 + 导致1 - 4 的荧光增强8 5 倍，且与 1 - 4 形成1 ：1 型络合物。在p h3 6 8 8 区间内，无论z n 2 + 存在与否，矿对1 - 4 的荧光光谱 大连理工大学博士学位论文 均没有影响，即在生理p h 范围内1 - 4 的荧光强度保持稳定，便于生物内z n 2 + 的检测。 此外，应用时间分辨长寿命荧光技术，n a g a n o 等【3 4 】利用1 - 4 还首次实现了镧系金属络 合物荧光分子探针对细胞内z n 2 + 浓度变化的荧光成像检测。 参照经典的重金属螯合剂四( 2 吡啶甲基) 7 , - - 胺，m i k a t a 等【3 5 】利用喹啉基团代替吡 啶基团，合成了六齿型化合物1 5 。络合z n 2 + 后，螯合促进荧光增强和抑制光诱导电子 转移( p e t ) 共同导致化合物荧光增强，且1 5 与z n ：+ 亲和力的大小可通过喹啉1 位n 原子的给电子能力及喹啉基团的空阻效应共同调控。在d m f 水体系中，及p 导致1 5 的荧光增强2 3 倍，且与1 5 形成1 ：1 型络合物。此外，1 5 在宽的p h 范围内0 h3 1 1 ) 对z n 2 + 均有荧光响应，排除了在较低p h 下旷对z n 2 + 检测的干扰，即喹啉1 位n 原子 的质子化并不能猝灭1 5 的荧光，这表明抑制p e t 过程并不是1 5 产生荧光的唯一原因。 晶体的x 射线衍射实验表明1 5 分子中的四个喹啉基团均参与配位，六个n 原子共同络 合z n 2 + ，得到一个以z n 2 + 为中心、具有螺旋状结构的扭曲八面体型络合物。 为了解决1 - 5 的激发( k 戤( 既) = 3 1 7a m ) 及发射波长队嗽( e m ) = 3 8 3n m ) 较短、荧光 强度较弱的缺点，m i k a t a 等【3 6 】在1 5 分子中的每个喹啉基团上分别引入了一个或三个甲 氧基，合成了化合物1 - 6 、1 - 7 。在d m f 水体系中，1 - 6 络合z i l 2 + 后其荧光增强1 3 倍， 激发及发射波长分别红移至3 3 2 、4 0 8 衄，且与z n 2 + 形成1 ：1 型络合物。与1 5 z n 2 + 络 合物相比，1 - 6 z n 2 + 络合物的荧光增强1 0 倍，表明在喹啉基团上引入甲氧基有助于增强 化合物的荧光发射。而在相同条件下，1 7 则可比率荧光识别z n 2 + ，等摩尔的z n 2 + 导致 1 7 的发射波长由4 3 0 姗红移至4 9 3r i m ，荧光增强2 3 倍。这可能是由于络合z n 2 + 后 1 7 的激发态发生极化，其结构与喹啉1 位n 原子质子化时相似，并且三个甲氧基的存 在使其极化结构相对稳定。另一种原因可能是z n 2 + 使1 7 分子中相邻的两个喹啉基团之 间的距离靠近，形成了激基缔合物，导致1 - 7 在长波处发射荧光。 基于酰胺基喹啉的锌离子荧光分子探针的研究 在上述研究的基础上，m i k a t a 等【3 7 1 n 用异喹啉基团代替喹啉基团，合成了化合物 1 。8 、1 - 9 。与1 5 相比，异喹啉基团的引入使化合物荧光增强、激发及发射波长明显红 移，同时还提高了化合物区分z n 2 + 与c d 2 + 的能力、降低了空白化合物的背景荧光，以及 排除了络合z n 2 + 后所产生的空阻效应。在d m f 水体系中，z n 2 + 导致1 8 ( k 戤( 锄1 = 4 7 7 n m ) 、1 - 9 ( k 舣( e r a ) = 4 7 5a m ) 的荧光分别增强了1 2 、1 3 倍，且可以与化合物形成1 ：1 型 络合物。