（化学工程专业论文）头孢哌酮钠杂质分析方法的研究.pdf

摘要 为了保证人类的健康生活，药品的安全性也越来越得到社会各界广泛关注。头孢哌 酮钠作为世界药市畅销的抗菌素品种被广泛地使用。同时头孢菌素的杂质也会给人类的 健康带来不利影响，为此各国政府对头孢菌素的杂质的含量作出严格的限度。因此，建 立准确测定头孢哌酮钠中杂质的含量的分析方法是非常重要的。 文中建立了顶空- 气相色谱法分析头孢哌酮原粉中残留溶剂的方法，对异丙醇，乙 醇，丙酮三种残留溶剂测定的r s d 均小于3 ；色谱峰的理论塔板数均大于1 5 0 0 0 ：检 出限和定量限分别为o 5 p p m 和2 p p m ，；加标回收率为9 9 1 - - 1 0 0 3 ；线性相关系数r ： o 9 9 6 - 4 ) 9 9 9 1 三个不同柱温测定丙酮的含量，r s d 为1 5 的良好结果，证明此方法适 合分析头孢哌酮中残留溶剂的分析和测定。 文中比较企业内控方法和c p 2 0 0 5 方法测定头孢哌酮原粉聚合物降解产物含量的差 异。使用企业内控方法测定聚合物含量时，聚合物色谱峰为完全分开的3 个单一组分峰。 同时，通过色谱峰纯度角分析，使用企业内控方法分析时降解产物色谱峰专属性较好， 说明企业内控方法测定头孢哌酮原粉聚合物降解产物的合理性。 使用企业内控方法和项空气相色谱法，分析不同工厂生产的头孢哌酮原粉的杂质 水平：美国公司生产的孢哌酮原粉杂质的含量最少，批次间差异为1 一5 ；国内公司生 产的孢哌酮原粉杂质的含量符合c p 2 0 0 5 的各项规定，批次间差异为1 - - 2 0 ；印度公 司生产的孢哌酮原粉杂质较多，批次间差异为9 - 一2 8 。 关键词：头孢哌酮；h p l cg c ；聚合物；降解产物；残留溶剂 a b s t r a c t r e c e n t l y ，p e o p l eb e c o m em o r ea n dm o r ec a ) n c 目 r la b o u tt h es a f e t yo fd m g si no r d e rt om a k eah e a l t h y l i v i n g c e f o p e r z a o n es o d i u mi sw i l d l yu s e d ap o p u l a ra n t i b i o t i ci nt h ew o r l dd r u gm a r k e t h o w e v e r , t h e i m p u r i t yo fc e f o p e r z a o n es o d i u mm a yh a v eb a de f f e c to f ft h eh e a l t ho fh u m a n s oa l lg o v e r m e n t sh a v e e s t a b l i s h e ds t r i c tr e g u l a t i o n so ni m p u r i t yo f e e f o p e r z a o n es o d i u m t h e r e f o r e ，i ti sv e r yi m p o r t a n tt oe s t a b l i s h aa n a l y s i sm e t h o dw h i c hc a na n a l y s et h ei m p u r i t yl e v e lo f c e f o p e r z a o n es o d i u ma c c u r a t e l y 1 nt h i st e x t ，r s do f t h ea s s a yo fi s o p r o p y la l c o h o l ，e t h a n o ia d s o l u t ea n da c e t o n ei sl e s st h a n3 ；t h eu s p p l a t ec o u n ts h o u l db em o r et h a nl5 0 0 0 ；t h ed e t e c t i o nl i m i ti so 5 p p m w h i l et h eq u a n t i t a t i o nl i m i ti s2 p p m ； t h er e l e v a n tc o e f f i c i e n t so fl i n e a r i t yri so 9 9 6 0 9 9 9 ；t h ea s s a y so fa c e t o n e ( r s d 、g e t t i n gu n d e rt h r e e d i f f e r e n tc o l u m nt e m p e r a t u r e sa l e1 5 t h eg o o dr a s h i t sa b o v es h o wt h a tt h i sm e t h o di ss u i t a b l ef o r d e t e r m i n i n