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硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 摘要 论文总结了f l a s h 色谱法、整体柱色谱法、超高压色谱法和高温色谱法的特征， 系统探讨了与高压和高温相关的问题及解决方法。研究了流量和温度对色谱保留参数 的影响规律。提高压力( 流量) 可以极大加快分离速度。而升高柱温，在改善最佳流速 范围的同时，不仅使色谱柱背压降低，也可能对分离选择性起到一定的调节作用。 采用亚2 9 m 色谱柱构建了一套超高压液相色谱系统。所建立的系统最高耐压 6 0 m p a ，系统稳定性良好，可以满足液相色谱定量和定性分析的需要。使用1 9 9 m 填 料色谱柱与常规5 1 x r n 填料色谱柱比较，相同流速下的分析速度提高了8 倍，而流动 相消耗仅为1 1 4 ，节约了时间和溶剂。 通过对常规仪器的改进，构建了一套高温液相色谱系统，在不同分离模式下通过 对六味地黄丸的分析评价系统。系统具有分离速度快、柱效高的特点。四支串联色谱 柱的绝对柱效达到7 6 万，分离六味地黄丸时色谱峰数可增加一倍以上。以正相色谱 柱和反相色谱柱串联构建的连续二维色谱系统，结合了正相色谱与反相色谱的特点； 将紫外检测器和e l s d 串联使用，可以得到更加详尽的检测信息。 关键词：u h p l c ，h t l c ，多柱串联，二维色谱，双检测器串联， 六味地黄丸。 硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 a b s t r a c t t h i sp a p e rs u m m a r i z e dt h ef l a s hl c ，m l c ，u h p l ca n dh t l c ，a n df o c u s e do i lt h e h i g h - p r e s s u r ea n dh i g h - t e m p e r a t u r e - r e l a t e dp r o b l e m sa n ds o l u t i o n s t h ee f f e c to ff l o wr a t e a n dt e m p e r a t u r eo nr e t e n t i o nw a ss t u d i e d t h ei n c r e a s ei np r e s s u r e ( f l o wr a t e ) c o u l d g r e a t l y a c c e l e r a t es e p a r a t i o ns p e e d e l e v a t i o no ft e m p e r a t u r ec o u l dr a i s e dt h eo p d m u m v e l o c i t y , d e c r e a s e dc o l u m nb a c kp r e s s u r e ，e n h a n c e dr e s o l u t i o n ，a d j u s t e ds e l e c t i v ea n d r e d u c e dt h ea s y m m e t r yt oi m p r o v et h ep e a k s b a s e do ns u b - 2 u mc o l u m n ，a nu h p l cs y s t e mw a sc o n s t r u c t e d t h i ss y s t e mc o u l d g e n e r a t em a x i m u mp r e s s u r ea t6 0 m p a ；s y s t e ms t a b i l i t yw a sg o o de n o u g ht om e e tt h e q u a n t i t a t i v ea n dq u a l i t a t i v ea n a l y s i s i nt h ea n a l y s i so f t h es t a n d a r ds a m p l e ，c o m p a r e dw i t h 5 9 m ，c o l u m n sp a c k e dw i t h1 9 9 mp a r t i c l e sw a sm o r ef a s t e r , a n di t s8t i m e sf a s t e rw h e n s e p a r a t e da tt h es a m ev e l o c i t ya n do n l y1 1 4o fs o l v e n tc o n s u m p t i o n t h ec o n v e n t i o n a lh p l cw a sm o d i f i e dt oh t l