（微生物学专业论文）解烃菌的生物多样性及新种的多相分类.pdf

南开大学硕士研究生毕业 ( 学位) 论文 a b s t r a c t f i ft y h y d r o c a r b o n - d e g r a d i n g b a c t e r i a a n d w a t e r s a m p l e s . t h ir ty p a r a ff in l i q u i d w e r e f u g r a m - n e g a t i v e s t r a i n s a n d si x 找h e r o f t h e m i n v e s t i we r e c o l l e c t e d fr o m t h e s o i l w h i c h e f f i c i e n t l y e m u l s i f i e d t e n seof p h e n o t y p i c c h a r a c t e r i s t i c s a n d t we n t y - t h e s u b s ix g a t e d . t h e y g r a m - p o s i t i v e i n c l u d e d s t r a i n s . th e i r s e q u e n t a r d r a s h o w e d t h a t t h e s t r a in s d i s p l a y e d g r e a t d i v e r s i t y . b a s e d o n t h e p h y l o g e n e s i s a n a l y s i s 1 6 s r r n a g e n e , t h e y b e l o n g e d t o t h e f o l l o w i n g g e n u s i s : r h o d o c o c c u s 、 b a c i l l u s 、 b r e v i b a c i l l u s 、 b r e v i b a c t e r i u m、 c o r y n e b a c t e r i u m、 g o r d o n i a , a r t h r o b a c t e r , p s e u d o mo n a s . a n e w s p e c i e s w a s i d e n t i f i e d b y p o l y p h a s i c t a x o n o m y . i t w a s n a m e d g o r d o n ia p a r a jj rin iv o r a n s ( = a s 4 . 1 7 3 0 t = d s m 4 4 6 0 4 t ) . t h e s t r a in p o s s e s s e s w a l l c h e m o t y p e n ，m k - 9 ( h 2 ) a s t h e p r e d o m i n a n t m e n a q u in o n e , r e l a t i v e ly l o n g - c h a i n m y c o l i c a c i d s 5 2 - 6 2 c a r b o n a t o m s o f t h e g o r d o n ia t y p e , s t r a i g h t - c h a i n s a t u r a t e d a n d m o n o u n s a t u r a t e d f a t ty a c i d s a n d 1 0 - m e t h y l - b r a n c h e d f a t t y a c i d s . t h e g + c c o n t e n t o f t h e d n a i s 6 6 m o l %. t h e h i g h e s t s e q u e n c e s i m i l a r i ty w i t h o t h e r m e m b e r s o f go r d o n i a i s 9 6 . 9 %. k e y w o r d s : h y d r o c a r b o n - d e g r a d i n g b a c t e r i a , p h y l o g e n y , p o l y p h t a x o n o m y , b i o d i v e r s i ty as i c 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位) 论文 材料与方法 一 样品和菌种 1 . 样品来自油田的含油土壤和地层水， 将这些水样用无菌管收集放于 4 冰 箱保存备用 。 2 . 菌 株g o r d o n i a a m e r a e a s 4 . 1 1 2 6来 自中科 院微 生物 所 ，g o r d o n i a p o l v i s o p r e n i v o r a n s d s m 4 4 3 0 2 由德国菌保中心提供。