gt h ec o n t e n to f t h er e s i d u a ls o l v e n t si nc e f o p e r z a n n es o d i u m t h ed i f f e r e n c eo f t h ea s s a yo f t h ep o l y m e r ，h o m o g e n e i t yi nt h ec e f o p e r a z o n eu s i n gc o m p a n yi n t e r - c o n t r o l m e t h o da n dc p 2 0 0 5m e t h o di sc o m p a r e di nt h et e x t w h e nu s i n gt h ec o m p a n yi n t e r - c o n t r o lm e t h o d t h e p e a k s o f p o l y m e ra r cs e p a r a t e dt ot h r e ei n d i v i d u a lp e a k s a n di t i sm u c hb e t t e rt oa n a l y s et h ep e a ko f h o m o g e n e i t yi nt h ec e f o p e r a z o n eu s i n gc o m p a n yi n t e r - c o n 仃o lm e t h o d i ti sm o r es u i t a b l e t h er e s u l t so f i m p u r i t yo fc e f o p e r z a o n es o d i u mu s i n gc o m p a n yi n t e r - c o n t r o lm e t h o da n dh e a d s p a c e s a m p l e rg ci nd i f i e r e n tf a c t o r i e sa r el i s t e db e l o w ；t h ec e f o p e r a z o n ep r o d u c e di nu s af a c t o r yc o n t a i nt h e l e s ti m p u r i t y ，a n dt h ed i f f e f e n c eb e t w e e nb a t c h e si sl t o5 t h ec e f o p e r a z o n ep r o d u c e di no u rc o u n t r y r e a c ht h er e q u i r e m e n to f t h er e g u l a t i o no f c p 2 0 0 5 。a n dt h ed i f i e f e n c eb e t w e e nb a t c b e si s1 t o2 0 t h e c e f o p e r a z o n ep r o d u c e di ni n d i a nf a c t o r yc o n t a i nt h em o s ti m p u r i t y ，a n dt h ed i f f e r e n c eb e t w e e nb a t c h e si s 9 t 0 2 8 k e yw o r d s ：c e f o p e r a z o n e ；h p l c ：g c ；p o l y m e r ；h o m o g e n e i t y ：r e s i d u a ls o l v e n t 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名： 魏尔军：头孢哌酮杂质分析方法的研究 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名 导师签名 壅! ：叠 p 7 年月竺日 大连理工大学专业学位硕士学位论文 引言 药品的安全性已成为社会各界广泛关注的热点之一。药品的安全性不仅表现在药物 成分的毒副作用上，同时，原料药的杂质含量也会给患者带来不良反应。注射用青霉素、 头孢菌素类等b 内酰胺类抗菌素作为目前临床上最常用的抗感染药物而被广泛使用， 但在临床时常引发过敏性休克反应，以致威胁患者的生命安全。这些过敏性休克反应是 否与这些产品质量有关，一直是广大医药工作者所关注的问题。我国在8 0 年代研究开发 第三代头孢菌素时就把注射用头孢菌素：头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松、头孢他啶的 质量和过敏反应关系的研究列为国家“六五”“七五”攻关项目。 头孢哌酮钠是国家基本药物，属于6 一内酰胺类抗生素，与其他第三代头孢菌素相 比具有抗菌谱广、抗菌作用强、毒性低、疗效好、过敏反应少等优点，所以从上市以来， 在临床上得到广泛的应用。