cs y s t e m s e p a r a t i o n so fl i u w e i d i h u a n gp i l lu n d e rd i f f e r e n tm o d ew e r eu s e dt oe v a l u a t et h eh t l cs y s t e m s e p a r a t i o no f l i u w e id i h u a n gp i l lu s e dh t l ca c h i e v e df a s t e ra n dh i g h t h r o u g h - p u ta n a l y s i s ，a n de a s yt o c r e a t es o p h i s t i c a t e df i n g e r p r i n t i f4c o l u m n su s e di ns e r i e s ，t h ea b s o l u t ep l a t en u m b e r r e a c h e d7 6 m ，p e a k so fl i u w e id i h u a n gp i l lt i m e d ，e s p e c i a l l yt h ea n t e c e d e n tp e a ko ft h e l e s sr e t a i n e dc o m p o n e n t sg o te n o u g hs e p a r a t i o na n dt h ef i n g e r p r i n to fs a m p l ew a sm o r e c o m p r e h e n s i v e c o n t i n u e st w o d i m e n s i o n a lc h r o m a t o g r a p h ys y s t e mc o n s t i t u t e do fn o r m a l a n dr e v e r s ec o l u m n ss p e e d e du pt h es e p a r a t i o ns p e e d t h em o d eo fu va n de l s di ns e r i a l h a df e a t u r eo fh i g hs e n s r i v i t ya n du n i v e r s a lw h i c hg a v em o r ed e t a i l e di n f o r m a t i o n ， k e y w o r d s ：u h p l c ，h t l c ，c o l u m n si ns e r i e s ，t w o d i m e n t i o n a lc h r o m a t o g r a p h y d e t e c t o r si ns e r i e s ，l i u w e id i h u a n gp i l l 硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 图表目录 图2 11 号标样的标准色谱图 图2 2 依利特反相标样标准色谱图 图2 3 芳烃样品的标准图谱 图2 4 流速与塔板高度关系图 图2 51 号标样在不同流速下分离比较 图2 - 6 体积流速下比较峰面积 图2 7 流量与压力关系图 图2 8 温度对保留时间的影响 图2 - 9 塔板高度与随温度关系图 图2 1 0 单位时间柱效与温度关系曲线图一 图2 1 1 温度对芳烃选择性一 图2 1 2 温度对不对称度的影响 图2 1 3 流动相线速度和压力与温度的关系 图2 1 4 不同采样频率对峰型的影响 图2 1 5 采样频率对分离度和峰宽的影响 图2 - 1 6 进样阀对峰高的影响 图3 1 超高压液相色谱系统流程图 图3 - 2 相同线速度下分离比较 图3 - 3 相同流速下分析比较 图3 4 相同压力下分析比较 图3 5 体积流速下分析比较 图3 - 6 不同粒径下流速与塔板高度关系图 图3 7 不同宫能团芳烃在自建超高效液相色谱系统上分析谱图 图3 - 8 最大压力下自建与w a t e r su p l c 比较 图3 - 9 相同压力下自建系统与u p l c 比较 图4 - 1 高温液相色谱系统流程图 图4 - 2 台阶梯度程序一 图4 - 3 台阶梯度重复性图一 图4 4 线性梯度程序一 图4 5 线性梯度重复性图 v i 博体侈如虬孙筋拍”凹孔”始如甜吼舵钙甜们铝如钉”=爰一二三=|=|=三= 硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 图4 6 六味地黄丸中丹皮酚测定5 2 图4 7 六味地黄丸中马钱苷测定5 2 图4 8 六味地黄丸d a d 图5 3 图4 - 9 常温下六味地黄丸u v 色谱图5 3 图4 1 06 0 下六味地黄丸色谱图5 4 图4 1 11 0 0 六味地黄丸色谱图5 5 图4 1 21 2 0 下六味地黄丸色谱图5 5 图4 - 1 31 4 0 下六味地黄丸色谱图5 6 图4 - 1 4 4 支色谱柱串联分析六味地黄丸5 9 图4 - 1 5l o o 下4 支色谱柱串联分析六味地黄丸。