（市政工程专业论文）多酚植物在生物浮岛中的抑藻作用研究.pdf

北京建筑t 程学院硕士学位论文摘要 摘要 目前，全球水体富营养化现象愈米愈严重，利用植物化感作用修复富营养化水体具有重要意 义。本文以富营养化水体中的优势藻种斜生栅藻和铜绿微囊藻为研究对象，选用一种多酚含量高 的植物水杨梅，以生物浮岛的形式种植富营养化水体中，以研究其对水体中藻类的影响，主 要结果有： ( 1 ) 通过定性和定量试验验证水杨梅体内含有大量多酚，并能够从根部分泌。 ( 2 ) 覆盖试验和营养试验结果发现，即使覆盖组和营养组与对照组具有相同的光照和营养条 件，覆盖组和营养组的两种藻细胞的生长量、叶绿素a 含量仍远远低于各自对照组，且覆盖组和 营养组的两种藻类还出现细胞变形、细胞膜被破坏等现象，表明覆盖组和营养组的藻细胞已无法 进行正常的生长代谢，说明覆盖组和营养组的活体水杨梅对两种藻类的生长有一定的抑制作用。 ( 3 ) 不同浓度的水杨梅种植水对斜生栅藻的生长有一定促进作用，对铜绿微囊藻的生长影响 不大。 ( 4 ) 不同浓度的干体水杨梅浸提液对两种藻类都有较好的抑制作用，当干体水杨梅投加浓度 达到l o g l 时，对斜生栅藻和铜绿微囊藻的抑制率分别为9 2 8 和9 6 6 。 ( 5 ) 活体水杨梅除了对斜生栅藻和铜绿微囊藻有抑制效果外，对景观水体中的非单一藻种也 有较好的抑制效果，最大抑制率可以达到6 1 7 。 关键字：水杨梅；多酚；斜生栅藻；铜绿微囊藻；化感作用； 北京建筑工程学院硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t a tp r e s e n t ，a st h eg l o b a lp h e n o m e n o no fe u t r o p h i c a t i o ni sg e t t i n gw o r s e ，i ti sl a r g e l ys i g n i f i c a n tt o r e m e d ye u t r o p h i cw a t e rw i t ha l l e l o p a t h yo fp l a n t s w i t hs c e n e d e s m u so b i q u u sk u t z a n dm i c r o c y s t i s a e r u g i n o s ak u t z i ne u t r o p h i cw a t e rf o rr e s e a r c hi nt h i sp a p e r , ap l a n tw i t hh i g hc o n t e n to fp o l y p h e n o l s - g e u ma l e p p i c u mj a c q w a sc h o s ea n dc u l t i v a t e di nt h ef o r mo ff i o a t i n gi s l a n di ne u t r o p h i cw a t e r t h e i m p a c t i o no ft h i sp l a n t o na l g a e si nw a t e rw a ss t u d i e d ，a n dt h em a i nr e s u l t so b t a i n e di nt h i sw o r k i n c l u d e d ： ( 1 ) b ym e a n so fq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v et e s t s ，i tw a sc o n v i n c e dt h a tl a r g ea m o u n t so fp o l y p h e n o l s w e r ef o u n di ng e u ma l e p p i c u mj a c q a n ds e c r e t e df r o mt h er o o t s ( 2 ) t h er e s u l t so fc o v e r a g ea n dn u t r i t i o nt e s ts h o w e dt h a t ，e v e ni ft h ec o v e r a g eg r o u pa n dt h en u t r i t i o n g r o u ph a dt h es a m el i g h ta n dn u t r i t i o n a lc o n d i t i o n sa st h ec o n t r o lg r o u p ，t h eg r o w t hr a t ea n dt h ec o n t e n t o fc h l o r o p h y l lao ft h et w ok i n d so fa l g a lc e l l si nt h ef o r m e rt w og r o u p sw e r em u c hl o w e rt h a nt h a ti n t h el a t t e rg r o u p m o r