不同公司生产的头孢哌酮钠由于制备工艺的差别会直接影响 其杂质的含量。头孢哌酮的杂质主要包括有机杂质( 降解产物、聚合物等相关产物) 、 残留溶剂和无机杂质。本文将重点研究头孢哌酮聚合物和降解产物以及残留溶剂的含量 分析。 头孢哌酮的结构不稳定，在生产及储存过程中会形成一系列的降解产物和聚合物， 使其失去抗菌活性，甚至产生毒副作用。药物的残留溶剂指在药品生产工艺过程中未能 完全去除的药物生产过程中使用的有机挥发性化合物。由于残留溶剂没有疗效，故所有 的残留溶剂应尽可能的去除，以符合产品规范、g m p 或其他基本的质量要求。特别注意 对生产过程中使用的有毒溶剂的控制。 本文分别使用液相色谱，凝胶色谱两种方法分析头孢哌酮钠的聚合物含量，比较两 种分析方法的差异；使用不同系统的液相色谱方法分析头孢哌酮钠的降解产物。由于头 孢哌酮钠结晶工艺的不同，所带来的残留溶剂的种类和含量的也不同。原有的检测方法 存在检测成分单一的缺点，文中建立一个更加通用的顶空气相色谱分析方法，分析头孢 哌酮钠中的残留溶剂的含量。 为了全面客观的评价不同公司生产的头孢哌酮钠的杂质水平，文中分别选取三个公 司生产的三批头孢哌酮钠，按相同的分析方法测定其中杂质的含量，比较产品的质量。 魏东军：头孢哌酮杂质分析方法的研究 文献综述 随着人们生活水平的提高，人类的健康也越来越得到重视，药品的安全性也成为社会 各界广泛关注的重点之一。药品的安全性不仅表现在药物主要成分的毒副作用上，同时， 原料药的杂质含量的高低，也会给患者带来不良反应。注射用青霉素、头孢菌素类等b 内酰胺类抗菌素也存在类似情况【”，一方面其作为目前临床上最常用的抗感染药物而被 广泛使用；但同时它们在临床上时常引发过敏性休克反应，严重的威胁着患者的生命安 全。这些过敏性休克反应是否与这些产品质量有关，一直是广大医药工作者所关注的问 题【”。 头孢菌素类( c e p h l o s p o f i n s ) 是以冠头孢菌( c o p h a l o s p r i u ma e r e m o n i u m ) 培养得到 的天然头孢菌素c ( c e p h l o s p o r i n c ) 作为原料，经半合成改造其侧链而得到的一类抗生素。 该类抗生素药物自2 0 世纪6 0 年代开始上市至今，已由第一代发展到第三、四代，抗菌 素也陆续扩展，对b 一内酰胺酶的稳定性明显增强，而广泛用于临床【2 1 1 3 】。 我国在8 0 年代研究开发第三代头孢菌素是把注射用头孢菌素：头孢噻肟、头孢哌 酮、头孢曲松、头孢他啶的质量和过敏反应关系的研究列为国家“六五”“七五“攻关 项副4 1 。 头孢哌酮钠【5 1 ( c e f o p e r a z o n es o d i u m ) ，其化学名称为( 6 r ，7 r ) ，3 - 【( 1 甲基1 h 四唑- 5 基) 】7 【( r ) 2 - ( 4 一乙基2 ，3 - 二氧代i 一哌秦碳酰胺基) 一2 - 对羟基苯基- 乙酰氨基 一8 一氧代一5 一硫 杂1 氮杂双环【4 2 o 】辛2 烯2 甲酸钠。 结构式： c 2 1 t 5 - 寸n r h 一掣 广 头孢哌酮钠适用于敏感菌所致的各种感染如肺炎及其他下呼吸道感染、尿路感染、 胆道感染、皮肤软组织感染、败血症、腹膜炎、盆腔感染等。对各种g + 球菌包括产生 1 3 内酰胺酶和不产生b 内酰胺酶的金黄色葡萄和肠道g - 杆菌及绿脓杆菌有显著的抗菌 作用主要通过细菌繁殖起抑制敏感细菌细胞壁粘肽的生物合成而达到杀菌作用。为此了 解头孢哌酮钠的合成工艺，寻找头孢哌酮钠中杂质的产生原因，对于我们建立科学的检 验杂质的分析方法是十分必要的。 2 八h 大连理工大学专业学位硕士学位论文 1 1头孢哌酮钠的合成工艺： 头孢哌酮钠作为常用的抗生素原料药，存在着与其他原料药共同的特点。原料药是 药品的主要组成部分，原料药的制备是药品生产的重要环节，是药品研究和生产的基础。 原料药的制备工艺【6 】可以为药物的质量研究提供信息。制备工艺可以为质量研究提 供杂质信息，质量研究必须基于制备工艺进行，根据制备工艺引入的杂质情况，进行方 法专属性的研究，这样的方法才能有效地检出杂质，质量标准也必须根据工艺中可能引 入的杂质情况，制订相应的控制项目和限度，质量标准才能有效的控制产品的质量。 原料药制备工艺差异的几种情况： ( 1 ) 工艺路线的差异由于采用不同的起始原料、不同的试剂，使得制备工艺发生 差异，这类差异在工艺研究中占有主要方面。 ( 2 ) 所用起始原料、试剂、有机溶剂的规格不同，在工业生产时，由于供应商的 差异，使得起始原料或试剂的质量发生变化，因此需要选择合适的供应商。 ( 3 ) 工艺路线的条件发生差异由于工业生产的需要，反应容器的差异，引起搅拌 条件、加热条件、反应时间等的差异，势必影响到反应条件的差异，如，采用不同的搅 拌条件会影响反应进程或结晶的过程。 