5 9 图4 1 6 常温连续二维分析六味地黄丸6 1 图4 1 71 2 0 下连续二维分析六味地黄丸6 2 图4 1 8 常温下分析六味地黄丸e l s d 图 图4 1 9 常温下分析六味地黄丸两种检测器前1 0 m i n 比较“ 图4 - 2 0 常温下分析六味地黄丸两种检测器前l o - - 4 5 1 v m q 比较6 4 图4 - 2 1 常温下分析六味地黄丸两种检测器前4 5 9 0 m i n 比较。6 5 图4 - 2 26 0 下分析六味地黄丸e l s d 图6 5 图4 2 31 2 0 下分析六味地黄丸e l s d 图* 6 6 表2 1 不同流量下色谱参数比较2 2 表2 2 不同柱长的色谱参数比较2 2 表2 3 拟合参数2 5 表2 4 各物质在不同温度下5 处峰宽2 8 表2 59 0 下不同预热方式的柱效与峰宽。2 8 表2 - 6 流速为0 9 m l m i n 时温度对色谱参数的影响。2 9 表2 7 流速为5 m l m i n 时温度对色谱参数的影响3 0 表2 8 同一色谱柱在不同系统上色谱参数比较3 3 表3 12 1 x 5 0 m m ( 1 9 m m ) 流量测试3 7 表3 2 4 6 x 1 5 0 m m ( 5 m m ) 流量3 7 表3 37 次进样的色谱参数比较3 8 表3 - 4 色谱参数比较4 2 表3 - 5 自建系统与u p l c 在相同流速下比较4 5 表4 1 台阶梯度程序4 9 表4 2 线性梯度程序5 0 v i 硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 表4 - 3 压力随温度的变化5 6 表4 - 4 色谱柱评价结果5 7 表4 5 各色谱柱分析依利特反相标样时的柱效5 7 表4 - 6 多柱串联高温与常温下比较5 8 硕士论文高效，快速液相色谱系统的构建及评价 注释表 塔板高度； 涡流扩散项； 径向扩散系数； 传质阻力系数； 流动相线速度； 色谱柱背压； 流动相流速； 色谱柱长度； 流动相粘度； 流动阻力项； 填料颗粒直径； 最大柱效； 色谱柱最大； 物质在流动相中的扩散系数； 色谱柱渗透率； 理论塔板高度； 保留因子； 曲折因子； 为孔内体积和填料颗粒间体积 焓变； 熵变； 摩尔气体常数： 温度； 相率； b o l t z m a n n 常量： 溶液中分子层间的距离 流动相中有机溶剂的比例； d 1柱前连接管路直径 d 2色谱柱直径； d 3柱后连接管路直径； b脱附速率常数； l c d与柱管结构有关的参数； 九 吸附剂内孔隙率； q流动相通过检测池的流量； v 订 检测池有效体积； x h a b c u凹un中由h k。如蛆缱r t 。b 。中 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本 学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或 公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使 用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文 中作了明确的说明。 研究生签名：年月 日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或 上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或枧构送交并 授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密 论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：年月 日 硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 1 1 引言 1 绪论 高效液相色谱作为一种高效的分离分析手段，已经在全球的几乎所有化学实验室 中得到普及和应用【1 1 。随着社会的发展和科技的进步，人们在期望在得到尽可能多的 信息的同时，也希望尽可能缩短分析时间，因此，高效、快速的分离方法方法发展已 经成为分析化学领域的重要研究方向印j 。 今天，在科技的许多领域里，色谱分离分析所涉及的样品越来越复杂，样品的数 量持续增长，对建立快速、高效的分离方法的呼声越来越高。通过直接缩短柱长、加 大固定相粒径的方法衍生出来的f l a s h 色谱、改变填料结构产生的整体柱色谱等可以 在一定程度上提高分离速度，也相应存在一些局限性。减小填料直径产生的超高压色 谱和提高温度产生的高温色谱可以部分集成快速、高效的统一，显示出强大的生命力。 