此外，这类化合物能够检测到亚微摩尔级的z n 2 + 。 m n 1 1 l w i e z k 掣3 8 】将氨基酸基团连接到喹啉分子上，合成了化合物1 1 0 。氨基酸基团的引 入使1 1 0 分子易于共价连接到肽链上，为进一步合成具有良好细胞渗透性的z n 2 + 荧光 分子探针提供了基础。在乙腈中，z n 2 + 使1 1 0 的荧光量子产率增加4 0 倍，且与其形成 了两种不同的络合物。等摩尔的z n 2 + 导致1 1 0 的吸收波长发生红移，出现了清晰的等 吸收点，而继续增加2 r n 2 + 的浓度则导致吸收波长又发生蓝移，等吸收点被加宽，1 1 0 在 溶液中与z n 2 + 形成了其它结构的络合物。 k o o l 等p 明利用2 喹啉2 苯并咪唑合成了- 脱氧核苷1 1 1 。作为具有金属识别能力 的组分，1 1 1 可以直接引入到d n a 上，而应用d n a 作为荧光检测平台则可增加化合 物的水溶性，利于化合物在生物体内应用。此外，d n a 双螺旋或折叠结构还有利于多 配体的协同检测，便于1 1 1 在细胞表面进行自组装。在甲醇中，z n 2 + 使原来与芳环共平 面的二甲氨基绕单键旋转，分子共轭体系被破坏，导致1 1 l 发射波长由5 4 3n m 蓝移至 4 7 6n m ，且荧光增强2 倍左右。 郭子建等m 】将羧酸酰腙基团引入到喹啉分子上，利用自组装机制合成了化合物 1 1 2 、1 1 3 。络合z n 2 + 后，由于亚胺基团的去质子化使化合物以带负电的螯合体形式存 在，导致其电子发生离域，增大了体系的共轭面积，激发及发射波长发生红移，并且螯 合促进荧光增强和自组装荧光增强原理共同导致化合物荧光增强。在d m f 水体系中， 大连理工大学博士学位论文 z t l 2 + 导致1 1 2 的发射波长由4 0 5n m 红移至5 0 0n m ，且通过自组装与1 1 2 形成2 ：2 型、 双金属螺旋体状络合物。在相同条件下1 1 3 对z n 2 + 的荧光响应与1 1 2 相似，只是其与 z n 2 + 形成络合物时的结合常数较大，这主要是由于联吡啶基团中n 原子的存在增大了整 个配体的共轭面积，使其z n 2 + 络合物更加稳定。 h n 、 g 九队n h p 大多数水溶性z n 2 + 荧光分子探针在检测过程中存在空白化合物的背景荧光较高或 非线性荧光响应z n 2 + 的难题，为此s h i r a i s h i 等【4 l 】利用二乙烯三胺将两个喹啉分子连接起 来，合成了一个简单的z n 2 + 配体1 1 4 。由于二乙烯三胺分子中n 原子与喹啉基团之间 存在p e t 过程，因此1 1 4 自身没有荧光发射。在p h5 1 2 范围内，1 1 4 可以线性、化 学计量地荧光响应z n 2 + ，且与z n 2 + 形成1 ：1 型络合物。而c d 2 + 则由于增大了喹啉分子激 发单线态岛的系间窜越能力，导致其对1 1 4 的荧光光谱影响较小。 陈绘丽等【4 2 】利用喹啉2 醛合成了化合物1 1 5 。在乙腈中，1 1 5 可以比率荧光识别 z n 2 + ，z n 2 + 导致1 1 5 的发射波长由3 9 6n m 红移至4 2 6 姗，且1 1 5 分子中的四个n 原 子均参与z n 2 + 配位，与z n ：+ 形成1 ：1 、y 型络合物。 1 3 2 基于8 一羟基喹啉的锌离子荧光分子探针 8 羟基喹啉( 8 h q ) 是继e d t a 之后第二重要的金属离子螯合剂，被广泛应用于构 建具有高灵敏度的金属离子荧光分子探针【4 3 1 。由于喹啉1 位n 原子与8 位羟基之间存 在分子内氢键，因此8 - h q 自身没有荧光。