分离得到的菌株保藏 在中科院微生物所和德国菌保中心。 二.培养基 1 .富集培养基 ( 1 l ) ( n h , ) , s 0 4 0 . 5 g k h , p 0 4 0 . 7 5 g n a , h p 0 4 0 . 2 g m g s 0 4 0 . 0 2 g c a c l , 0 . 0 2微量元素 l 0 m l g l u c o s e l o g p a r a f f i n l i q u i d 1 0 m l p h 7 . 0 2 .培养培养基( 肉汁陈培养基) ( 1 l ) 蛋白陈 l o g n a c l 5 g牛肉青 3 g琼脂粉 1 5 g p h 7 . 0 3 .陈水基础培养基( 比) 蛋白膝 5 g , n a c i 5 g p h 7 . 0 4 .孚 七 化实验培养基 同1 ， 但不加g l u c o s e p h 7 . 0 5 .酪蛋白水解培养基 将 5 0 己灭菌的脱脂牛奶与肉汁陈培养基等量混合 6 .纤维素水解培养基 在培养皿上先加1 5 m l 2 % 的水琼脂， 凝后加入含有0 . 8 % 的纤维素粉和1 . 5 % 的琼脂的陈水基础培养基中，p h 7 . 0 o 7 . m r v p培养基 ( 1 0 蛋白陈 5 g g l u c o s e 5 g k , h p o , 5 g p h 7 . 0 若是芽抱杆菌则以 n a c l代替 k , h p o , 8 .明胶液化培养基 ( 工 l ) 蛋白陈 5 g明胶 1 5 0 g p h 7 . 2 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位)论文 9 . 西蒙斯氏柠檬酸盐培养基 n a c l 5 g m g s o , 7 h 2 0 0 . 2 g n h 4 h 2 p o , 1 g k 2 h p o , 3 h 2 0 l g 柠檬酸钠 2 g澳百里酚蓝 1 % 水溶液 i o m l水琼脂 1 2 g p h 7 . 0 1 0 .苯丙氨酸脱氢酶培养基 酵母膏 3 g n a c l 5 g n a , h p 0 , 1 g琼脂 1 2 g d l 一 苯丙氨酸 2 g p h 7 . 0 1 1 . l b培养基 参见 u . ) 含糖培养基过滤灭菌，其它 1 2 1 0c 3 0 m i n灭菌。 三. 烃降解菌的生物多样性研究方法 1 . 将采集样品的富集培养于 3 7 c 摇床富集培养4 d ， 稀释涂平板于 3 7 0c 温箱 培养 3 d ，将所得到的单菌接种于含液蜡的液体培养基中，同时做空白对照 3 7 0c , 2 5 0 r / m i n摇床培养 7 d ，观察液蜡的乳化情况，选取能够有效降解液 蜡的菌株分类鉴定。 2 . 用相差显微镜观察菌体的形态、大小、有无芽抱及运动性。 3 . k o h试验 在玻片上滴一滴3 yo k o h 溶液， 用接种环挑取过夜培养的新鲜菌落涂于 液滴处，l m i n分钟后轻轻抬起接种环，观看是否有丝拉出。革兰氏阴性菌 可以在 k o h中破壁，有丝拉出。 4 . 用透射电子显微镜观察菌体的形态、大小、鞭毛及后期生长情况:分别 取培养过夜、 4 d 和 8 d的菌落， 在喷碳的铜网上点 5 )l 不同浓度的稀释液， 电镜观察。 5 . 生长条件的测定 ( 1 ) 不同 p h对生长影响的测定:将肉汁陈培养基用无菌的 1 m o l / l n a o h调 4 . 0 -1 0 . 5范围内不同的 p h ，按 1 %的接种量接种，3 7 摇床培养 2 4 h r , 于6 0 0 n m 处测 0 . d . 值监测菌体生长情况。 ( 2 )不同 n a c l 对生长影响的测定:调整肉汁陈培养基中的 n a c l 加入量， 使盐浓度 ( % )分别为 0 , 0 . 5 , 1 , 2 , 5 . 7 和 1 0 n a c l ，接种量 1 %, 3 7 摇床培养 2 4 h r ，于 6 0 0 n m处测 0 . d . 值监测生长情况。 ( 3 ) 不同温度对生长影响的测定: 肉汁陈培养基， 接种量 1 0， 分别在 4 - 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位) 论文 6 0 范围内的不同温度下培养 4 8 h r , 6 0 0 n 。处测 0 . d . 值检测生长情况。 6 .生理生化实验 ( 1 ) 淀粉酶活性检测: 肉汁陈培养基中加入 0 . 2 % 的淀粉制成平板， 点上菌 液，3 7 0c 温箱培养 4 8 h r 后用 l u g o l s 碘液检查透明圈的产生情况，有则 为阳性 。 ( 2 ) 酪蛋白酶活性检测:在牛奶琼脂培养基平板上接种菌体，3 7 0c 温箱 培养 4 8 h r 后观察透明圈的产生情况，有则为阳性。 ( 3 ) 明胶水解试验:肉汁陈培养培养基中加入 1 %的明胶，制成平板，点 种 4 8 h r后，用 f r a z i e r试剂检测有无透明圈，有则为阳性。 ( 4 ) 醋酶活性检测:在培养培养基中加入 1 %的吐温 8 0 ，制成平板，点 种菌液，3 7 c 温箱培养 4 8 h r ,观察有无白色晕圈出现，有为阳性。 ( 5 ) 氧化酶活性检测:在千净的培养皿放一张滤纸，滴上蓝色的 1 %二 甲基对苯二胺水溶液，用白金接种环取新鲜菌落，涂抹在湿润的滤纸上， 在 1 0秒内出现红色为阳性反应，1 0 -6 0秒出现红色为延迟反应，6 0秒后 为阴性反应。注意铁、镍等金属可催化二甲基对苯二胺呈红色，不宜使用。 ( 6 ) 触酶试验:加一滴 5 %的 h , 0 , 水溶液于新鲜的菌落上，有气泡则为 阳性反应。 ( 7 ) 脉酶试验:肉汁陈培养基固体斜面，接种，培养 3 d ，制备成浓的菌 悬液，加入一滴酚红试剂，用 h c 1调节至呈橙红色，分为两管，在一管中 加入结晶的尿素0 . 0 5 g ， 另一管不加作为对照， 在几分钟内呈红色为阳性反 应 。 ( 8 ) h , s产生试验:肉汁陈培养基中加入 0 . 1 %的半耽氨酸，接种量 1 % 静止培养 4 d ，于试管口夹一条用 1 %醋酸铅溶液浸泡过的滤纸条，滤纸条 变黑即为阳性反应。 ( 9 ) 叫噪试验:肉汁陈培养基中加入 0 . 1 %的色氨酸，接种后静止培养 3 d ，加入 2 m l乙醚振荡，静止分层后加 5滴叫垛试剂，液层界面出现红色 为阳性 。 ( 1 0 ) 硝酸盐还原试验:在比色磁皿中倒入少许静止培养 1 , 3 , 5 d的培 养液及未接种的培养液，各加a 液、b 液一滴，溶液如变粉红、玫瑰红、橙 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位) 论文 色、棕色等表示有亚硝酸盐的存在;如无红色出现，滴加二苯胺试剂，如 呈蓝色反应，表示培养液中仍有硝酸盐又无亚硝酸盐，为阴性;如不呈蓝 色，表示硝酸盐和亚硝酸盐都已被还原成其它物质，为阳性反应。 ( 1 1 ) m . r 试验:m r -v p 培养基，3 0 c培养 2 d . 6 d ，在培养液中加入一 滴甲基红试剂，红色为甲基红试验阳性，黄色为阴性。 ( 1 2 ) v - p 测定: 取培养液和 4 0 % n a o h 溶液等量混合， 加少许肌酸， 1 0 m i n 如培养液出现红色， 即为阳性反应。 ( 1 3 ) 纤维素水解:在培养皿中先加 1 5 m l 2 % 的水琼脂， 凝后加入含有 0 . 8 %的纤维素粉和 1 . 5 % 琼脂的陈水基础培养基， 同时做不含纤维素的培养 基为对照， 3 7 培养2 周， 菌落四周有较澄清的晕圈者为阳性， 无晕圈者为阴 性。 ( 1 4 ) 七叶灵水解:在普通的肉汁陈琼脂培养基中添加 0 . 1 % 的七叶灵和 0 . 0 5 % 的柠檬酸铁，分装试管摆斜面，3 7 培养2 周， 产黑褐色色素者阳性， 反之阴性 。 ( 1 5 ) 酪氨酸分解:肉汁陈培养基中分别加入 0 . 5 % t y r o s i n e ，接种菌 株于平板上， 3 7 c 温箱， 静止培养2 周， 定期观察菌落周围是否有透明的晕圈 有的则为阳性 ( 1 6 ) 柠檬酸盐利用:在西蒙斯氏柠檬酸盐斜面培养基上划线接种，3 7 培养培养 7 d 。显示蓝色者为阳性。 ( 1 7 ) 苯丙氨酸脱氢酶: 按照 1 % 的浓度接种， 3 7 0c 培养培养 2 4 h r 。 将 1 0 % (w 八)的 f e c 1 :, 溶液 4 - 5滴滴到生长菌的斜面上，产生绿色时为阳性反 应，即表明有丙酮酸生成。 ( 1 8 ) 糖醇利用试验:将各种过滤除菌的糖醇溶液加到基础培养基中， 使终浓度为 1 %。接种 1 % ，以不加任何糖的基础培养基作对照，3 7 培养 2 周，在5 6 0 n m 处测0 . d . 值，检查其生长情况。 ( 1 9 ) 产酸实验: 将各种过滤除菌的糖醇溶液加到陈水基础培养基中。 然 后加入 0 . 0 0 3 % 的澳甲酚紫指示剂，3 7 培养 2周， 颜色变黄者证明有酸产 生 。 7 . 1 6 s r d n a的扩增和限制性酶切 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位)论文 ( 1 ) 小量提取菌体总 d n a的提取 a . 培养菌体: 从新划线的琼脂平皿上用无菌牙签挑取单菌落， 接种 5 m l 肉汁膝培养基中，3 7 摇床培养 1 2 h r o b . 将以上培养液转移到5 m l 离心管中，4 c, 5 0 0 0 r / m i n ,离心 5 m i n a 弃掉上清夜，让离心管倒置在干净的滤纸上，轻轻叩击离心管以去掉残余 的液体。 c .将细胞沉淀物通过涡旋振荡悬浮在 1 m l 5 0 m m t r i s ( p h 8 . 0 )缓冲 液中， 然后加入0 . 2 m l 新配制的溶菌酶溶液( 1 0 m g / m l i n 0 . 2 5 m t r i s , p h 8 . 0 ) 和 0 . 8 m l 0 . 2 5 m的 e d t a 溶液， 混匀后于 3 7 c处理 2 0 m i n 。 再加入 2 0 0 u l 1 0 % 的 s d s溶液，混匀后放置于 5 5 处理 5 m i n o d . 