1 2f l a s h 色谱 缩短分离时间的最简单方法是使用短的色谱柱和较高流速。由于柱效与柱长成反 比，柱长的缩短必然导致柱效降低。f l a s h 色谱法使用的色谱柱柱长在1 0 7 5 r n m 4 1 ， 因此多用于实验室样品纯化与富集，只有少数研究采用短柱在等度条件下用u v 检测 分析【孓6 】。例如，1 9 9 8 年m u t t o n 7 】报导了使用4 6 x 3 3 m mi d 色谱柱分析同一样品的时 间，比普通4 6 x 1 5 0 m mi d 的分析时间缩短了1 1 5 倍( 流速从l m l m i n 提高到2 5 m l m i n ) ，但分离度有所下降。短柱在梯度条件下使用【s 棚较多，l e s l i er o m a n y s h y n | 聊 研究了快速梯度条件下色谱分离的特征，认为梯度混合体积对分离影响较大，s h u i c h i y a m a m o t o 8 】等对短色谱柱的梯度优化进行了理论说明，m e l v i nre u e r b y t l l l 等在3 0 m m 色谱柱上建立了二元溶剂梯度分析保留时间模型。短柱结合高灵敏度和高选择性的检 测器可以弥补一定的缺陷，t o m o m ig o t o 1 2 - 1 3 等用e s il c m s m s 在1 0 m m 长短柱上 分析了葡萄酒和水果中的- 甲基氨基甲酸盐农药残留。短柱与m s 、e l s d 、d a d 、 r i d 和e c d 等仪器的联用增加了有效分析，但仍旧难以克服分离复杂物质的困难。 与f l a s h 色谱法不同，整体柱通过改变柱床结构，加快了分离速度。 1 3 整体柱色谱 基于连续多孑l 整体床的新型整体柱( m o n o l i t hl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , m l c ) 被认 硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 为是色谱固定相发展的新突破第四代色谱柱【1 4 】。硅胶或聚合物基质的整体色谱柱 采用原位制备技术，具有大孔和中孔的双孔结构，孔的大小可以单独控制以控制渗透 性和产生较高的柱效1 1 孓1 6 1 ，缩短了溶质在整体柱的扩散途径，减小了柱的阻抗因子， 大大增加了色谱柱的渗透率。整体柱还有两个重要的特征：分离度和键合能力不受流 速的影响【1 7 1 ，在高流速下保持了较高的柱效和分离度。 1 9 9 1 年n a k a n i s h i 和s o g a t ls l 首次制成整体柱以来，不少文章和专著叙述了整体柱 的制作与应用，整体柱得到长足发展和广泛应用。整体柱使用的基质有聚合物基质和 无机基质两种。聚合物基质主要是聚( 甲基) 丙烯酸【”】、聚苯乙烯脚】和聚丙烯酰胺【2 l 】 等，在起泡剂的存在下聚合，通过改变起泡剂类型和起泡剂与单体的浓度比控制孔的 大小，孔径约0 5 1 5 岬蚴。无机基质主要有硅胶】、碳叫和氧化锆“】，碳和氧化 锆基质机械强度大，可以耐高压，具有较好的热稳定性和化学稳定性。硅胶基质的整 体柱比聚合物基质的柱效高，应用最广泛【2 3 1 。现在已经商品化的整体柱d 7 1 有c l m ( b i a s e p a r a t i o n s ) 、u n o ( b i o r a dl a b o r a t o r i e s ) 、s w i i tm o n o l i t h i cc o l u m n s ( i s c o ，i n c ) 和 m o n o l i t h i cc a p i l l a r yc o l u m n sa n dn a n oc o l u m m ( l cp a c k i n g s d i o n e x ) 。 整体柱适于分离扩散系数小的大分子，n a k a r t i s h i l 2 v 2 9 1 和t a n a k a 3 0 】等分离聚合多 肽物质时，无论在等度还是梯度条件下都取得了较填充柱更高的柱效。一般来说，整 体柱的柱效与3 5 9 m 硅胶填充柱的柱效相当，而柱压比5 “m 硅胶填充柱低3 0 - 4 0 3 q 。因此，流速大和柱长较短，可以实现快速分离 3 2 - 3 3 1 。整体柱可以连接使用，从而 产生较高的塔板数以分离难分离组分，t a n a k a 等【3 4 】串联了1 4 个整体柱，柱效达到了 1 0 万n m 。 近期的整体柱制备发展了在c e 、c e c t 2 5 j 5 3 6 】和m i c r o l c e 3 7 】及二维l c 3 1 矧等方 面的应用，但整体柱有其自身的缺陷】，每一个整体柱必须单独的制备和化学改性， 重现性较差，不利于批量生产。由于整体柱内径较大，需要耗费大量的流动相和样品。 大流量也限制了它与m s 的联用。