根据国内外综合报道，头孢哌酮的合成主要包括3 - ( ( 1 甲基一i h - 4 唑) 一5 疏基) 一7 氨基头孢霉棕酸7 - a c a h c j 合成( i ) 头孢哌酮酸的合成( i i ，i ) 以及头孢哌酮钠的 合成( ) 等3 步反应，7 - a c a - h c i 合成主要有弱碱催化法【7 - 8 】、三氟化硼催化法【9 1 、浓硫 酸催化法0 】以及三甲基硅碘催化法】，在本文中使用的7 - a c a h c i 合成是采用收率较 高的三氟化硼催化法，并采用环保的碳酸二甲酯( d m c ) 作为反应溶剂【l ”。头孢哌酮酸 的合成( i ii i i ) 一主要有：混合酸酐法【13 1 、酰氯法【14 1 、硫酯、法【1 51 和7 - 氨基取代分布缩合 法l l ”。其中酰氯法比较经济，国内多用此方法合成。头孢哌酮钠的合成( ) 采用碳酸 氢钠法【埔j ，该工艺线路简单、环保，反映条件温和，适合工业化生产，收率高，总收率 达到5 5 。 具体合成路线如下： 3 魏东军：头孢哌酮杂质分析方法的研究 i + i i d m a c + p o c l 3 。+ i 图1 1 头孢哌酮钠合成路线 f i g u r e1 1 t h es y n t h e t i cr o u t eo f c e f o p e r a z o n es o d i u m 头孢哌酮成盐方法有3 种，冻干法、溶析结晶法和反应结晶法。冻干法是将头孢哌 酮酸与钠的碱性化合物反应后的产物( 通常为水溶液) 直接放入冻干杌中，通过真空冷 冻干燥，将水分去除，从而得到产品。该方法由于只能得到无定型的头孢哌酮钠粉末， 质量较差，属于日渐淘汰的方法。溶析结晶法是将溶质溶解于水或其他有机溶剂中，然 后向结晶体中加入某种溶剂使溶质在原溶剂中的溶解度降低，从而使溶质快速析出的结 晶方法。头孢哌酮钠溶析结晶法主要由两步组成，首先是头孢哌酮酸与成盐剂反应。然 后在反应得到的头孢哌酮钠溶液中加入溶析剂使其析出结晶。该方法由于得到的头孢哌 酮钠为晶体产品，晶形针状，质量和粒度较好而被广泛使用。反应结晶法结晶时由于结 晶终点p h 值不易控制，造成产品质量波动较大。对于头孢哌酮钠溶媒成盐溶析结晶法 4 一u 喵 大连理工大学专业学位硕士学位论文 法中，主要乙醇、丙酮、醋酸乙酯、甲醇等。不同的溶媒所带来的残留溶剂不同，根据 不同的溶剂的毒性或对环境的影响不同，残留溶剂的限度也不同。表1 1 【1 9 1 为主要溶剂 的毒性及残留浓度限度： 表1 1 残留溶剂浓度限度 t a b l e l 1t h ec o n c e n t r a t i o nl i m i to f r e s i d u a ls o l v e n t s 盗壶! j这廑限制f e 凹2渣壶9 娄型 苯21 氯仿 甲醇 甲苯 乙醇 丙酮 醋酸乙酯 异丙醇 6 0 3 0 0 0 8 9 0 5 0 0 0 5 0 0 0 5 0 0 0 5 0 0 0 其中：1 为应避免的溶剂 2 为应限制的溶剂 3 为低毒溶剂 在生产过程中应尽可能使用低毒溶剂作为溶媒使用。 1 2 头孢哌酮钠残留溶剂的分析方法研究 保证药品安全、有效、质量可控是药品研发和评价应遵循的基本原则，其中，对药 品进行质量控制是保证药品安全有效的基础和前提。为达到控制质量的目的，需要多角 度、多层面来控制药品质量，也就是说要对药物进行多个项目测试，来全面考察药品质 量。 药物中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产中，以及制剂制备过程中使用的，但 在工艺过程中未能完全去除的有机溶剂。按有机溶剂的毒性和对环境的危害，i c h 将有 机溶剂分为避免使用、限制使用、低毒和毒性依据尚不足四种情况。因残留溶剂会影响 产品的安全性，故需对其进行研究。 1 2 1头孢哌酮钠残留溶剂常用的分析方法 利用气相色谱顶空技术测定药品残留溶剂在国内外已经有很多成功的例子 2 0 - 2 2 】， 魏东军：头孢哌酮杂质分析方法的研究 u s p 2 8 版f 2 3 】、b p 2 0 0 5 版【2 4 1 、e p 5 o 版【2 5 1 、j p x i v 版【矧及中国药典2 0 0 5 版都收载了顶空气相 色谱法测定药品中的有机溶剂残留量。其优点是可以使残留溶剂气化后进样，浓度与溶 液相比有很大增加。进样室在较低温度下操作，可避免组分分解。顶空进样也可大大减 少溶解样品的溶剂和样品本身对色谱系统带来的干扰和污染，缩短分析时间，增加色谱 柱寿命，提高样品的重现性。而其他现代分析手段的应用，如比色法、h p l c 法、核磁共 振法、热重分析法以及多种方法联合应用，是对气相色谱法的补充，也是残留溶剂测定新 方法的有益尝试。 对于头孢哌酮钠使用不同的溶媒成盐法，主要是使用乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。 其中，以丙酮作为结晶溶媒的方法应用最为广泛。有关分析头孢哌酮钠中残留溶剂的 分析方法目前主要有： 一是在实验室没有气相色谱顶空进样装置的条件下，常采取将药物中的残留溶剂先 溶解再直接进样的的方法分析头孢哌酮钠中残留溶剂。用此方法分析时，需要进样的绝 对进样量大以弥补检测器灵敏度的不足，操作也简便易行。如使用直接进样气相色谱分 析头孢卡品酯中有机溶剂残留量【38 】同样可以取得良好的结果，同时此方法存在的缺点是 污染进样口和色谱柱，需要及时清洗。