加入等体积的酚一 氛仿 ( 1 : 1 ) ，来回颠倒离心管抽提一次。将上层 水相转移到一新的离心管中。 e .加入 3 u l 1 0 m g / m l的ba s e 溶液，3 7 水浴中处理 3 0 m i n e f ，用等体积的酚一 氯仿 ( 1 : 1 )抽提若干次，直到无白色变性蛋白出 现。然后加入 1 / 1 0 体积的 3 m o 1 / l n a a c及 2 倍体积的冷冻无水乙醇，- 2 0 ，c放置 3 0 m i n a h .然后， 1 2 , 0 0 0 r / m i n 离心 i o m i n ，使 d n a 沉淀，弃去乙醇溶液，用 7 0 % 的乙醇及无水乙醇各冲洗一次，最后真空干燥。- 2 0 保存备用。 ( 2 ) p c r 扩增 1 6 s r d n a : 1 ) 扩增分离菌的1 6 s r d n a : 引物 1 ( 2 7 f ) : 5 - g a g a g t t t g a t c c t g g c t c a g - 3 引物 2 ( 1 5 4 1 r ) : 5 - a a g g a g g t g a t c c a g c c g c a - 3 条件: 9 4 c 预变性5 m i n ， 加t a q 酶后循环， 9 4 c 4 5 s e c , 5 2 - 5 5 c 4 5 s e c , 7 2 c 1 . 5 m i n , 3 0 个循环;7 2 c 1 0 m i n e 2 ) p c r 产物 1 %琼脂糖凝胶电泳。 3 ) e b 染色，紫外灯观察结果。 ( 3 ) p c r 产物纯化二 a . 在p c r 反应液( 5 0 u l 体系) 中加入0 . 4 m l 纯化树脂， 充分混匀3 m i n b . 将混合液装入离心纯化柱， 1 3 , 0 0 0 r / m i n离心 3 0 s ， 倒掉收集管中的 南开大学硕士研究生毕业 学位) 论文 废液 。 c . 加入 5 0 0 u l 8 0 % 异丙醇 1 3 , 0 0 0 r / m i n离心 3 0 s ， 倒掉收集管中的废 液 。 d . 重复步骤 。 一次， 离心 2 m i n ， 倒掉异丙醇， 再离心 l m i n o e . 将纯化柱套入干净的1 . 5 m l 的离心管中， 加入3 0 u l 双蒸水。 f . 取4 11 l 点样，1 % 琼脂搪电泳检测。 ( 4 ) 1 6 s r d n a 的扩增 产 物 酶 切分 析 ( a m p l i f i e d r i b o s o m a l d n a r e s t r i c t i o n a n a l y s i s , a r d r a ) 酶切体系:1 5 11 l 去离子水3 . 2 11 l 纯化的p c r 产物1 0 u l 1 0 xb u f f e r 1 . 5 u l m s p i , h a e 1 1 1 0 . 3 u l 3 7 水浴 2 h r , 2 % 琼脂糖凝胶电泳检测，照相。 8 . 1 6 s r d n a p c r 产物的克隆及测序 ( 1 ) 连接 ( 采用p r o m e g a 公司的p g e m - t v e c t o r s y s t e m k i t ): 连接体系:( 1 0 u l ) 去离子水5 . 5 11 l 1 0 xb u f f e r 1 u l p c r 产物2 pl t 4 d n a 连接酶1 ii l t 一v e c t o r 0 . 5 p l 4 连接过夜。 ( 2 ) 感受态细胞的制备: a . 将 c o l i d h 5 a 1 5 11 l 接种于 5 m l l b 液体培养基中， 3 7 c 摇床培养 1 2 h ， 将 7 5 p l接种于 5 m l l b液体培养基中，3 7 c 培养 1 - 2 h r ， 以呈 现胶状为准。 b . 取 1 m l e . c o l i 菌液于 1 . 5 m l e p p e n d o r f 管中， 4 c, 1 4 0 0 0 r / m i n 离心 3 0 s收集菌体， 弃上清， 轻轻悬浮于 5 0 11 l l b 培养基中， 冰浴 5 m i n e 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位) 论文 c . 加入 5 0 u l 2 x t s s 缓冲液， 轻轻混匀， 冰浴 5 m i n . ( 3 ) 转化: a . 取 2 0 0 u l 感受态细胞，融化后，冰浴 1 0 m i n o b加入连接混合物 1 0 u l ,混匀，冰浴 3 0 m i n a c . 然后 4 2 c热激 9 0 s . d冰浴 2 m i n ，加入8 0 0 u l l b 培养基，3 7 0c 摇床培养 4 5 m i n ，转速小 于 2 2 5 r / m i n e e . 取 5 0 -2 0 0 u l涂于加有氨卞青霉素 ( a m p ) , i p t g及 x - g a l的 l b 平皿上 。 f . 3 7 培养 1 4 -1 6 h r ，白斑为有插入的克隆。 ( 4 ) 转化子的筛选: a . 随机选择白斑菌落， 利用蓝斑质粒和插入 1 . 5 k 6 片段的质粒做对照， 在含氨节青霉素的平板上划线培养。 b . 挑取少量菌体， 放入 5 0 u l 水中， 加入等体积的酚， 振荡混匀 1 m i n e c . 1 0 0 0 0 r / m i n 离心 5 m i n . d . 取上清 5 11l电泳，检测插入片段大小。 ( 5 ) 选择有合适大小插入片段的单克隆测序( 由基康公司完成) : 测序引物:( 1 6 s r d n a的通用引物) 引物 1 ( 2 7 f ) : 5 - g a g a g t t t g a t c c t g g c t c a g - 3 引物 2 ( 1 5 4 1 r ) : 5 - a a g g a g g t g a t c c a g c c g c a - 3 引物 3 ( t 7 ) : 5 - t a a t a c g a c t c a c t a t a g g g - 3 引物 4 ( s p 6 ) : 5 - a t t t a g g t g a c a c t a t a g - 3 9 .以1 6 s r d n a 为基础的系统发育分析 将菌株 1 6 s r d n a的序列与从 g e n b a n k / e m b l / d d b j等数据库中获得的 1 6 s r r n a 序列， 用s i m 软件l l 较各序列间的同源性， 采用c l u s t a l w v e r s i o n 1 . 8 进行多序列匹配排列， 通过t r e e c o n w v . 1 . 2 . 程序中n e i g h b o r - j o i n i n g 方法，采用 k i m u r a 双参数计算模型来推测系统发育树的结构。 四新种的多相分类 1 ，表型特征， 同前 南 开 大学硕士 研究生 毕 业( 学 位) 鱼 鱼一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 碳源包括 : s u r c o s e , t w e e n 8 0 , m a l t o s e , g l u c o s e , d - f r u c t o s e , g a l a c o t s e , p r o l i n e , l - a l a n i n e , l e u c i n e a n d g l y c e r o l , d - a r a b i t o l , d - m a n n o s e , d - r a f f i n o s e , l - r h a m n o s e , d - r i b o s e , s o r b i t o l , s o r b o s e , d - x y l o s e , l - m a l i c a c i d , s u c c i n a m i c a c i d , l a c t o s e , d -ce l l o b i o s e , e s c u l i n , d e x t r i n , l y s o i n e , t w e e n 2 0 a n d d - m a n n i t o l . 产酸 实验 底物包括 : s u c r o s e , d - m a n n i t o l , d - r i b o s e , r h a m n o s e , d - m a n n o s e , g l u c o s e , g a l a c t o s e a n d g l y c e r o l . 2 . 黄m吟、次黄a f吟的分解实验 肉汁陈培养基中分别加入 h y p o x a n t h i n e ( 0 . 4 , w 八% ) ，x a n t h i n e ( 0 . 4 ) ,， 将 s t r a i n h d 3 2 1接种于平版上， 3 7 温箱， 静止培养 2 周， 定期观 察菌落周围是否有透明的晕圈， 有则为阳性. 3 . 油酸、氯化锌存在条件下的生长情况 在肉汁培养基中加入0 . 1 % 的油酸， 0 . 0 0 1 % 氯化锌， 3 7 1c 温箱， 静止培养2 周， 观察是否生长， 生长的记为”十 ” 4 .细胞壁的化学成分分析 ( 全细胞分析) ( 1 ) 细胞壁样品的准备 a . 液体培养菌体， 离心收集; 取 1 . 5 g 的湿菌体悬浮于2 0 m l 蒸馏水中， 超声波裂解细胞，使细胞尽量裂解完全。 b . 5 0 0 0 r / m i n 离心 3 0 m i n 去除未裂解的细胞。上层液 1 8 , 0 0 0 r / m i n离 心3 0 m i n ，去除上清。 c . 沉淀重悬浮于 4 %的 s d s 溶液中，1 0 0 0c煮沸 4 0 m i n ，室温冷却。 d . 1 8 , 0 0 0 r / m i n 离心 3 0 m i n ，沉淀悬浮于热水中. e . 1 8 , 0 0 0 r / m i n 离心3 0 m i n ,冻干，得细胞壁粗提物。 ( 2 ) 细胞壁的分析: a . 细胞壁水解:在做氨基酸分析的试管中放入6 n h c 1 0 . 1 m l ，火焰 封口，放入烘箱，温度上升至 1 2 0 后，在持续 巧 m i n 取出，氨基酸水 解液以褐色为准。 b . 点样:用微量进样器在微晶纤维素薄板上距离下缘 l c 。处点样，同 时点上 0 . 4 u l 标准氨基酸样品 ( 含有 l l - d a p , m e s o - d a p 和 d - d a p )和同 属已知种的样品，风千。取另一薄板，以相同方法点含有 1 鼠李糖、核 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位) 论文 糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的混合液 0 . 2 u l 作为标 准样 。 c . 展层: 氨基酸分析展层液为甲醇: 毗陡: 冰乙酸: 水( 1 0 : 0 . 5 : 0 . 1 2 5 : 2 . 5 ) , 糖分析展层液为: 乙酸乙酷: 毗咤: 冰乙酸( 8 : 5 : 1 . 5 ) 待展层液前沿距 边缘 l c m 左右停止。 d . 显色: 氨基酸分析: 用荀三酮水溶液喷雾; 糖分析: 用苯胺、 邻苯二酸 钾显色 。 5 . 脂肪酸的测定 由军事医学科学院测定。 6 . 分枝菌酸的测定 ( 1 ) 枝菌酸甲基酷的制备 a . 称 1 叱 湿菌体， 细胞杀死后放入2 5 0 m l 三角瓶， 加入 2 % k o h甲醇溶 液， 淹没菌体， 加热搅拌至沸腾 7 m i n o b . 过滤细胞甲醇混合液， 滤液回收到 2 5 0 m l 三角瓶中，残留在滤纸上 的细胞用热甲醇冲洗过滤一次。 c . 把细胞再放回原来的三角瓶中， 加入二氯甲烷淹没菌体， 沸水浴边 搅拌边煮沸2 m i n ， 趁热过滤到2 5 0 m l 三角瓶中. 菌体用新鲜氛仿抽提一次。 d . 将抽提液减压干燥，残留部分用 5 m l 二氯甲烷洗到一个称重的大 试管中， 再加 5 m l 蒸馏水， 小心加入8 滴 6 n h c 1 ， 充分混合后， 用玻璃离心 管离心分层，底层常温下真空干燥， 过夜。 e . 干后称重， 估计残留物重量。按照每7 0 m g 残留物加入 1 0 %的三氯 化硼一 甲醇溶液， 蒸汽浴上煮沸蒸干， 然后加入5 m l 蒸馏水和5 m l 二氯甲烷， 在混合器上充分混合 l m i n ，离心破碎乳化液， 弃去上层水相，反复水洗， 直至 p h为 4 . 0 。最后将底层有机相和任一中间固体转到一称重的大试管 中， 水浴减压干燥， 再进行真空干燥，称重并计算残留物的重量。 用少量残留物二氯甲烷溶解残留物( 1 0 0 1 5 0 il l / 5 0 m g ) ，用吸管取 样， 以带状点样到 g f 2 5 4硅胶板( 1 0 x 2 0 c m ) 上层析纯化， 溶媒体系为石油 醚: 乙醚( 8 : 2 , v 八) 。 f . 当溶剂走至薄板前沿后， 取出通风橱内晾干。用新配制的若丹明 b 南开人学硕士 研究生毕 业 ( 学位) 论文 显迹， 刮下粉红橙色带( r f ; 0 . 1 5 - 0 . 3 5 ) ，室温干燥。 g . 习 各 含枝菌酸的硅胶小心刮下倒进玻璃棉堵塞管口的漏斗里， 洗脱液 滴入烧杯，4 0 旋转蒸发， 干燥，用少量二氯甲烷溶解残留物， 转到 7 5 x l o m m 称重的试管里再蒸发干燥，置室温 l h r称重， 备用。 ( 2 ) 气相层析: 用制备好的枝菌酸酷二氯甲烷溶液0 . 5 ul 与内标二十烷 基甲酸酷， 一同注入带有裂解头装置的气相色谱仪里。 注射温度 3 0 0 c， 检测 器温度 3 2 0 -c , 程序升温 4 -6 c / m i n 至 1 8 5 - 3 0 0 c 停留2 m i n o 了 .酉 昆 类测定 ( 1 ) 冻干细胞( 约 5 0 m g ) 加 2 0 -4 0 m l 氯仿: 甲醇( 2 : 1 , v / v ) ， 磁力搅拌器 搅拌 1 一2 h r e ( 2 ) 黑暗处滤纸过滤， 收集滤液， 用旋转减压薄膜蒸馏仪于4 0 减压蒸 馏， 弃馏液， 千燥物用 1 m l 氯仿: 甲醇( 2 : 1 , v 八) 溶液溶解。 ( 3 )在 g f 2 5 4硅胶板上 ( 1 0 x 1 o c m ) 上长条点样， 用 乙烷 : 乙醚 ( 8 5 : 1 5 , v 八) 展层， 紫外灯下观察。 ( 4 )刮下 r f = o . 8处的绿色荧光背景中呈黑褐色带( 即甲基蔡酮) 的硅 胶， 用 1 m l 氯仿通过玻璃器洗脱， 用细菌过滤器抽滤， 洗涤， 收集氯仿滤液及 洗液， 置 4 黑暗处保存。 ( 5 )用反相高压液相色谱法进行醒的测定，反相高压液相柱为十八烷 基硅烷 ( o s d 5 m m 2 5 0 4 . 6 m m , i d ) ， 流动相为乙氰 ( 色谱纯): 异丙醇 ( 分析 纯卜7 5 : 2 5 ， 流速为1 m l / m i n , 温度为4 0 c , 2 7 0 n m 紫外检测， 使用h p l c 完成测 定并记录数据， 对照菌种采用 s t r e p t o m y c e s g r i s e u s a s 4 . 