商品化的整体柱仍然较少，硅胶基质的整体柱适用 的p h 值范围较窄( 2 p h 5 0 ) ，可以观察到单一的峰，而当d a m k 6 h l e r n u m b e r 大小居中时( 1 d a 5 0 ) ， 就会出现峰展宽或者不规则的峰形。 1 5 2 2 热差 常规h p l c 中，当流动相温度小于色谱柱温度时，即靠近柱壁的流动相温度大于 柱中心的流动相温度，导致了流速的不均匀，发生了峰宽展宽，柱效下降现象。刘光 会等【1 删认为，流动相在色谱柱和柱后的连接管、检测器应保持在同一温度，当系统 中存在一个或几个冷点时，柱效就会大大降低。 对流动相进行预热可以避免由于热差带来的谱带展宽。预热的方法有以下几种 【l o l 】：空气浴预热、油浴预热、水浴预热、h e a tb l o c k 预热和制冷片预热。表l - 4 不同 预热方式比较所示为这几种预热方法的优缺点，其中空气浴预热由于其操作简单，较 为常用。 表l - 4 不同预热方式比较 t a b l e1 - 4c o m p a r a t i o no f d i f f e r e n th e a t i n gm e t h o d 硕士论文商效、快速液相色谱系统的构建及评价 1 5 3 高温下使用的色谱柱 随着填料技术的发展，新型耐超高温填料的出现极大促进了h t l c 的发展。常用 的固定相有硅胶、金属氧化物、石墨化炭和聚合物。 1 5 3 1 硅胶基质固定相 硅胶基质的固定相具有比表面积大、孔结构和孔径容易控制等优点【- 嗍，易于表 面改性获得具有特定功能的固定相 1 0 3 - 1 0 4 ，经过修饰改性可以改善热稳定性【- 州。 y u k i 掣1 ”】用异丙基丙烯酰胺和丁基丙烯酸盐修饰硅胶，在高温下分离了5 种类固 醇和缩胺酸。 1 5 3 2 金属氧化物基质固定相 氧化锆基质【l 嗍具有良好的热稳定性和化学稳定性【1 0 9 ，甚至可以在p h 值0 1 4 范 围内使用。s c o t t 等1 1 0 1 分离8 种烷基苯的衍生物时使用温度达2 0 0 。c 。m a t i n 掣1 1 1 1 考 察了6 种固定相的热稳定性，认为氧化锆基质的固定相稳定性较差。 氧化钛基质也是高温下使用的固定相。s c o t t 等“加i 研究了以c 1 8 修饰的t i 0 2 固 定相，在1 6 0 。c 下使用时稳定性良好。 1 5 3 3 聚合物基质固定相 聚合物基质可以在较高的温度范围和较宽的p h 范围内不发生溶解【1 1 2 1 。c a r r 等 通过实验发现聚乙烯固定相具有良好的性能，可以在1 0 0 下使用的柱体积超过1 1 万，在1 5 0 c 下使用的柱体积达到9 0 0 0 。由于聚合物的解聚，聚合物为基质的固定相 使用温度不能超过2 5 0 。 1 5 3 4 石墨化炭固定相 石墨化炭固定相结构较简单，不需要在表面上键合或涂敷用于可使溶质保留的有 机官能团，因此可以在较高的温度下使用l l ”】，甚至可以在2 0 0 以上使用。但石墨 化炭的机械强度较差，不适合于高压下使用。 与常规h p l c 相比，超高效液相色谱和高温液相色谱实现快速分离的同时维持了 较高的柱效，是近期高效液相色谱研究的热点。改进常规h p l c 、优化分离条件以实 现快速分离的效果是一种廉价易行的方式，可以普及使用。 硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 1 6 论文的主要工作 建立高效、快速的分离方法是生命科学、环境科学等诸多领域的的迫切需要，快 速色谱在缩短分离时间、节省溶剂等方面有着得天独厚的优势。超高压液相色谱和高 温液相色谱是近期分析化学领域研究的一大热点。本论文作为“十五”国家科技攻关重 大项目科学仪器研制与开发( n o 2 0 0 1 b a 2 1 0 a 0 1 ) 以及国家自然科学基金资助项目 多维分离系统的输运特征与正交性研究( n o 2 0 3 7 5 0 4 0 ) 研究的一部分，在探讨温 度和压力对色谱保留行为影响的基础上，针对超高压液相色谱和高温二维液相色谱的 仪器系统构建系统展开工作。 论文主要包括以下内容： 探索压力( 流速) 对色谱保留行为的影响规律； 测试高压下大连依利特公司2 3 0 系列仪器的性能，构建超高压液相色谱系统；评 价系统的性能，并与w a t e r s 公司a c q u i t y u p l c 做对比分析； 探索温度对色谱行为的影响规律；构建高温液相色谱系统；以六味地黄丸为样品 评价系统。 结合高温与高压液相色谱的特征，构建多柱串联液相色谱系统。探索高温二维系 统在分析复杂样品中的应用；以双检测器串联使用可能得到色谱信息量。 1 5 硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 2 压力和温度对液相色谱行为的规律探索 2 1 引言 在常规h p l c 系统上构建快速色谱系统，主要影响因素有两个：压力和温度。提 高流量是加快分离速度的直接方式，在仪器使用压力允许的范围内，增加流速是一种 加快分离速度的有效方法。