e o v e r , t h et w ok i n d so fa l g a lc e l l s i nt h ef o r m e rt w og r o u p sa l s oa p p e a r e ds u c h u n d e s i r a b l ep h e n o m e n aa sc e l ld e f o r m a t i o n , c e l lm e m b r a n ed e s t r u c t i o na n ds oo n , ，w h i c hw a ss h o w e d t h a tt h ea l g a lc e l l sc o u l dn ol o n g e rc a r r yo u tn o r m a lg r o w t ha n dm e t a b o l i s m t h i si l l u s t r a t e dt h a tt h e l i v i n gg e u ma l e p p & u mj a c q c o u l di n h i b i tt h eg r o w t ho f t h et w ok i n d so f a l g a et os o m ed e g r e e ( 3 ) d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fg e u ma l e p p i c u mj a c q p l a n tw a t e rc o u l dp r o m o t et h eg r o w t ho f s c e n e d e s m u so b i q u u sk u t z t os o m ee x t e n t ，b u th a dl i t t l ee f f e c to nt h eg r o w t ho f m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a k u t z ( 4 ) d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fw a t e re x t r a c t sf r o mt h eb o d yo fg e u ma l e p p & u mj a c q c o u l di n h i b i t t h eg r o w t ho ft h et w ok i n d so fa l g a e w h e nt h ed o s a g eo ft h eb o d yo fg e u ma l e p p i c u mj a c q w a s10 9 l t h e i n h i b i t i o nr a t e sf o rs c e n e d e s m u so b i q u u sk u t z a n dm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s ak u t z w e r e9 2 8 a n d9 6 6 ( 5 ) i na d d i t i o nt ot h ei n h i b i t o r ye f f e c to ft h el i v i n gg e u ma l e p p i c u mj a c q o ns c e n e d e s m u so b i q u u s k u t z a n dm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s ak u t z ，i th a dag o o di n h i b i t o r ye f f e c to nt h ea l g a et h ew a t e ri nt h e l a n d s c a p ew a t e r , a n dt h em a x i m a li n h i b i t i o nr a t ew a su pt o61 7 k e y w o r d s ：g e u ma l e p p i c u mj a c q ；p o l y p h e n o l s ；s c e n e d e s m u so b i q u u sk u t z ；m i c r o c y s t i s a e r u g i n o s ak u t z ； 北京建筑工程学院硕士学位论文 声明 北京建筑工程学院 硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任 何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要 贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明 的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：虢 日期：小加年月多1 9 授权书 本人同意将所著硕士学位论文多酌榔征蚴潞刍 幸铺押燕作用研蹙 著作权中的数字化制品复制权、信息网络传播权和汇编权授权业 立建筑王猩堂院硒窒生处行使。