另外由于进样量大，除溶剂峰响应值大，分析时间 较长外，还有头孢哌酮的分解产物和溶剂杂质峰干扰测定。一般需选用程序升温快速除 去溶剂并选用纯度较高的溶剂。 二是在使用气相色谱顶空进样装置的条件下，选用填充柱分离分析头孢哌酮残留丙 酮。在此方法中使用顶空进样装置。近年来顶空进样法的应用越来越多，其优点是可以 使残留溶剂气化后进样，浓度与溶液相比有很大增加。进样室在较低温度下操作，可避免 组分分解。顶空进样也可大大减少溶解样品的溶剂和样品本身对色谱系统带来的干扰和 污染，缩短分析时间，增加色谱柱寿命，而且提高样品的重现性【2 7 1 。同时在头孢类产品 的检测过程中被广泛应用。使用顶空气相色谱法测定头孢曲松钠【2 引、头孢唑肟钠、头 孢呋辛钠【2 9 1 、头孢唑肟钠【3 0 】多种溶剂残留量，都取得了很好的效果。 此方法同时使用填充色谱柱，填充色谱柱价格便宜，易得，一直占据溶剂残留量检测 的主导地位。在紫杉醇原料药中有机溶剂残留量的气相色谱分析中，应用g d x 4 0 1 填充柱 同时检测甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷，方法准确可靠【3 ”。测定盐酸莫索尼定有机溶剂残 留量时以正丙醇为内标，用g d x 一4 0 1 填充柱测定乙醚和异丙醇的残留量，方法灵敏、准 确、可信【3 ”。用g d x 一4 0 1 填充柱测定盐酸土霉素中残留甲醇，结果证明方法简单可靠 p ”。用g d x 一4 0 1 填充柱、用恒温条件建立同时测定中国药典规定的7 种溶剂的测定方 法，方法分离度较好，准确可靠【3 4 】。但是柱效较低，只有5 0 0 i 0 0 0 左右，分离复杂样品 的能力差。由于填充柱的分辨率、灵敏度较低，造成分析的残留溶剂的种类比较单一的 6 大连理工大学专业学位硕士学位论文 缺点，对于沸点相近的残留溶剂多组分分离的效果较差。在测定心痛定中两种残留溶剂 时就分别用两种色谱条件，比较麻烦【”】。近年来，毛细管柱应用越来越多，对填充柱有 取而代之的趋势。特别是近两年，文献报道关于残留溶剂测定的文章中，用毛细管柱测定 的约占总数的9 0 ，填充柱只占1 0 ，由此可见其趋势。 中国药典c p 2 0 0 5 z 部、u s p 2 8 版、b p 2 0 0 5 版、e p 5 0 版、j p v 版，使用气相色谱顶 空进样装置分析头孢哌酮残留丙酮，该方法使用不同型号毛细管柱色谱柱，分析头孢哌 酮残留丙酮的含量。此方法使用毛细管色谱柱作为分离系统；毛细管柱的理论塔板数约 为l o 万左右，与填充柱相比柱效和灵敏度均要高的多，对复杂和微量残留溶剂的分析能 力有极大的提高，所以选择毛细管柱一般都能解决分离问题。其中柱口直径为0 1 5 3 m m 的 大口径毛细管柱因其柱容量大尤其应用广泛。姚倩、李章万、张强等用几种大口径毛细 管柱，以药物合成中常用的1 6 种有机溶剂为研究对象，建立检查残留溶剂的方法，并考 察不同极性的色谱柱( h p 一1 ，h p 一5 ，h p 一2 0 m ) 及不同提取溶( 水，o l d f ，d m s o ) 对 分离与检测的影响。在雌激素原料残留溶剂的检测中，除甲醇和乙醇外，其它1 4 种溶剂均 在检出限度以下，方法简便灵敏，准确度高，说明本方法适用于常规药物中溶剂的检查。 另外有许多应用成功测定毛细管柱检测头孢类产品的方法。如前文提到的测定头孢曲松 钠中、头孢唑肟钠头孢呋辛钠、头孢唑肟钠多种溶剂残留量均顶空进样系统配合毛细 管柱使用的。 由于填充柱在分析头孢哌酮丙酮残留时与使用毛细管柱均能取得较好的效果，因此 文中仍将使用气相色谱顶空进样填充柱分离分析方法对三个公司生产的格三批头孢哌 酮钠残留溶剂物的含量进行分析。为了使分析方法具有更强的通用性，文中将使用气相 色谱顶空进样毛细管柱建立并验证一个适用于分析多种不同溶媒结晶的头孢哌酮残留 溶剂的方法。 1 2 2 头孢哌酮残留溶剂分析方法的建立 对于头孢哌酮钠使用不同的以丙酮作为结晶溶媒的方法应用最为广泛，因此各国 药典都明确规定的头孢哌酮钠残留丙酮的分析方法和限度。但是，根据生产的不同情 况，不同公司在结晶头孢哌酮钠时会加入少量的其他溶媒提高结晶效果，如果国内苏 州东瑞结晶头孢哌酮钠时会加入少量的异丙醇。为了能够更全面客观检测头孢哌酮中 所有残留溶剂的含量，此需要建立一个可以同时测定多种溶媒的检测方法。 残留溶剂的测定一般采用气相色谱法，推荐使用毛细管色谱柱一顶空进样系统， 当然也可以使用普通填充柱，溶液直接进样方法。对不宜采用气相色谱法测定的含氮 7 魏东军：头孢哌酮杂质分析方法的研究 碱性化合物，如n 一甲基吡咯烷酮等可采用其它方法，如离子色谱法等。目前，关于头 孢曲松钠、头孢地嗪钠【3 6 】、盐酸头孢吡膨3 饥，头孢卡品酯【3 8 】中多种残留溶媒的检测， 均采取了毛细管色谱柱一顶空进样的气相分析方法，取得了很好的检验结果。本文将 选用毛细管色谱柱一项空进样系统测定头孢哌酮中残留溶剂的含量。 测定残留溶剂主要从以下几个方面考虑：确定被测的有机溶剂、选择合适的色谱 柱、制备供试品溶液和对照品溶液、选择合适的进样方法和满足检测灵敏度要求的检 测器。