升高温度也是加快分离时间的重要手段。升高色谱柱温度 可溶质扩散系数增大、流动相粘度降低、水的介电常数降低等效果。溶质扩散系数的 增大，使传质速率提高，在一定程度上可改善柱效：流动相粘度降低，使色谱柱的背 压降低，在相同的压力下，可以增加流动相线速度，加快分离速度，缩短分离时间。 随温度升高，水的介电常数降低，分离极性减弱，甚至可以使用水代替有机溶剂作流 动相，发展“绿色”分析化学方法。 考察压力( 流量) 和温度对色谱行为的影响将有助于新型分析系统的构建。在常规 h p l c 系统上，探索升高压力和温度条件下系统的稳定性，寻找降低柱外效应的措施。 2 2 实验设备及样品 ” 本章实验中使用的仪器和试剂均由大连依利特公司支持。 2 2 1 实验设备 p 2 3 0 高压恒流泵、e c 2 0 0 0 色谱数据处理工作站、u v 2 3 0 + 紫外可见检测器，以 上仪器为大连依利特分析仪器有限公司产品；a s 3 1 2 0 超声脱气机( a u t o s e i e n e e ) 、 m i u i - q c e r t t u r y 超纯水系统( m i l l i p o r e ) 、a e l 0 0 sm e t r l e r 电子天平( 梅特勒 托利多仪器有限公司) 、4 - 6 0 5 流量计( g j ci n s l n m l e n t sl t d ) 、r 6 0 0 2 调压变压器( 上 海无线电二厂) 。 2 2 2 样品与试剂 甲醇( 色谱纯、f i s h e rs c i e n t i f i c ) 、硝基苯( 分析纯、天津市科密欧化学试剂开发中 心) 、萘( 分析纯、天津市科密欧化学试剂开发中心) 、芴( 分析纯、天津市科密欧化学 试剂开发中心) 、尿嘧啶( 分析纯、s i g m a c h e m i c a l ) 、苯( 分析纯、天津市科密欧化学试 剂开发中心) 、苯乙酮( 分析纯、北京瀛海精细化工有限公司) 、苊( 分析纯、北京百灵 威化学试剂有限公司) 、菲( 分析纯、北京百灵威化学试剂有限公司) 、蒽( 分析纯、北 1 6 硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 京百灵威化学试剂有限公司) 、苊烯( 分析纯、北京百灵威化学试剂有限公司) 。 2 2 3 样品制备 1 号标样的配制 用分析天平称取尿嘧啶l o o m g 、萘2 0 0 m g 分别放入5 0 m l 容量瓶中。移液管量 取苯乙酮o 0 5 m l 、苯1 7 m l 分别放入5 0 m l 容量瓶中。加流动相( 甲醇水，8 5 1 5 ) 定 容，作为原液。用移液管量取尿嘧啶和萘原液各l o m l 、苯2 0 m l 和苯乙酮1 5 m l 放 入容量瓶中，用流动相( 甲醇水，8 5 1 5 ) 稀释到l o o m l 。用移液管量取此溶液l o m l 用流动相( 甲醇水，8 5 1 5 ) 稀释定容到l o o m l 。各物质的浓度为：1 尿嘧啶： 0 6 0 x 1 0 4 m o f l ；2 苯乙酮：1 2 8 x l 酽m o l l ；3 苯：7 6 5 1 0 - 3 m o l l ；4 萘： 3 1 2 x 1 0 4 m o f l 。1 号标样的标准谱图如图2 1 所示： “- 誊 = 虽一 t i m e ，r a i n 图2 - 1i 号标样的标准色谱图 f i g 2 - 1c h r o m a t o g r a mo f s a m p l e1 c o n d i t i o n ：c o l u m n ：4 6 x 1 5 0 m m ( 5 “m ) ；m o b i l ep h a s e ：m e t h a n o l w a t e r ( 8 5 1 5 , v v ) ； f l o wr a t e ：0 9 m l m i n ；d e t e c t i o n ：u v 2 5 4 n m ；t e m p e r a t u r e ：a m b i e n t ； i d e n t i f i c a t i o n ：1u r a c i l ；2a c e t o p h e n o n e ；3b e n z e n e ；4n a p h t h a l e n e 依利特公司反相标样 依利特公司使用的评价反相色谱柱的标准样品为：尿嘧啶、硝基苯、萘和芴。样 品的标准色谱图见图2 2 。 