2.6.13-欧洲药典.doc

2.6.13.非无菌药品的微生物限度检查：控制菌检查法(3)1. 导言下述检验方法是用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物及其限度的方法。本检查方法的主要目的是确定原料药或制剂是否符合已建立的微生物限度质量标准。当本方法用于这一目的时，应按照下列规定进行检验，包括样品的取样量，并按照下述规定对检查结果进行判断。可以采用其他的微生物检查方法，包括自动化分析方法，如果可以证明该方法的效果与药典中的方法等同。2. 一般程序样品的制备方法参见通论2.6.12。 如果供试品有抗微生物活性，按照通论2.6.12中描述的方法尽可能地去除活性或对其进行中和。如果在样品的制备过程中使用了表面活性剂，应按照通论2.6.12中的要求，确认其对微生物无毒性以及其与灭活剂的相容性。3. 培养基的生长促进作用和生长抑制作用，试验方法的适用性和阴性对照试验必须确定本检验方法具备检测供试品中微生物的能力。如果检测性能或者是产品发生变化，则必须对方法的适用性进行确认，因为这可能会对检测结果产生影响。3-1.试验用菌株的制备使用符合标准要求的稳定的试验菌种菌悬液或按照以下方法制备菌悬液。采用种子批培养维护技术（种子批系统），从原始主种子批计，种子批传代次数不得超过5代。3-1-1. 需氧菌 将各个试验用菌株分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，于30-35培养18-24小时。将白色念珠菌试验菌株接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，于20-25 培养2-3天。- 金黄色葡萄球菌，例如 ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 或 NBRC 13276;- 铜绿假单胞， 例如 ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 或 NBRC 13275;- 大肠埃希菌，例如ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126 或 NBRC 3972;- 肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型，例如 ATCC 14028 或以肠道沙门氏菌肠道亚种阿邦尼血清型，例如NCTC 6017 或CIP 80.39作为替代菌种;- 白色念珠菌，例如 ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 或 NBRC 1594.使用pH为7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH为7.2的磷酸盐缓冲液制备试验用菌悬液。菌悬液应在2小时内使用，如果菌悬液在2-8条件下保存，则应在24小时内使用。3-1-2. 梭状芽孢杆菌. 使用生孢梭菌，例如ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) 或ATCC 19404 (NCTC 532 或 CIP 79.03) 或 NBRC 14293。在厌氧条件下将生孢梭菌试验菌株接种在梭菌增菌培养基中，于30-35条件下培养24-48小时。或者是制备新鲜的有活性的生孢梭菌菌孢子悬液，然后进行稀释，获得稳定的孢子混悬液用于接种。该稳定的孢子悬液可在2-8条件下保存，并在经过验证的贮存期内使用。 3-2. 阴性对照试验为了确认试验条件是否符合要求，应该用所选用的稀释剂代替供试品进行阴性对照试验。阴性对照试验应无菌生长。按照第四部分对供试品进行检测时，也需要做阴性对照试验。如果阴性对照试验结果不符合要求，应进行偏差调查。3-3. 培养基的生长促进作用和生长抑制作用每一批成品培养基，以及每一批由脱水培养基或按规定处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查。按照表2.6.13.-1的要求，对相关培养基的适用性进行确认。液体培养基的促生长能力检查：分别将少量的（不超过100 CFU）的相应试验菌种接种在适当的培养基中。然后在相应的控制菌规定的培养温度下培养不超过试验规定的最短培养时间。与以前检测得到的试验管或者已经批准的培养基批次进行比较，被检查的培养基试验管有清晰可见的微生物生长。固体培养基的促生长能力检查： 用涂布法分别接种，每个培养基平皿分别接种少量的（不大于100 CFU ）相应试验菌种。 然后在相应的控制菌规定的培养温度下培养不超过试验规定的最短培养时间。与以前检测得到的试验管或者已经批准的培养基批次进行比较，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小和形态特征应一致。 固体或液体培养基的抑制能力检查: 在相应的培养基中接种不少于100CFU的相应试验菌。然后在相应的控制菌规定的培养温度下培养不小于试验规定的最长培养时间。试验菌应不得生长。培养基的指示特性检查：用涂布法分别在每个相应的培养基平皿中接种少量的（不大于100 CFU ）相应试验菌种。然后在相应的控制菌规定的培养温度下培养一定的时间。与以前检测得到的试验管或者已经批准的培养基批次进行比较，菌落大小形态UI集指示剂反应情况应与对照培养基一致。3-4.控制菌检查方法的适用性试验 按照第四部分中相关段落的规定制备供试品溶液。混合的时候，分别将各个试验用菌株加入到指定的培养基中。每个试验用菌株分别接种。供试品溶液中微生物的接种量应小于100CFU。