下面分别进行介绍： 1 、确定被测的有机溶剂 根据头孢哌酮制备工艺可以确定被测有机溶剂的范围。 表1 2 头孢菌素气相色谱条件 t a b l e l 2t h ec o n d i t i o nf o rg co f c e p h a l o s p o r i n s 由表1 2 可以分析被测头孢菌素的残留溶剂通过制备工艺可以确定被测有机溶剂的 范围，头孢哌酮制备过程中通常使用丙酮、乙醇、异丙醇作为重结晶用溶剂，因此在建 立头孢哌酮残留溶剂分析方法时应同时检测以上三种溶剂残留。 选择合适的色谱柱 按照相似相溶的原理选择色谱柱。毛细管柱有极性柱、非极性柱、弱极性柱和中等 极性柱。填充柱有高分子多孔小球或涂渍适宜固定液的填充柱。 大连理工大学专业学位硕士学位论文 表1 3 头孢菌素气相色谱柱 t a b l e l 3t h ec o l u m nf o rg co f c , e p h a l o s p o r i n s 由表1 3 可以分析被测头孢菌素的多种残留溶剂，因为不同溶剂间极性的差异通常 选用中等极性毛细管色谱柱。在建立头孢哌酮的残留溶剂分析方法时，我们也将选用中 等极性色谱柱毛细管柱分离样品。 柱温的选择 柱温对分离起关键作用，视所测组分和所选用色谱柱而定，一般用固定温度分析， 即恒温色谱( i g c ) ，柱温范围在5 0 2 0 0 左右，根据样品与残留溶剂的分离情况而定。 对于沸程很宽、残留溶剂种类较多的样品可选用程序升温的办法( p t g c ) 。 由表1 2 可以分析被测头孢菌素的残留溶剂通常选用4 0 或4 5 的柱温，对于丙酮、 乙醇、异丙醇等溶剂取得了很好的分离效果，在建立头孢哌酮的残留溶剂分析方法时， 我们选用4 0 的柱温。其余温度根据表1 2 ，分别进样口温度设定为2 0 0 、检测器温 度为2 5 0 。载气选用分离效果更好的氦气。 检测器的选择 由表1 3 可以分析对于头孢菌素中丙酮、乙醇、异丙醇等残留溶剂使用f i d 检测器是 正确的选择。 供试品和对照品的制各 顶空进样方法通常以水为溶剂，因为头孢哌酮钠和丙酮、乙醇、异丙醇在水中完全 溶解，因此样品和对照品均以水为溶剂的制备。 9 魏东军：头孢哌酮杂质分析方法的研究 1 2 3 头孢哌酮残留溶剂分析方法的论证 一般地，每一测试项目可选用不同的分析方法，为使测试结果准确、可靠，必须对 所采用的分析方法的科学性、准确性和可行性进行验证，以充分表明分析方法符合测试 项目的目的和要求，这就是通常所说的对方法进行验证【3 8 i 。 方法验证的目的是判断采用的分析方法是否科学、合理，是否能有效控制药品的内 在质量。原则上每个检测项目采用的分析方法，均需要进行方法验证。方法验证的内容 应根据检测项目的要求，结合所采用分析方法的特点确定。 方法验证涉及的三个主要方面【3 9 】：需要验证的检测项目；分析方法；验证内容。其中 验证内容包括方法的线性、范围、精密度、检测限、定量限、耐用性和系统适用性等。 根据检验方法的内容不同，需要验证的内容不同。具体见表1 4 表1 4 检验方法验证内容 t a b l e l 4 t h e c e r t a i n o f v a l i d a t i o n f o r t e s t m e t h o d 分析方法的类型鉴别杂质检查含量分析；溶出度 亟目定量阻匿捡捌盆量z 筮俭 准确度 一+一 + 精密度 重复性 一+一十 中间精密度 一+ + 专属性 一+一 十 检测限 一+一+ 定量限 一 + 一 + 线性 一 +一十 菹国=!=! 根据表1 4 同时参考头孢曲松钠、头孢地嗪钠、盐酸头孢吡肟，头孢卡品酯的分析方法 残留溶剂检查方法的验证过程，头孢哌酮钠的分析方法验证应包括以下方面： 系统适用性试验 l o 大连理工大学专业学位硕士学位论文 表1 5 头孢菌素气相色谱重复性 t a b l e l 5t h e p r e c i s i o nf o r g co f c c p h a l o s p o r i n s 重复性 头孢地嗪钠 头孢曲松钠 头孢卡品酯 盐酸头孢毗肟 丙酮r s d = 4 8 。乙腈r s d = 4 1 ，二氯甲烷r s d - - 4 9 r s d 2 6 o 9 9 。附回归方程、相关系数和线性图 表1 7 头孢菌素气相色谱线性关系 t a b l e l 7t h el i n e a r i t yf o rg co f c e p h a l o s p o n n s 线性关系 头孢地嗪钠 头孢曲松钠 头孢卡品酯 盐酸头孢吡肟 0 9 9 8 r 0 9 9 9 0 9 9 9 0 o 9 9 90 0 9 9 6 r 泣。 气f=毛。 。0 o 。k 耖 大连理工大学专业学位硕士学位论文 乙腈：8 7 6 m i 水调整为2 2 乙腈：7 8 水；使用m i c r o b o n d a p a kc 1 8 色谱柱；分别使用 t 1 5 5 1 b ，t 1 5 5 1 e ，t 1 5 5 1 f ，氨基烷酸标准品外标测定舒巴坦钠头孢哌酮钠中降解产物的 含量。