1 7 硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 d 51 a1 s t i m e ，m i n 图2 - 2 依利特反相标样标准色谱图 f i g 2 - 2c h r o m a t o g r a mo f s a m p l eo f e l i t ec o r p o r a t i o n c o n d i t i o n ：c o l u m n ：4 6 x 2 5 0 m m ( 5 t i m ) , m o b i l ep h a s e ：m e t h a n o l w a t e r ( 8 5 1 5 , v v ) ； f l o wr a t e ：0 9 m l m i n ；d e t e c t i o n ：u v 2 5 4 n m ；t e m p e r a t u r e ：a m b i e n t ； i d e n t i f i c a t i o n ：1u r a c i l ；2n i t r o b e n z e n e ；3n a p h t h a l e n e ；4f i u o r e n e 芳烃样品 芳烃混合物样品为苊烯、苊、芴、菲和葸，标准图谱如图2 3 所示： 差邮 = 一 晏“ 2 t i m e ，m n 图2 - 3 芳烃样品的标准图谱 f i g 2 - 3c h r o m a t o g r a mo f a r e n e c o n d i t i o n ：c o l u m n ：4 6 x 2 5 0 m m ( s t t m ) ；m o b i l ep h a s e ：m c t h a n o l w a t e “7 5 2 5 ，v v ) ； f l o wr a t e ：1 0 m l d m i n ；d e t e c t i o n ：u v 2 5 4 n m ； i d e n t i f i c a t i o n ：1u r a c i l ；2n i t r o b e n z e n e ；3n a p h t h a l e n e ；4f l u o r e n e 1 8 妻、ica巧 硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 2 3 流量对色谱参数的影响 升高压力( 增加流量) 是加快分离速度的常用方法。由于保留时间与流速成反比， 加大流速直接减小了保留时间，缩短了分析时间，因此是最常用的方法。考察流量对 柱效、保留时间和分离度的影响，可以选择最优条件，优化仪器性能，甚至使用亚2 t t m 填料时的方法转移都有帮助。以下实验详细研究了温度对柱效、保留时间及体积流速 比较等。 2 3 1 流量对柱效的影响 在其他色谱条件不变时，提高流量是加快分离速度的最简单方法。根据v a n d e e m t e r 方程可知，当流速逐渐增大时，柱效先降低后升高，任何物质都有一个最佳 流速，超过和低于最佳流速都会导致柱效下降，如图2 - 4 所示。 o o t0 io ，口0jn l i n e a r v e l o c i t y ( c m ，s ) 图2 _ 4 流速与塔板高度关系图 f i g 2 - 4c u r v eo f p l a t eh e i g h tv sl i n e a rv e l o c i t y 从图中可以看出，随着流量的增大，柱效先降低后升高，得到最大柱效和最佳流 速。萘的最佳流速为0 3 m l m i n ，最大柱效为6 7 4 万n m ，分离时间却达1 1 0 7 r a i n ， 分析时间较长。提高流速能够加快分离速度，提高流速到0 9 m l m i n ，分离时间缩短 到3 8 6 r a i n 。速度提高了3 倍，柱效5 5 5 万n m ，分离度为3 1 6 ，达到了完全分离。 因此，在保证分离效果( 柱效适宜) 的条件下，提高流速是加快分离速度的有效方法。 由于最佳流速时的分离时间过长，实验室实际使用的流速一般高于最佳流速以加快分 离速度。 2 3 2 流量对保留时间的影响 样品在最佳流速下分离，柱效虽然最高，但会极大的增加分离时间，增加流量是 1 9 一亘ir-lisia鼻p节一山 硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 加快分离速度的有效方式。如图2 - 5 所示，流速0 3 m l m i n ，分析时间却有6 6 4 s ，增 加流速到5 0 m l m i n 分离时间骤减至4 9 s ，速度提高了1 3 6 倍，速度提高了近1 0 倍， 大大节约了时间，提高了工作效率。关键峰对的分离度只有1 2 8 ，柱效也下降到1 3 7 万n m 。 茎 = 罢 嚣一 d t i m e ，m n 图2 - 51 号标样在不同流速下分离比较 f 培2 - 5c o m p a r a t i o no f s a m p l e1u n d e rd i f f e r e n tf l o wr a t e c o n d i t i o n ：a5 0 m l m i n ；b0 3 m l m i n 增大流速，造成了分离度下降，以至于关键峰对不能达到基线分离是得不偿失的。 在保证两物质能基本分离的条件下，选取合适的分析条件是非常重要的。对于本实验， 合适的流速是3 5 m l m i n ，关键峰对的分离度为1 6 8 ，达到了基线分离，分离时间也 相对较短，只有1 1 3 m i n 。 