上述授权的范围包括：j 匕立建篁 王猩堂院自己使用或委托他人使用。 本人保证为该论文作者，依法享有著作权，并愿承担因著作 权问题引起的责任。 童匕宝建篁王猩堂院须依照我国著作权法的有关规定，充分尊 重本人享有的著作权权利( 包括获酬权) 。 本授权有效期年。 论文作者：否僵 ( 签章) d ，o 年月o 日 作者联系方式： 地址：桕卉掷展心雇赂7 刍邮编：m 争笋 电话： d 口一g 乡寥，寥7传真： 手机： f 多弘客寥7 s 牛67 电子信箱：f ，d 9 ，门明矽钐 纱阳 北京建筑t 程学院硕士学位论文 1 绪论 1 绪论 1 1 国内外水体富营养化研究概况 近年来，随着世界经济快速发展，地球生态环境也发生了严重的变化。由于人为因素导致水 体过量接纳了氮、磷等营养物质，出现了有害藻类恶性繁殖、水体透明度降低、水质恶化、大量 生物死亡等现象，这些严重破坏了水体生态平衡，引发水体富营养化问题。我国是一个多湖泊国 家，许多知名湖泊如巢湖、滇池、太湖等都已出现了不同程度的水体富营养化，它们的污染严 重影响了当地人民的正常生活。水质富营养化不仅使湖泊及其沿岸的生物多样性减少，而且还会 使一些对人类有益的物种消失。因此，水体富营养化的修复、治理刻不容缓。 1 1 1 水体富营养化简介 水体富营养化的出现主要是由于人类的活动使水体中营养物质( 如氮、磷等) 过量增加，引 起水体中藻类及其他水生生物恶性繁殖，致使整个水体生态系统失衡，因而导致水体污染的现象 2 1 。其结果是破坏水体生态系统的结构和功能，影响水体的感官性状，影响人们日常供水的水质 【3 巧】；严重时还会发生“水华”现象，严重影响了江河、湖泊等的水环境及其生态系统。 1 1 2 国内外湖泊富营养化状况 富营养化已经成为一个全球性的重大水环境问题，联合国环境规划署( u n e p ) 的一项水体 富营养化调查结果表明睁7 l ：全球3 0 - 4 0 的水体已经遭受了不同程度的破坏，各地区受影响的 情况不尽相同，因此对于水体富营养化问题必须给予足够的重视。 ( 一) 国外湖泊富营养化状况 近些年来世界各国普遍存在湖泊水体富营养化问题，随着全球水体富营养化状况的不断加 剧，各国都不断进行研究和实践。在欧洲，已统计的近百个湖泊中就有8 0 左右的湖泊水体中氮、 磷超标，呈现出富营养化状态。在亚洲，南部富营养化水体多于北部。此外，亚洲大部分城市湖 泊由于受生活污水影响较大，致使高锰酸盐指数和生化需氧量均严重超标，出现水体富营养化状 态。在北美洲的五大湖泊中，苏必利湖水质最好，密执安湖和休伦湖处于中营养状态，而安大略 湖和伊利湖属富营养型湖泊。 ( 二) 国内湖泊富营养化状况 北京建筑工程学院硕士学位论文1 绪论 我国是一个多湖泊的国家，大小湖泊共有2 万多个，其总水量可达7 0 多亿m 3 。另外，还有 各类水库8 万多座，总水量达4 0 0 0 多亿m 3 【8 】。我国城镇饮用水水源主要来原于各类的湖泊和水 库，约占5 0 以上；全国近一半的粮食产量来自于湖泊流域，湖泊环境在我国具有十分重要的地 位。近2 0 年来，随着人口数量的增加，逐渐出现了一些对湖泊生态系统不利的环境问题，我国 湖泊水体的环境状况也越来越糟糕，例如向湖泊中大量排放污染物，致使湖泊水体污染；围湖造 田等不合理开发引起的湖泊水质恶化，加速了水体的老化过程，使水环境污染问题越来越严重。 我国部分河流水域如汉江、珠江、葛洲坝水库已呈现中营养化以上水平；有些湖泊甚至已达到超 重富营养化9 1 ，如滇池部分水域水华每年持续时间长达1 0 个月，巢湖、太湖部分水域也长期处于 富营养化状态，云南洱海1 9 9 6 年大面积爆发藻类，持续时间近1 个月【1 0 1 。太湖与滇池富营养化 情况非常突出，藻类全湖泛滥，其叶绿素a 的浓度超标近百倍，在最严重的累积区超标高达数千 倍，是世界上较为罕见的。因此，湖泊的富营养化问题已成为制约社会和国民经济进一步持续发 展的重要囚素。 1 1 3 富营养化的形成原因与危害 水体富营养化是由于水体中溶解性无机盐类营养物( 主要是含氮、磷盐类) 过度积累，而这 些盐类是生物个体生长所必须的营养元素，导致水体中水生生物( 主要是各种藻类) 过量繁殖， 从而使水环境出现恶化的现象。 一般来说，富营养化是湖泊的一个必然的趋势，湖泊通常都会经历贫营养化阶段和富营养阶 段，这一过程自然发生的时间是相当缓慢的，人类出于经济发展的需要，无视自然规律，一方面 向湖体排放工业、农业和生活污废水，另一方面又破坏水生植被、缩小湖体自狰容量、在河流沿 岸地带进行各种工农业生产活动，这些人类活动使湖泊发生富营养化的速度大大提高。 湖泊富营养化的危害很大，它不仅造成经济损失，而且还危害人类身体健康。随着湖泊富营 养水平的不断提高，藻类开始过剩繁殖，其主要危害有1 3 1 ： ( 1 ) 富营养化水体中的藻类使净化系统堵塞，出水中含有异味，影响人们的饮用水质量； ( 2 ) 水体中过剩的藻类漂浮到水面，堆积腐烂后，产生恶臭，污染居住环境，影响水体景观； ( 3 ) 使水生生态系统失衡，降低水生生物的稳定性和多样性。由于富营养化使水体中蓝藻恶性 繁殖，能够抑制其他水生生物的生长，从而减少水生生物的种类。