在强碱水溶液中，8 - h q 易于发生去质子化 过程，分子内氢键被破坏，然而由于化合物与水分子之间形成了分子间氢键，发生光诱 导激发态质子转移过程( e s p t ) ，因此8 h q 的荧光仍被猝灭，处于激发态的分子主要通 过非辐射跃迁的方式返回到基态。当8 一h q 络合金属离子后，e s p t 过程被抑制，导致 其发出强烈的黄绿色荧光。但8 - h q 对金属离子的选择性差是其作为荧光分子探针的主 要缺点【4 3 1 。因此，在8 - h q 分子上引入其它辅助基团，增加其对金属离子的选择性，是 此类荧光分子探针研究领域的热点之一。 囝 磐 基于酰胺基喹啉的锌离子荧光分子探针的研究 o h 1 1 6 o 由于细胞内游离z n 2 + 的浓度可能处于毫微摩尔级，甚至更低，因此合成对z n 2 + 具有 较高亲和力、且保持较好选择性和灵敏度的化合物成为2 砰+ 荧光分子探针研究的热点。 人们注意到含有络合位点c y s x h i s y0 = 2 - 4 ，y = 4 - x ) 的锌指蛋白对z n 2 + 具有较高的亲和 力0 0 - 1 2 ，因此，具有与锌指蛋白相同序列的人工肽链可以作为荧光分子探针中的 离子载体。出于上述考虑，i m p e r i a l i 等m 】将二齿型8 - h q 连接到尺寸较小肽链( 7 肽) 的 残基上，合成了化合物1 1 6 、1 1 7 。1 1 7 在z n 2 + 存在条件下可以被迅速氧化为双硫二聚 物，导致其对z n 2 + 的检测变得相对复杂，而1 1 6 则可与z n 2 + 形成1 ：1 型络合物。与2 。 甲基。8 羟基喹啉( 2 m e 8 h q ) 的z n 2 + 络合物相比，1 1 6 对z n 2 + 的亲和力增加约1 7 0 倍， 表明肽链中的巯基丙氨酸残基参与了z n ：+ 配位。此外，1 1 6 可以检测到亚微摩尔级的 z n 2 + ，其检出限小于2 5 0n m 。 图1 2 多肽与z n 2 + 络合过程示意图。 f i g 1 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f m o d u l a rz n 2 + - b i n d i n gp c p t i d e s 为了进一步研究肽链结构变化对z n 2 + 亲和力的影响，i m p e r i a l i 等【4 5 】通过改变肽链中 z n 2 + 配体的类型和数目、配体排列顺序及配体之间预组织部位伊转角序列( 图1 2 ) ，合 成了1 9 种以1 ，1 8 为母体的乙r 生物荧光分子探针。在分子设计中，喹啉5 位引入的 n , n - - - 甲基磺酰胺基可显著提高化合物的荧光量子产率。研究表明，由于z n 2 + 首先与柔 性配体进行络合，因此缩氨酸基团对z n 2 + 的亲和力按下列顺序依次降低：硫醛盐 双 咪唑 磷酸盐 单咪唑 羧酸盐。配体的变化导致肽链对z n 2 + 的亲和力跨越了2 个 大连理工大学博士学位论文 数量级，可以通过改变转角序列和配体排列精确调节肽链对z n 2 + 的亲和力。其中，11 种肽链可以与矗2 + 形成1 ：1 型络合物，其亲和力分布于1 0 1 0 0 0n m 范围内，因此协同 使用这类化合物可以准确测定生物体内z n 2 + 的浓度。 r o ho h 1 - 1 9r = n 0 2 1 - 2 1 r = s 0 2 n ( c h 3 ) 2 1 - 2 0 r = s 0 2 0 h 1 - 2 2 r = s 0 2 n ( c 4 h 9 ) 2 h o i m p e r i a l i 等【4 6 】对2 m e 8 - h q 进行结构修饰，在喹啉5 、7 位分别引入硝基、磺酸基 和磺酰胺基等吸电子基，合成了一系列8 - h q 衍生物。