1 3 9 ， 灰色链霉菌。 8 . 大量提取菌体总 d n a的提取 ( 1 )培养菌体:从新划线的琼脂平皿上用无菌牙签挑取一单菌落，接 种到 5 m l肉汁陈培养基中，3 7 摇床培养 1 2 h r o ( 2 )以上培养液按 1 - 2 % 的接种量接入含 1 0 0 m l相同培养液的三角瓶 中，3 7 c 摇床培养到对数生长期末，约 1 6 h r o ( 3 ) 将以上培养液转移到 5 0 m l 离心管中， 4 0c, 5 0 0 0 r / m i n 离心5 m i n o 弃掉上清夜 ，让离心管倒置在干净的滤纸上，轻轻叩击离心管以去掉残余 南开大学硕士 研究生毕 业 ( 学 位) 论 文 的液体。 ( 4 )将细胞沉淀物通过涡旋振荡悬浮在 l o m l 5 0 m m o l / l t r i s ( p h 8 . 0 ) 缓冲液中，然后加入2 m l 新鲜配制的溶菌酶溶液 ( i o m g / m l i n 0 . 2 5 m t r i s , p h 8 . 0 )和 8 m l 0 . 2 5 m o l / l的 e d t a溶液，混匀后放置于 3 7 处理 2 0 m i n o 再加入 2 m l 1 0 % 的s d s 溶液，混匀后于 5 5 c处理 5 m i n e ( 5 )加入等体积的酚一 氯仿 ( 1 : 1 ) ，来回倒置离心管抽提一次。将上 层水相转移到一新的离心管中。 ( 6 )加入 0 . 6 体积的异丙醇，用干净的玻璃棒搅动溶液，使d n a 缠绕 在玻璃棒上。然后用 7 0 % 的冷冻乙醇冲洗一次，干燥后，溶解在 2 m l的 t e 溶液中。 ( 7 )加入 3 u l 1 o m g / m l 的r n a s e 溶液，于3 7 c 水浴中处理 3 0 m i n o ( 8 )用等体积的酚一 氯仿 ( 1 : 1 )抽提若干次，直到无白色变性蛋白 出现。 然后加入 1 / 1 0 体积的 3 m o l / l n a a c 及 2 倍体积的冷冻无水乙醇， - 2 0 oc放置 3 0 m i n o ( 9 ) 1 2 , 0 0 0 r / m i n 离心 1 o m i n ，使 d n a 沉淀，弃去乙醇溶液，用 7 0 % 的乙醇及无水乙醉各冲洗一次，最后真空干燥。- 2 0 保存备用。 9 . g 十c m o l % 的测定:【 ” ， d n a 样品溶于 0 . 1 x s s c中，在 d u -7 b e c k m a n分光光度计上调整 d n a 的浓度，使 o d l 。 为0 . 5 左右，d n a 纯度 o d 2 3 . / o d m / 01 8 0 = 0 . 4 5 4 : 1 : o . 5 1 5 , 然后测定t m 值。按照以下公式计算g +c m o l% : 在 0 . 1 x s s c 溶液中，g +c m o l% = ( t m - t m r . , )x2 . 0 8 +5 1 . 2 对照菌株为b . c c l i k , 2 a s 1 . 3 6 5 , t m , ,; =7 6 . 4 1 0 , p c r 产物测序及以 1 6 s r d n a为基础的系统发育分析: ( 1 ) p c r 产物测序方法同前，由基康公司完成。 ( 2 ) 将菌株 h d 3 2 1 的 1 6 s r d n a的序列与从 g e n b a n k / e m b l / d d b j等数据 库中获得的 1 6 s r r n a序列，用 s i m计算相似值， 采用 c l u s t a l w v e r s i o n 1 . 8 r , ; ， 进 行 多序 列 匹配排 列 ，通 过 t r e e c o n w v . 1 . 2 . 9 r 程序 中 n e i g h b o r - j o i n i n g 方法， 采用k i m u r a 双参数计算模型来推测系统发育树的 结构 。 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位) 论文 四、溶液 1 . l u g o l , s 碘液:碘 1 g ,碘化钾 2 g ，水3 0 0 m l . 2 . f r a z i e r 试剂:h g c l , 1 5 g ,纯盐酸 2 0 m l ，水 1 0 0 m l o 3 . 1 %二甲基对苯二胺水溶液 4 . 5 %的h 2 0 2 水溶液 5 . 1 %的盐酸联苯胺溶液 6 . g r i e s s 试剂 a 液:对氨基苯磺酸 0 . 5 g , 1 0 %稀醋酸 1 5 0 m l ; b 液:。一蔡胺 0 . 1 g ,蒸馏水 2 0 m l , 1 0 %稀醋酸 1 5 0 m l 7 ，二苯胺试剂: 二苯胺0 . 5 g 溶于1 0 0 m l 浓硫酸中，用2 0 m l 蒸馏水稀释 8 甲基红试剂:0 . 1 g 甲基红+3 0 0 m l 无水乙醇- f 2 0 0 m l 蒸馏水 9 .展层液:甲醇:毗睫:冰乙酸:水 ( 1 0 : 0 . 