同时，在一定条件下，微囊藻 分泌的藻毒素会被还原成致癌物，不仅威胁水生生物，而且还直接或间接危及人、畜饮水安全。 ( 4 ) 破坏天然水产资源，降低水体经济价值。由于水面被藻类所覆盖，隔绝了水体的气体交 2 北京建筑j = 程学院硕士学位论文 l 绪论 换，使水体缺乏溶解氧，使水生生物不能进行正常的生长代谢，水产品的养殖受到严重影响； 综上所述，水体富营养化不仅破坏了湖泊的水环境，而且影响到人类的身体健康，为此，对 湖泊富营养化的治理应给予足够的重视。 1 2 化感作用抑制藻类的研究进展 由于全球范围内普遍具有富营养化现象，因此对藻类的恶性繁殖的抑制也在不断的深入研 究。控制水体富营养化的方法主要分为化学方法和物理方法，化学方法是指在水体中直接投放化 学药剂米控制富营养化，此法法见效较快，但会对水体造成二次污染；而物理方法成本较高，成 效也不大。因此利用生物方法治理藻类，即是利用水生植物与藻类竞争矿质营养、光照和利用植 物释放的化感物质抑制藻类三方面来控制藻类生长，这种方法具有高效、环保的优点，已受到越 来越多国家的广泛关注和应用。本文也采用生物方法来抑制藻类的生长。 1 2 1 化感作用定义 化感作用的英文为“a l l e l o p a t h y f 1 4 1 。1 9 3 7 年m o l i s h 首先定义了植物化感作用( a l l e l o p a t h y ) 为：所有类型植物( 含微生物) 之间生物化学物质的相互作用，这种相互作用包括有害和有益的 两个方面。r i c e i l 5 1 在c a i l e l o p a t h y 第一版中定义植物化感作用为植物( 含微生物) 通过释放化 学物质到环境中并对其它植物产生的直接或间接的有害或有益作用。 1 2 2 化感作用在水生态系统中的应用 利用化感作用抑制藻类生长的研究在国内外均处在起步阶段，而且研究对象主要集中在水生 植物对藻类的抑制作用方面。 1 9 4 9 年h a s l e r 等人首次发现了水生植物对藻类具有抑制作用，其主要原因可能有以下几种： ( 1 ) 水生植物与藻类之间对氮、磷等营养的竞争；( 2 ) 水生植物对藻类有一定的遮光作用；( 3 ) 水生 植物通过化感作用抑制藻类的生长；( 4 ) 水生植物利用根际微生物影响藻类的生长代谢。孙文浩等 通过光照和营养试验证明在排除了上述( 1 ) 、( 2 ) 两个原因的条件下，发现风眼莲对藻类仍有显著的 抑制作用f 1 6 】，之后又进一步培育出了凤眼莲无菌苗，采用对比试验结果证明风眼莲无菌苗也能明 显的抑制藻类的生长，这说明是凤眼莲分泌的化感物质对藻类生长产生了明显的抑制作用【1 6 1 。此 外，n a k a i 等还通过在水体一次性投加和半连续投加化感物质的试验，结果证明了水生植物是通过 连续释放的化感物质来抑制藻类生长的【1 7 】。 3 北京建筑工程学院硕十学位论文 l 绪论 戴树桂等发现宽叶香蒲对浮游藻类具有较好抑制作用8 1 。在此后的研究中又从香蒲类植物的 花粉蒲黄提取物中分离出了两种抑藻物质【1 9 1 。陈德辉1 2 0 】发现蓖齿眼子菜能抑制铜绿微囊藻和斜生 栅藻的生长。宝月欣- - 1 2 研究发现苦草、黑藻能够抑制小球藻的生长。 胡洪营等研究了大型水生植物芦苇的不同部位的浸出液对小球藻有较强的化感作用。当芦苇 浸出液为l o g l 时，对小球藻抑制率可达9 7 6 ，藻类几乎无法生长。相比之下，芦苇叶片的化 感作用最强，对控制水华藻具有潜在价值【2 2 1 。国外发现最为成功的利用化感作用抑制藻类的应用 实例是利用人麦秸秆直接投入水体抑制藻类【2 3 1 。 1 3 常见的具有抑藻作用的化感物质 1 3 1 化感物质 植物( 含微生物) 通过释放化学物质到环境中并对其他植物产生直接或间接的有害或有益作 用【2 4 】，这些化学物质称为化感物质( a n e l o c h e m i c a l ) 。化感物质大部分是植物的次生代谢物，植物 的各个组织如根、茎、叶、花、果实和种子甚至于体植物都能向环境释放一定量化感物质，并能 持续影响邻近的植物。一般情况下化感物质有3 种途径进入环境；植物向环境中释放挥发性化感 物质；植物根部分泌化感物质；植物残株分解1 2 5 1 。植物释放的化感物质有的是单一组分，有的是 多组分，1 9 7 4 年r i c e l 2 6 1 将化感物质大体上分为1 4 类：脂肪族醛和酮；苯甲酸及其衍生物；长链脂 肪族；水溶性有机酸，直链醇，葸醌；简单不饱和内酯；简单酚，肉桂酸及其衍生物；萘醌，类 黄酮；类萜和甾类化合物；单宁；生物碱和氰醇，氨基酸和多肽；嘌呤和核苷。其中低分子量的 酚类和类萜化合物是较为常见的化感物质。目前已从不同植物中分离出能抑制藻类生长的化感物 质【2 6 1 ，主要有：多酚、硫化物、黄酮类、生物碱、苯丙酯类和类萜。 1 3 2 化感物质对藻类的生长抑制机理和抑藻途径 化感物质能够通过多种方式抑制藻细胞的分裂，减少藻细胞增长数量。目前各学者对化感物 质抑制藻类生长的机理方面研究较少，且没有统一的结论，从目前的报道看，化感物质抑制藻类 生长可能的途径主要有三方面： ( 1 ) 对藻细胞光合作用的影响 叶绿素是在藻类光合作用的主要成分，有些化感物质能够破坏藻细胞的叶绿素，从而抑制藻 类的生长。