结果表明，在生理条件下络合z n 2 + 后，硝基诱导化合物不发射荧光，而磺酸基、磺酰胺基则使化合物的荧光显著增强。与 2 - m e - 8 h q z n 2 + 络合物队嗽( = 5 3 3a m ) 相比，勐【2 + 导致1 - 2 0 队麟( 锄) ；4 9 3a m ) 、1 2 1 队嬲( m a ) = 4 6 4r i m ) 的荧光量子产率分别增加8 2 、1 7 5 倍，发射波长蓝移4 0 、6 9n m ，且 其蓝移幅度取决于取代基的种类( 磺酰胺衍生物 磺酸衍生物) 及取代程度( 5 ，7 双取 代衍生物 5 取代衍生物) 。此外，i m p e r i a l i 等将具有较强疏水性的1 - 2 2 连接到肽链上， 实现了对生物体内z n 2 + 的荧光成像检测。 k a w a k a m i 等【4 7 】利用1 ，2 0 二( 苄胺基乙氧基) 乙烷将两个8 - h q 连接起来，合成了化合 物1 2 3 。在甲醇的碱性溶液中，1 2 3 对z n 2 + 的选择性要远优于c d ：2 + ，z n 2 + 导致溶液荧光 显著增强，且与1 - 2 3 形成1 ：1 型络合物。 基于酰胺基喹啉的锌离子荧光分子探针的研究 b r a d s h a w 等 4 8 1 将二氮杂三硫杂1 5 冠5 和二氮杂三硫杂1 6 - 冠5 引入到喹啉分子设 计中，合成了一系列以双8 - h q 为侧链的z n 2 + 荧光分子探针。冠醚环上s 原子的引入不 但可以显著提高探针分子对金属离子识别的选择性，同时还不影响8 - h q 的发光性能。 在甲醇中，与将冠醚基团引入到喹啉7 位的化合物相比，在喹啉2 位引入取代基的1 2 6 、 1 2 7 对z 1 1 2 + 表现出较高的亲和力，这归因于在识别过程中探针分子中的喹啉1 位n 原 子参与了z n 2 + 配位。与连有1 5 冠5 的化合物相比，1 2 5 、1 2 7 分子中的1 6 冠5 的尺 寸较大，尽管其z n 2 + 络合物的稳定性不如前者，但是可以与z n 2 + 形成双金属络合物。z n 2 + 导致1 2 5 、1 2 7 的荧光增强1 0 倍左右，发射波长分别蓝移3 4 、4 1n l n 。光谱滴定曲线 显示，1 2 5 与z n 2 + 形成了2 ：1 型络合物，而1 2 7 则与z n 2 + 形成不止一种结构的络合物， 且与1 2 5 相比，1 2 7 对第二个z 砰+ 的络合能力较弱。 1 - 2 9x = c h 2 ，1 1 = 1 l - 3 0 x = c h 2 。1 1 = 2 1 - 3 1x = s ，r l = 1 1 - 3 2x = s ，n ；2 b a g a t i n 等【4 9 】将两个8 - h q 连接到杯芳烃上，合成了化合物1 2 8 。研究表明，z n 2 + 导致1 - 2 8 的荧光猝灭幅度达8 0 ，且与1 2 8 形成1 ：1 和1 ：2 型混合络合物。实际上， z n 2 + 破坏了杯芳烃与喹啉基团之间的能量转移过程，导致溶液荧光猝灭。尽管z n 2 + 并不 能直接影响化合物的荧光，但值得注意的是1 2 8 可以与z n 2 + 形成l ：1 型6 配位络合物， 即两个溶剂分子与双8 烷氧基喹啉共同络合z n 2 + 时，此时溶剂分子为激发态分子去活化 提供了额外途径。同时，z n 2 + 诱导的构型改变也可能降低杯芳烃与喹啉基团之间的相互 作用。未络合z n 2 + 时，喹啉基团进入到杯芳烃空