从图中还可以看出，在相同进样量下，色谱峰的峰面积在高流量下似乎减小了。 而紫外检测器响应信号值与样品的浓度成正比例关系，相同的进样量下增加流量不会 降低信号值。这从体积流速图上看以看出来。 2 3 3 体积流速下色谱峰型比较 将图2 5 时间坐标换做体积坐标，得到图2 - 6 。流量增大为5 0 m l m i n 时，峰宽 相应变宽了，溶质流出时间相对流出体积而言推后了。从图2 - 6 可以看出，流量为 0 3 m l m i n 和5 0 m l m i n 各峰的面积仍然相等。 2 0 硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 如a e 、 璺1 0 d 2 v o i u 晶，m l 4 图2 - 6 体积流速下比较峰面积 f i g 2 - 6c o m p a r a t i o no f p e a ka r e au n d e rv o l u m er a t e 相同的色谱柱，流速的增大并没有增加洗脱能力，而是洗脱能力变弱，即体积流 速图上，5 0 m l m i n 的出峰时间推后了。由此可见，在相同的体积流速下，增大流速 并不能有效的将溶质洗脱出来，增大流速不是加快分离速度的根本措施。 2 3 4 流量与压力关系 其他条件相同时，压力与流速成正比，提高流速必然造成压力的升高。绘制流速 与压力关系曲线得图2 7 。 西 加 扩 l 加 主 5 0 图2 - 7 流量与压力关系图 f i g 2 - 7c u r v eo f p r e s s u r ev 5f l o w r a t e 从图中可以看出，流速与压力关系曲线接近直线，符合公式2 的预测。由于流速 与压力成正比关系，常规h p l c 仪器的限压为4 0 m p a ，将填充了5 1 a n 填料色谱柱的 柱长限制在2 5 c m 以内。柱长较长，复杂样品可以获得充分的分离，常规仪器上如果 硕士论文 高效、快速液相色谱系统的构建及评价 要使用多柱串联分析，就必须提高系统压力( 建立超高压液相色谱) 或者采用其他方 法，例如升高温度( 高温液相色谱) 。 由于色谱的背压与填料粒径的平方成反比，4 0 m p a 限制填充1 5 1 m a 填料的色谱 柱长度只有3 - 4 c m 。在现代h p l c 发展趋势下，使用小颗粒填料是必然的选择，要利 用小颗粒填料所产生的高柱效和快速的性能，提高仪器的使用压力势在必行。 升高流速会产生系统稳定的问题。通过比较在流速为0 9 m l m i n 与5 m l m i n 时 的保留时间、塔板数、不对称度、峰面积和分离度( 见表2 1 ) 的重现性，我们可以看 出，增加流速后，保留时间和峰面积的重现性良好，r s d 值均在l 以下，满足了色 谱定性和定量分析。柱效和不对称度的波动较大，但仍小于3 ，所以大流量下的系 统稳定性较好。 表2 - 1 不同流量下色谱参数比较 t a b l e2 - 1c o m p a r a t i o no f p a r a m e t e r su n d e rd i f f e r e n tf l o wr a t e 2 3 5 不同柱长分离速度比较 如f l a s h 色谱法所述，柱长缩短能在一定程度上加快分离速度。由于柱长与柱效 成反比，柱长的缩短，必然造成柱效的下降和分离度的降低。从表2 2 可以看出，柱 长越大柱效较高，换算到绝对柱效后差距更显而易见，1 5 0 r a m 柱长和2 5 0 r a m 柱长的 绝对柱效分别为0 7 8 万和1 8 3 万，相差了1 3 倍。 表2 - 2 不同柱长的色谱参数比较 t a b l e2 - 2c o m p a r a t i o no f p a r a m e t e r so f d i f f e r e n td i m e n s i o n 指l 和2 号峰的分离度 硕士论文高效、快速液相色谱系统的构建及评价 分离度的降低主要是由柱长缩短造成的，因为增加柱长后，样品在色谱柱上保留 充分，各溶质成分之间得到了充足的分离。因此，分离简单样品时分离度的下降非常 明显，分离复杂样品则更为困难，由于峰容量低，可能不足以提供足够多的样品中物 质的数量和含量信息。 增大流量对色谱参数一方面加快了分离速度，另一方面也提高了柱压。增加流速 并没有加快溶质的传质速率，从根本上加快分离速度。而升高温度加剧了分子运动， 减小了传质阻力，加快了分离速度。温度的升高降低了流动相的粘度，降低了色谱柱 背压，可以使用较长的柱长或者多柱串联。因此，研究升高温度对色谱参数的影响具 有重要意义。 2 4 温度对色谱参数的影响 h p l c 分析中使用较高的温度，增大了溶质的扩散系数，提高了柱效；降低了流 动相的粘度，减d , t 传质阻力，降低了色谱柱的背压。升高温度还可以加快分离速度， 改善峰型，调整选择性等，是一个有效而又实用的方法，与其它方法相比，具有其独 特的优势。以下实验研究了温度对保留时闻、柱效、不对称度和选择性的影