5 : 0 . 1 2 5 : 2 . 5 ) 1 0 . 若丹明b ( r h o d a m i n e b ) : 0 . 1 % 乙醇若丹明: 0 . 2 5 m o l / l n a h , p o , ( 1 : 1 0 ) t r i s 缓冲液:5 0 m m o l / l , p h 8 . 0 1 1 .溶菌酶溶液:1 0 m g / m l i n 0 . 2 5 m t r i s , p h 8 . 0 1 2 . e d t a溶液:0 . 2 5 m o l / l , p h 8 . 0 1 3 . r n a s e 溶液:1 o m g / m l 1 4 . n a a c溶液:3 m o l / l , p h 5 . 5 1 5 .氨卞青霉素:2 0 0 m g / t+ l 1 6 .i p t g : 2 0 0 m g / u l 1 7 . x - g a l :2 0 m g / p l 1 8 . 1 s s c溶液: n a c l 1 5 m m ，柠檬酸钠 1 . 5 m m 1 9 . 澳甲酚紫溶液: 0 . 1 g 澳甲酚紫+ 1 0 0 m l乙醇 2 0 . 1 0 9 6 f e c l , 溶液 五、仪器和设备: 1 .c e n t r i f u g e j 2 - 2 1 , b e c k m a n ; 2 . i n n g v a t m 4 0 0 0 i n c u b a t o r s h a k e r , n e w b r u n s w i c k s c i e n t i f i c : 3 . u - 7 s p e c t r o p h o t o m e t e r , b e c k m a n ; 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位)论文 4 . i n n g v a 3 0 0 0 w a t e r b a t h s h a k e r，n e w b r u n s w i c k s c i e n t i f i c ; 5 . c o m m e r c i a l i c e s y s t e m b - 2 3 0 - a p , i m i c o r n e l i u s i n c . u s a ; 6 . b i o f u g e 2 8 r s , h e r a e u s s e p a t e c h ; 7 . 7 9 - 1磁力加燕搅拌器，江苏金坛市金南仪器厂; 8 .脱色摇床，t s 一 型，江苏海门其林医用仪器厂; 9 .电子天平 m e t t l e r p m 2 0 0 0 , s w i t z e r l a n d ; 1 0 .电子天平 m e t t l e r t o l e d o , s w i t z e r l a n d ; 1 1 . 凝胶成像仪，b i o - r a d ; 1 2 . t r - a型紫外检测仪，上海市顾村玻璃仪器厂; 1 3 . 洁净工作台，北京半导体设备厂: 1 4 . 7 2 1型分光光度计，上海第三分析仪器厂: 1 5 . 海尔冰箱b c d - 3 2 8 w b型; 1 6 . h p l c , w a t e r s ; 1 7 .气相色谱仪:g c - 7 a g型，日本导津公司。 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位)论文 二. 新种的多相分类- g o r d o n i a p a r a f f i n i v o r a n s s p . n o v 1 . 形态特征及生长条件 h d 3 2 1 ， 一株来自 大庆油田 样品的解烃菌，菌落呈圆形， 边缘整齐， 橘红色， 3 7 培养过 夜菌 落 直径在1 二左右。 革 兰氏 阳 性 ， 菌 体为 规则的 杆 状大小 为宽0 . 5 - 0 . 8 p m ， 长1 . 5 - 2 . o w n ， 菌体不运动， 无芽抱. 匆 谁 羊 菌体照片如图2 - 5 o h d 3 2 1 生长的p h 范围是5 . 5 -9 . 5 ， 最 适的p h 是7 . 0 ; n a c l 范围 是0 . 5 -7 % ,最适为1 % ; 温 度范围 是2 0 - 5 0 0c ， 最适为3 7 c ; 无 氧条件下不生长，在0 . 8 % 油酸或者0 . 0 0 1 % 氯化锌存在的培养剩牛 下可生长。 2 . 生 理生 化特性 氧化酶、 触酶、 硝酸盐 还原及脉酶试 验均为阳 性; 产n f l 试验、 略 产生实验及、 m r 试 验、 v p 试验 和a i l噪反 应均为阴 性。 h d 3 2 1 可分 解a e s c u l i n , a l l a n t o i n a n d u r e a ， 不 可 分 解h y p o x a n t h i n e , x a n t h i n e , t y r o s i n e , s t a r c h , t w e e n ( 2 0 , 6 0 ,