对于t 1 5 5 1 b ，t 1 5 5 1 f ，氨基烷酸的检验取得了良好的效果【5 8 】。但对于t 1 5 5 1 e 的 检验，由于t 1 5 5 1 e 与头孢哌酮的主峰无法完全分开，因此无法检出t 1 5 5 1 e 。 目前在一些企业内部，使用中国药典2 0 0 5 版分析头孢哌酮含量的方法，通过调 整流动相中乙腈的比例、色谱柱的类型改变，可以的得到一系列单一组分响应值较高的 降解产物色谱吸收峰，通过其他分析方法得到这一系列峰的分子结构。同时分别使用 t 1 5 5 1 b ，t 1 5 5 1 e ，t 1 5 5 1 f 标准品外标测定头孢哌酮钠中降解产物的含量，对于t 1 5 5 1 b ， t 1 5 5 l e ，t 1 5 5 1 f 含量进行测定。该方法经过具体的论证过程，所有测试项目均符合i c h 的有关规定。文中将分别用此方法和中国药典的分析方法对头孢哌酮聚合物的含量进 行分析，从中找出其中的相互关系和差异，以达到全面客观的判断产品的质量水平的目 的。 1 5 论文的立题依据 根据前面的查询和分析，在分析头孢哌酮钠的杂质过程中，可以采取不同的分析方 法测定结果。头孢哌酮残留溶剂使用气相色谱分析，头孢哌酮聚合物可以使用凝胶色谱 和高效液相色谱分析、头孢哌酮降解产物使用高效液相色谱分析。对于头孢哌酮残留溶 剂的分析，目前仅局限于对头孢哌酮残留丙酮的测定，而对于结晶过程中使用的其他溶 剂缺乏通用的测定方法。文中将建立毛细管柱顶空进样气相色谱系统分析头孢哌酮多种 残留溶剂的方法。同时对方法的线性、范围、准确度、精密度、检测限、定量限、耐用 性和系统适用性等进行验证。保证方法的科学性，准确性。关于头孢哌酮聚合物和降 解产物分析也存在几种方法同时使用的现象。但对于不同方法之间的差异以及这些差异 对检验结果造成的偏差缺乏研究。为了更客观、全面地反映头孢哌酮钠杂质的质量，文 中将分别选取两种方法对头孢哌酮聚合物和降解产物分析，通过比较差异，从选择出更 科学地分析头孢哌酮聚合物和降解产物的方法。 1 7 魏东军：头孢哌酮杂质分析方法的研究 第二章：气相色谱测定头孢哌酮钠残留溶剂的方法研究： 2 1 气相色谱测定头孢哌酮钠残留溶剂性方法的研究： 随着科学技术的发展，毛细管柱在气相色谱分析过程中越来越被广泛的使用。在检 测残留溶剂过程中，发现不同工艺使用不同的溶媒萃取头孢哌酮，所残留的有机溶剂不 同，原有的检验方法仅检验丙酮一种化学溶剂，存在检测成分过于单一，通用性不强的缺 点。在本节中将重点介绍对新建使用毛细管柱测定头孢哌酮钠残留溶剂通用性方法的验 证过程。 2 1 1 实验部分： 实验仪器：1 g 1 8 8 8 顶空进样系统 a g i l e n t 公司 2 6 8 9 0 气相色谱仪 a g i l e n t 公司 3 d 8 一w a x3 0 m x 0 53 m i n x l 0 u m 4 2 0 m l 顶空瓶 5 m x 5 天平 m e t t l e r 公司 6 x s 2 0 5 d u 天平m c t t l e r 公司 气体：1 商纯氮日酸光明气体 2 高纯氦北京氦普气体 3 高纯氢日酸光明气体 4 压缩空气 试剂：1 丙酮色谱纯沃凯公司 2 异丙醇色谱纯沃凯公司 3 乙醇色谱纯 沃凯公司 4 四氢呋喃色谱纯沃凯公司 原料药：国内某公司生产头孢哌酮原料 实验条件：1 积分条件： 斜率l 峰宽004 最小峰面积0 5 最小峰高0 3 大连理工大学专业学位硕士学位论文 以上积分条件在保证最小检出限的情况下，可做适当调整 2 色谱条件： 进样器温度：2 0 0 c 载气：h e 流速：5 o m l m i n 分流比：i 0 ：i 恒流方式 柱温：4 0 保持l o m i n 检测器：2 5 0 3 顶空条件： 压力：瓶压：2 0 0p s i 载气压力：8 2 p s i 温度：炉温：8 0 传输线温度：9 5 l o o p 温度：9 5 时间：g c 循环时间：i i m i n 进样时间：1 o m i n 瓶平衡时间：3 0 m i n l o o p 平衡时间：0 2m i n l o o p 充满时间：0 8m i n 压力平衡时间：0 5m i n 实验步骤：丙酮对照品i m l 异丙醇对照品i m l + h 2 0 一l o o m l( 标准品储备液) 乙醇对照品i m l 四氢呋喃对照品i m l + h 2 0一l o o m l ( 内标储备液) ( 内标储备液) i m l + ( 标准品储备液) i m l + h 2 0 一l o o m l ( 标准液) 检测过程：取5 o m l 内标溶液于2 0 m l 顶空瓶中，密封为空白。取5 o m l 标准液于2 0 m 顶空瓶中，密封 精密称定头孢哌酮钠0 4 9 放置于l o o m l 容量瓶中，加内标液稀释至刻度， 取5 e l 于2 0 m l 顶空瓶中密封备用。 