风眼莲根系附着的藻细胞的叶绿素a 的含量明显下降，而其降解产物脱镁叶绿素酸的 4 北京建筑t 程学院硕士学位论文l 绪论 含量明显升高【2 7 1 。孙文浩口8 】研究风眼莲种植水抑制藻细胞生长时，发现藻类光合效率显著降低， 卜绿素a 被严重破坏，细胞还原能力也出现显著下降，藻细胞颜色由鲜红色变为淡绿色。 ( 2 ) 对藻细胞细胞膜的破坏作用 化感物质能破坏细胞膜的完整性，使细胞内含物质大量渗出，渗出液的电导率迅速增加【2 9 1 。 从芦苇中分离得到的具有抑藻作用的组分能够彻底破坏藻细胞膜，使得细胞内k + 、c a 2 + 和m g + 外 泄，从而导致藻细胞的死亡【3 们。此后，又有研究表明，化感物质能够使藻细胞膜中的部分脂肪酸 在抑藻物质作用后被氧化，使脂肪酸不饱和度增加，增强细胞膜流动性，从而降低了进出藻细胞 物质的选择透过性0 0 l 。 ( 3 ) 对藻细胞内酶活性的影响 由于酶的特性不同，化感物质能提高或抑制某些酶的活性伫9 1 。胡洪营等通过分离化感物质 2 一甲基乙酰乙酸乙醋对蛋白核小球藻和普通小球藻的抗氧化体系酶活性的研究发现，低浓度的 e m a 能够提高2 种藻类的过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性；高浓度的e m a 能够 显著降低蛋白核小球藻的抗氧化体系酶活性。 水生植物化感物质进入水体的3 种方式。 ( 1 ) 活体植物栽培：活体植物可以向水体中释放化感物质3 2 1 ，在合适的水体中栽培某些植物 3 3 】，能在一定程度上起到抑制藻类生长的效果。孙文浩等证明水葫芦能够通过根系释放化感物质， 能明显抑制雷氏衣藻的生长【蚓；何池全等通过一系列实验证明石菖蒲的根系分泌物对藻细胞有化 感作用。 ( 2 ) 干体植物投放：腐败后的植物体，也可以向水体中释放出化感物质，从而起到抑制藻类 生长的效果。1 9 9 4 年美国水生植物管理中心研究发现，向富营养化水体直接投入大麦秸秆，若干 周后能够起到明显的抑藻作用【3 5 1 。 ( 3 ) 将植物中提取化感物质制成抑藻剂投入水体：目前，有许多学者已经成功分离鉴定了多 种抑藻化感物质3 6 1 。如a l l i o t t a g 等从宽叶香蒲中分离得到a 一亚油酸、a 一亚麻酸及不饱和18 碳脂肪 酸，其对小球藻和鱼腥藻有较好的抑制作用；向水中投加分离后的化感物质抑藻比活体栽培和干 体投入方式能够更快速的抑制藻类生长。 利用化感物质抑制藻类为研究富营养化水体的治理提供了新方向。因此本文研究一种含有常 见的化感物质( 多酚) 的植物作为研究对象，多酚主要来自植物体的分泌，因此又可称为植物多 酚，目前植物多酚己作为一种新型、环保的天然产物倍受到人们的关注，植物多酚已经在医药、 食品、制革等众多领域得到了非常广泛应用。 5 北京建筑工程学院硕士学位论文1 绪论 1 3 3 植物多酚简介 植物多酚是一类广泛存在于植物的根、叶、花、果实的多酚类物质，属于天然有机化合物3 7 1 。 它属于植物的一种次生代谢产物，在植物体内的含量仅次于纤维素和半纤维素，植物多酚在自然 界有非常丰富的储量，常见的含多酚较多的植物有6 0 0 余种，尤其是在某些针叶树树皮中多酚含 量达2 0 4 0 【3 引。 植物多酚的种类很多，按照化学分子式结构分类，可将植物多酚分为缩合单宁和水解单宁。 其中缩合单宁属于黄烷醇类聚合物，它分子中的芳香环均以c c 键相连，不易水解3 9 m 】。水解单 宁分子内具有酯键，通常是以一个多元醇为核心，通过酯键与多酚羧基相连接而成，在酸、碱存 在条件下水解单宁分子极不稳定，且易水解。 ( 一) 植物多酚的化学反应活性1 4 3 4 8 】 由于植物多酚分子中含有多个化学反应活性基团，可以发生多种化学反应，所以植物多酚被 广泛应用到许多领域中。酚羟基是酚类物质结构中活性较强的特征基团，它能使植物多酚发生酚 性化学反应。而且多酚分子中的醇羟基和羧基还可以使多酚能够发生醇、酸的一系列反应。酚羟 基与金属盐发生的显色反应可用来定性和定量的分析植物多酚。醚化反应可使多酚的酚羟基转化 成醚，不仅减弱多酚的极性，而且降低反应活性，增强多酚的稳定性，有利于多酚的分离和结构 测定1 4 9 1 。 ( 二) 植物多酚结合蛋白质反应 植物多酚的另一最重要的化学性质是与蛋白质结合反应，此反应广泛存在于自然界。大多数 中草药中都含有多酚类物质，多酚的收敛性以及对细菌、病毒、酶的抑制性等生物活性都与多酚 能够结合蛋白质有关5 0 1 。多酚的酚羟基还可与蛋白质的极性基发生两点氢键结合。疏水键和氢键 的同时作用可进一步加强多酚一蛋白质反应。此外，多酚利用多点结合的方式在蛋白质分子间易 于形成疏水层，这可使大量蛋白质分子聚集，最终导致蛋白质沉淀【5 l 】。 ( - - ) 植物多酚与无机盐的作用 多酚与无机盐的作用主要包括两个方面5 2 l ：一是静电作用，二是络合反应。静电作用属于物 理过程，多酚的酚羟基能够与大多数金属离子发生络合反应，主要发生部位是在多酚分子的两个 相邻的酚羟基上，多酚的分子量、质量比、分子结构等也都对络合程度有影响，通过无机盐的盐 析和脱水也可以促进多酚溶液的沉淀5 3 j ；盐析属于化学过程，是指多酚的临位二酚羟基能够与金 属离子形成五元环螫合，以及发生氧化还原和水解等其他化学反应【5 4 1 。