1 9 魏东军：头孢哌酮杂质分析方法的研究 2 1 2 重复性； 连续进六针标准溶液，分别计算的异丙醇，乙醇，丙酮、四氢呋喃峰面积及异 丙醇，乙醇，丙酮蜂面积对四氢呋喃比值的相对标准偏差( r s d ) ： ( ) ”r l a l da l | o m 甜咐 m n 幢e s s a m p l e n a m es t d ：v 州1 n i e c 【m1 ：c h a f i n e ih p 8 8 9 00 1 2 , d a t ea c q u i r e d2 0 0 7 4 1 81 40 0 ：0 7 s a m p l e n a m es t d v i a i2 i n j e c t l o n1 c h a n n e ih p 6 8 9 0c h 2 d a t ea c q u i r e d2 0 0 7 4 1 814 1 12 9 一s a m p l e n a m e s t d v i a i3 1 n j e c t i o n l c h a n n e i h p 6 8 9 0 c h 2 d a t e a c q u l r e d 2 0 0 7 4 1 8 14 ：2 25 2 一$ e m p l e n a m e s t 院v m l 4 i n l e c t o n l ：c h a n n e h p 6 8 9 0 c h 2 d a t e a c q u i r e d 2 0 0 7 4 - 1 8 43 4 1 s s a m p l e n a m es t d v l a l 6 i n j e c t i o n l c h a n n e i h p 6 8 9 0c h 2 0 a t e a c q u i r e d2 0 0 7 4 1 8 1 45 70 0 一s a m p l e n a m es t d ；v i 捌5 i n j e c t i o n1 ：c h a n n e ih p 6 0 9 0c h 2 ：d a t e a c q u e d2 0 0 7 4 1 81 4 ：4 爱4 8 图2 1头孢哌酮残留溶剂系统适虑性谱图 f i g u r e2 1c h r o m a t o g r a mo f p r e c i s i o nf o rt h er e s i d u a ls o l v e n t si nt h ee e f o p e r a z o n e 表2 1头孢哌酮残留溶剂各组分重复性数据 t a b l e t 4 1d a t ao f p r e c i s i o nf o rt h er e s i d u a ls o l v e n t si nt h ec e f o p e r a z o n s 甜把h 越瞻n a m er ta r e ah 确i b t 捌 捌 一 d 一 饥 j s h 搬蚺m n a m e r ta r e a圳 2 3 3 2 口口 dt l d a d m i r e9 2 t 72 o j 大连理工大学专业学位硕士学位论文 8 目n 嘲叫嘬黼n m目 h e i 琳 口5 0 7 h q _ 口p _ 村d 8 a m a 嘲a t ”w r e ah 嘲i t 5 1 由表2 1 的数据计算出：分别按外标法内标法各组分保留时间，色谱峰面积的相对 标准偏差( r s d ) ： 表2 2 头孢哌酮残留溶剂各组分重复性结果 t a b l e t 2 2r e s u l to f p r e c i s i o nf o rt h er e s i d u a ls o l v e n t si nt h ec e f o p c r a z o n 气相色谱分析方法验证要求：以内标法测定时，被测物与内标物峰面积之比的相对 标准偏差( r s d ) 应不大于5 ；以外标法测定时，所得被测物峰面积的相对标准偏差( r s d ) 应不大于l o 。此方法检测出的各组分以内标法测定时，检测结果符合验证要求。以外 标法测定时，检测结果也符合验证要求，为今后方法的拓展提供的数据基础。 2 1 3 理论塔板数拖尾因子与分离度： 为了全面地评估色谱条件，色谱柱的合理性，将分别按美国药典方法测定异丙醇， 乙醇，丙酮、四氢呋喃色谱峰的理论塔板数，拖尾因子与分离度。 2 l 魏东军：头孢哌酮杂质分析方法的研究 h k f s 呻i 醇i 嘲e = t o tv 酬5 ：t 日e c t i o n l ：c h a n n e l t - i p 6 8 9 0 c h zd e t e a c c e d 2 0 0 7 - 4 - 1 8 1 4 4 5 ：4 8 图2 2 头孢哌酮残留溶剂柱效谱图 f i g u r e4 3 c h r o m a t o g r a mo f c o l u m ne f f i c i e n c yf o r t h er e s i d u a ls o l v e n t si nt h ec e f o p e r a z o n e 表2 3头孢哌酮残留溶剂各色谱峰梓效结果 t a b l e t 4 3r e s u l to f c o l u m ne f f i c i e n c yf o rt h