由于植物多酚具有与金属 离子发生络合反应的特性，因此可将其广泛应用于金属防腐蚀、锅炉水处理、解除重金属中毒、 6 北京建筑t 程学院硕士学位论文1 绪论 木材防腐、抑酶、抗菌等多方面【5 5 研】。 ( 四) 植物多酚的抗氧化作用 植物多酚分子中的酚羟基具有一定的还原性，多酚分子中的酚羟基可以作为氢离子供体，使 多酚不仅能够被氯酸盐、重铬酸盐等强氧化剂氧化，而且还能被空气中的氧所氧化。当有多酚氧 化酶存在时，其氧化速度加快，可生成颜色较深的邻醌。低分子量的多酚降解产物的抗氧化性强 于高分子量的多酚，它们作为天然抗氧化剂已经在食品等领域被大量应用芦s - 6 0 。 1 3 4 酚类物质的化感作用 酚酸类物质是植物的次生代谢产物，也是目前研究最多对象。经研究发现，酚酸类物质是 化感活性较强的一类化感物质，大部分酚酸类物质都具有一定的化感作用【6 1 1 。 近年来，世界各地水质富营养化日趋严重。有学者6 2 1 研究了杉木粉对塔玛亚历山大藻生长 的影响，研究结果表明，杉木粉能明显抑制塔玛亚历山大藻细胞的生长，其多酚提取物对塔玛亚 历山大藻也具有显著的抑制作用。这说明，杉木粉可能成为一种潜在的控制藻类生长的新材料， 其抑藻机理可能与杉木粉中的多酚物质对藻细胞的沉降作用有关。 尽管学者已研究了多种控制藻类的方法，但都基于实验室理论阶段，真正能推广到实际应用 的方法少之甚少，因此寻找一种新型、经济、高效、无污染的抑藻方法仍然是富营养化领域研究 的热点。利用植物化感作用来抑制藻类生长是富营养化领域实现创新的途径之一【6 3 羽】。目前化感 作用应用最好的实例就是利用大麦秸秆抑藻，研究显剥6 6 1 ，大麦秸秆抑制藻类生长的原因可能与 多酚类物质有关，当增加溶解氧时，秸秆的抑藻效果会被增强，这说明酚类的氧化产物具有更强 的抑藻效果。大麦秸秆及其木质素等多酚氧化降解产生的酚酸类物质如儿茶素、没食子酸等物质， 可能是秸秆抑制藻类生长的原冈之一。杨维东、张信连等【6 5 1 人研究发现没食子酸、香草醛和“) 一 儿茶素3 种酚酸类化感物质均对塔玛亚历山大藻的生长有抑制作用，它们能够破坏藻细胞膜透性， 影响藻细胞的正常代谢活动。 1 4 化感作用的应用生物浮岛 在控制城市水体富营养化的问题上，国内外学者均已进行了漫长的研究与探索。由于人工生 物浮岛是一种生态技术，其控制水体富营养化效果较好、成本低廉、无二次污染，因此被广泛应 用于富营养化水体修复。 生物浮岛技术是按照自然界规律，人工把高等植物种植到富营养化水域水面上，通过植物根 7 北京建筑工程学院硕十学位论文l 绪论 部吸收水中营养、与藻类竞争和化感作用，来消除富营养化水体中的氮、磷及有害物质，从而达 到净化水质的效果，同时又可增加水体景观的美感。 同时由于多酚无毒害作用，将多酚植物干体代替废轮胎和废泡沫作为载体用于生物浮岛，即 对水体中藻类有抑制作用，又不会污染水环境，因此多酚物质对于富营养化水体的抑制将起到不 可忽视的作用。 8 北京建筑t 程学院硕士学位论文2 课题的研究内容和研究方法 2 课题的研究内容和研究方法 2 1 研究内容 本课题研究多酚对藻类的抑制作用，实验的重点已由使用高纯度的多酚提取物茶多酚， 改进为用多酚含量高、常见、易栽培的植物以生物浮岛的形式，来实现对藻类生长的抑制利用， 也就是利用植物对藻类的化感作用来抑制藻类生长。植物化感作用抑制藻类的研究早在上个世纪 6 0 年代已经出现，但大多是选用水体中较为常见的水生植物，虽然利用水生植物的化感作用抑制 藻类生长有较好的作用，但是当藻类受抑制后，水生植物又会出现疯狂增长的形势，这只是把由 浮游藻类占优势的藻型湖泊变成了又水生植物占优势的草型湖泊，实际上这两种类型湖泊都是富 营养化的表征，藻型湖泊会造成水生生态严重恶化，草型湖泊会影响渔业捕捞、航运，并加速湖 泊变浅和消亡，都会对湖泊利用带来危害，所以利用水生植物抑制藻类生长不能根本解决湖泊富 营养化的问题，它只是从一种破坏形式转化为另一种破坏形式，没有彻底解决湖泊污染的问题。 而利用具有能够大量分泌多酚物质的高等植物，以生物浮岛的形式来抑制藻类生长，一方面能够 起到抑制藻类的作用，另一方面又起剑美化水体的作用，而且容易控制植物在水中的量，因此选 择含有多酚的植物( 多酚是研究最多、被证实是化感活性较强的一类物质) ，来对富营养化水体 中的藻类进行试验，以期为进一步利用多酚植物抑制藻类生长以及筛选和利用植物化感作用控制 富营养化水体中藻类做出有益的探索。具体的研究内容如下： ( 1 ) 既能分泌大量多酚物质又易于栽培的植物的筛选及其水培试验； ( 2 ) 纯种藻的培养，以及藻类最适培养基的选择； ( 3 ) 植物分泌的化感物质的分离、鉴定。 ( 4 ) 通过活体水杨梅的覆盖试验和营养试验来排除光抑制和营养竞争的影响； a 测定各组藻细胞的光密度，以研究藻细胞生长情况； b 测定各组藻细胞的叶绿素a ，以研究植物对藻细胞的生理生化的影响； c 监测水中总氮、总磷浓度变化，以研究植物和藻类对营养元素的吸收情况； d 监测水中多酚含量变化，以研究植物体分泌的多酚含量的变化； e 测定细胞膜通透性，以研究植物对藻类生长影响途径； f 研究水中p h 变化情况； ( 5 ) 通过试验植物种植水、干体植物对两种藻类生长的作用，来研究不同形式的植物对藻 9 北京建筑工程学院硕士学位论文2 课题的研究内容和研究方法 类生k 的影响； ( 6 ) 研究所选植物对景观水体中藻类的抑制作用； 2 2 研究方法和技术路线 本研究主要采用静态试验： ( 1 ) 利用定性和定量试验验证植物分泌的化感物质。 ( 1 ) 采用塑料箱作为藻类和植物共培养的装置，先把藻类放入箱中培养到试验所需浓度，再 移栽一定量的植物，隔天监测水中的藻密度、叶绿素a 、藻胆蛋白、总氮、总磷、光照、水温、 p h 值等参数值，来掌握植物体对藻类以及水中氮磷的影响。 ( 2 ) 在三角烧瓶中加入一定量的藻液，再将不同浓度的植物种植水分别加入各三角烧瓶中， 隔天监测水中的藻密度，叶绿素等参数，来观察不同浓度的植物种植水对藻类生长的影响情况。 ( 3 ) 将一定量的植物干体用纯净水浸泡2 4 h 后，减压抽滤，量取不同体积的浸泡水，加入到 一定浓度的藻液中，隔天监测水中的藻密度，叶绿素a 等参数，找出能够抑制藻类的最佳浓度。 图2 - 1 技术路线 1 0 北京建筑i 程学院哦学位论文 2 课题的研究内容和研究方法 2 3 试验材料 2 31 植物的选择 通过阅读a 量文献，发现水杨梅的 i 中多酚古量较高，该酚性化台物主要成分为儿茶素类 化合物，而义有人研究糙现睇l 儿茶素类化台物对藻类的生长有一定的抑制作用，因此，本文决定 选用这种能蜉分泌多酚类化台物的水杨梅作为试验植物。 草本肚杨梅( g e u ma l e p p i c u m j a c q ) 为蔷薇科水杨梅属植物，主要分布于我国东北、华北、 西北、中南及两南等地区，民间以其全草或根入曲具有清热解毒、消肿止痛之功教，何勇、高 何刚通过对水杨梅的根部进行硅胶柱层析分离得到2 个酚性化合物，g g m s 鉴定表明为儿芬素类 化台物，且这2 个成分在水杨梅根中音量较高l 删。 z 32 藻种及培养基的选择 图2 - 2 水杨梅植株 ( 1 ) 藻种的选择试验选用的藻种是北京城市河湖水体爆发水华的优势藻种群：铜绿微囊藻 ( m i c r o a y s n ia e r u g i n o s a 胁觑) 和斜牛栅藻( 皿e 础如s m 珊o b i q u 时k u t z ) ，电是国际上推荐的标 准试验藻种，购丁水生生物研究所。 铜绿傲囊藻属于蓝藻门微囊藻属，微囊藻属是球形或具有报多穿孔的浮游性群体。夏季在营 养丰富的水中人量繁殖，易形成水华，危害其他水生生物。微囊藻能够分泌种能抑制其他藻类 生长的化学物质，有些种类还可以产生一种叫做“致死因子”的毒素能毒害摄食藻类的动物。 斜生栅藻为绿藻门栅藻属，栅藻属是绿藻群体类型中的常见浮游植物之一。一般是4 个细胞 北京建筑t 程学院硕七学位论文2 谭题的研究山吝科研究方法 的定型群体，也育8 个或1 6 个f i | 胞的群体。细胞形状通常是椭啵形或纺锤形。经常被用作藻类 毒性试验材料i 。 ( 2 ) 蚺养基的选择： ”斜生栅藻培养基选拌试验：共培养时， 在藻类培养基上进行一定改进后的培券基，如 等。国内应用较多的是基于植物营养渡改良的 基、水生四号培养基。 培养基的选择非常重要。国外研究中选择较多的是 1 5 n g o r h a m 培养基 7 “、m i i 培养基和w c 培养基 1 1 0 nh o a g l a n d 培养基川、s e 培养基，m 1 1 培养 率试验选择m - i i 培养基，s e 培养基和水生四号培养基3 种绿藻常用的培养基，对斜生栅藻进 行培养以选择一种最适合斜生栅藻生眭的培养基。该试验结果表明：斜生栅藻对3 种培养基都有 较好的适应性，斜生栅藻在三种培葬基中的生长情况如图2 - 3 所示。在m i l 培养基和s e 培养基中 生鲢趋势较为接近，从试验开始的第2 天就开始进入对数生长期，而在水生四号中的生长量始终低 于m - i i 和s e ，从第6 天才开始进入对数增长期；但在试验开始j 亓的第8 、9 、1 0 天时+ m - l i 培养 基中的斜生栅藻仍明显处在对数生长期而s e 培养基中的藻细胞增长速度开始减慢有进入稳定 期的趋势。因此奉试验期间选片jm 1 l 作为斜生栅蕊培养基，因为m - l i 培养基不仅成分简单，易 于配制，而且藻细胞在该培养基中对数生长期较长，其最大比增长率为2 07 ，更利于斜生栅藻的 生长。 一6 0 0 亨5 0 0 ，4 0 0 罾3 0 0 錾2 0 0 暴1 0 0 o o24681 0 时间d 围2 - 3 三种培养基下斜生棚藻生长比较 2 ) 铜绿馓囊藻培养基选择试验：中国环境科学研究院的胡小贞，马祖友等人研究牧现与其 他培养基( m a ，b o 1 1 ，h 6 z ) 相比，铜绿微囊藻在m 1 l 培养基中对数生长明长，同时又具较大 的比增长述率和堆太现存量，是室内蓝藻培养实验适宜的培养基。因此奉试验期间，也选用m l l 作为铜绿微囊藻培养基。 北京建筑工程学院硕士学位论文2 课题的研究内容和研究方法 因此本试验选用m 1 l 作为铜绿微囊藻和斜生栅藻的培养基，两种藻选用相同培养基不仅利于 试验操作，更利于试验结果的观察比较，m 1 l 培养基配方如表2 1 所示。 表2 - 1m - 11 培养基配方 营养元素 工作液( m g l )母液( g l ) n a n 0 3 1 0 01 0 0 k 2 h p 0 4 1 01 0 m g s 0 4 。7 h 2 0 7 5 7 5 c a c l 2 2 h 2 0 4 04 0 n a 2 c 0 3 2 0 2 0 柠檬酸铁铵 66 n a 2 e d t a l1 2 4 试验仪器和设备 主要仪器介绍： ( 1 ) l r h 2 5 0 生化培养箱：温度范围在卜5 5 ，精度0 1 ，光强在2 5 0 0 - - - 3 5 0 0 1 x ，用 于藻类的培养。 ( 2 )紫外可见分光光度计( s h i m a d z uu vm i n i1 2 4 0 ) ：能在紫外、可见广谱区域对样品 做定性和定量的分析。波长范围在1 9 0 n m - 9 0 0 n m 。 ( 3 ) m l s - - 3 7 8 0 高压灭菌锅：用于培养基、培养皿以及其他有无菌需要的器皿的灭菌， 灭菌温度在1 0 5 一1 3 5 范围内。 ( 4 ) f a 2 0 0 4 电子分析天平：用于试验药品的称量，精度为0 1 m g ，量程为2 0 0 9 。 ( 5 ) 哈希d r 8 0 0 系列三参数测定仪：主要用于水中总氮、总磷、c o d 的测定。 ( 6 )超低温冰箱：8 0 。c 超低温条件下，用于藻胆蛋白的冻融。 ( 7 ) 真空泵抽滤机：用于抽滤水杨梅种植水。 ( 8 ) 离心机：用于藻类离心。 ( 9 )照度计：测定光强度。 还包括生物显微镜、超净工作台、w g l 3 6 电热鼓风干燥箱、温度计、p h 计、血球计数板等其他 仪器。 1 3 北京建筑1 = 程学院硕士学位论文3 水杨梅体内多酚物质的分离和鉴定 3 水杨梅体内多酚物质的分离和鉴定 草本水杨梅作为一种多酚草本植物，其体内含有大量多酚，但是否能够从根部分泌出多酚物 质仍需证明，因此本论文通过定性试验和定量试验米验证。 3 1 试验材料与方法 试验材料：活体水杨梅 ( 1 ) 水杨梅浸提液的制备： 分别称取2 0 9 水杨梅的根、茎、叶，洗净，剪碎，碾磨，放入5 0 0 m l 烧杯中，分别添加i o o m l m 1 l 培养基，密封，放入温箱中2 4 h 后进行试验。 ( 2 ) 水杨梅培养液的制备： 称取洗净的活体水杨梅l o o g ，放入5 0 0 m l m 1 1 培养基中，培养3 天后，将培养液用0 4 5 微米滤膜减压抽滤。 3 2 多酚物质定性验证 酚类物质的鉴定：采用三氯化铁显色法。用1 的三氯化铁溶液滴加所测溶液，观察其颜色， 若有墨绿色出现，证明有酚类物质存在。 将放入温箱中的根、茎、叶浸提液和活体水杨梅培养液取出，各量取l m l 于小烧杯中，滴加 1 三氯化铁溶液，观察颜色变化。 结果显示各部分显色程度：叶浸提液 根浸提液 茎浸提液 活体水杨梅培养液。这说明水杨 梅各部分均含有一定量的多酚物质，其含量多少的分布顺序为n t 。 根 茎 活体水杨梅培养液，活 体水杨梅培养液中也含有多酚物质，说明多酚可以由水杨梅的根部分泌出来。 3 3 多酚物质的分离与鉴定 称取l o o g 水杨梅( 两棵) ，移入5 0 0 m l 蒸馏水中，培养两天后，取出水杨梅，将水溶液用 0 4 5 9 m 滤膜减压抽滤后，量取5 0 m l 过滤后的水溶液于2 5 0 m l 的分液漏斗中，用三倍体积的乙 酸乙酯萃取3 次，用高效液相色谱法检测水中是否有多酚存在。( 由于是送出检测，所以检测过 程省略) 检测结果如下图所示。 1 4 北京建筑工程学院硕士学位论文3 水杨梅体内多酚物质的分离和鉴定 图3 1 多酚检测图谱 由图谱可以看出，保留时间在7 2 时出现了最高峰，此时出现的最高峰代表儿茶素物质，说 明水中含量最多的物质是儿茶素，儿茶素是植物多酚的一种，儿茶素广泛分布于植物界，具有明 显酚的特性，具有沉淀重金属和蛋白质等特性。因此证明水杨梅的根部可以分泌一定量的多酚。 前人已研究茶多酚( 主要成分是儿茶素) 会对藻类生长有一定影响，说明儿茶素对藻类生长会有 一定程度的影响，因此本试验欲研究能够分泌多酚物质的水杨梅对藻类生长的影响。 1 5 北京建筑上程学院硕士学位论文4 水杨梅对斜生栅藻的抑制作用研究 4 水杨梅对斜生栅藻的抑制作用研究 4 1 材料与方法 4 1 1 植物材料的选择 水杨梅由北京市通州区三好园林公司种植培养，试验选用根系发达、枝叶茂盛、主茎直径大 于6 c m 粗的水杨梅植株进行试验研究。 4 1 2 藻类的培养 斜生栅藻藻种取自中国科学院水生生物研究所，保存在p h 为7 5 的m 1 l 培养基中，培养条 件为温度2 5 c ，光暗比1 4 h ：1 0 h ，照度为3 5 0 0 1 x 。每5 d 转接一次，重复2 次，所得斜生栅藻浓度 经镜检计数超过1 0 5 个m l 时，便可作为试验藻种。 4 1 3 测定方法 ( 1 ) 藻细胞数测定：藻细胞数采用血球计数板法，在生物显微镜下以显微镜视野法进行计数。 自接种之日起隔天定时采样计数，并记录细胞形态。 ( 2 ) 光密度法( o d 值) ：先用紫外分光光度计测定藻类的全吸收波谱，找出它们的最大吸收 峰所对应的吸收波长，铜绿微囊藻最大吸收波长为6 5 0 r i m ，斜生栅藻最大吸收波长为6 8 0 n m ，然 后每次在固定的最