按照第四部分中相关段落的方法进行试验，培养时间应为微生物试验时规定的最短时间。必须按照第四部分的要求对控制菌进行指示特性反应检查。如果供试品对试验菌有抗菌活性， 则必须检查过程进行修正（参见2.6.12章节中的4-5-3）。如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌活性无法消除，那么可以认为受抑制的微生物不易存在于该供试品中。 表 2.6.13.-1 控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性 培养基特性试验菌株耐胆盐革兰氏阴性菌的检查肠道菌增菌液体培养基-肠内杆菌培养基促生长能力大肠埃希菌铜绿假单胞菌抑制能力金黄色葡萄球菌紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基 促生长能力 + 指示特性大肠埃希菌铜绿假单胞菌大肠埃希菌的检查麦康凯液体培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌麦康凯琼脂培养基促生长能力 + 指示特性大肠埃希菌沙门氏菌的检查RV 沙门菌液体增菌培养基促生长能力肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型 或肠道沙门氏菌肠道亚种阿邦尼血清型抑制能力金黄色葡萄球菌木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 促生长能力 + 指示特性肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型 或肠道沙门氏菌肠道亚种阿邦尼血清型铜绿假单胞菌的检查溴棕三甲铵琼脂培养基促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力大肠埃希菌金黄色葡萄球菌的检查甘露醇氯化钠琼脂培养基促生长能力 + 指示特性金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌梭菌的检查梭菌增菌培养基促生长能力生孢梭菌哥伦比亚琼脂培养基促生长能力生孢梭菌白色念珠菌的检查沙氏葡萄糖液体培养基促生长能力白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂培养基促生长能力 + 指示特性白色念珠菌4. 供试品检查4-1. 耐胆盐革兰氏阴性菌 4-1-1. 供试品溶液制备和预培养 按照通论2.6.12中的方法，取不少于1g的供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂制成1:10的供试品溶液，混匀，于20-25条件下培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但是又不会使其增殖（通常在2-5小时范围内）。4-1-2. 定性试验 除另有规定外，取4-1-1中制备的相当于1g供试品的预培养物溶液接种至肠道菌增菌液体培养基中，于30-35条件下培养24-48小时，然后将培养物转种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，于30-35条件下培养18-24小时。如果平板上无菌落生长，说明供试品中未检出耐胆盐革兰氏阴性菌。4-1-3. 定量试验4-1-3-1. 选择和分离培养.取4-1-1制备的分别含有0.1g,0.01g和0.001g(或0.1ml,0.01ml和0.001ml)供试品的预培养物或其稀释液接种至适量体积的肠道菌增菌液体培养基中，于30-35条件下培养24-48小时，然后分别将各个培养物接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基上，于30-35条件下培养18-24小时。4-1-3-2. 结果判断 如果培养基上有菌落生长说明试验结果为阳性，记录产生阳性试验结果所使用的供试品的最小量和产生阴性结果所使用的供试品的最大量。 根据表2.6.13.-2确定出供试品中含有耐胆盐革兰氏阴性菌的可能菌数。表 2.6.13.-2 - 结果判断各供试品量的检查结果 每1g(或1ml)供试品中可能的菌数0.1g 或0.1mL0.01g 或0.01 mL0.001 g 或 0.001 mL+ 103+- 102+-10- 104-2. 大肠埃希菌4-2-1. 供试品溶液制备和预培养. 按照通论2.6.12中的方法，取不少于1g的供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂，制成1:10的供试液，取供试液10ml，或相当于含供试品1g或1ml的供试液，接种于适量的胰酪大豆胨液体培养基中（按照3-4的要求），混匀，于30-35条件下培养18-24小时。4-2-2.选择和分离培养. 振动容器，将1ml胰酪大豆胨液体培养物转移到100ml的麦康凯液体培养基中， 于42-44条件下培养24-48小时。 然后将培养物接种于装有麦康凯琼脂培养基的平板上，于30-35条件下培养18-72小时。4-2-3. 结果判断. 如果麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应对其进行鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌。如果麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或者是虽然有菌落生长，但是鉴定结果为阴性， 则判断为供试品中未检出大肠埃希菌。4-3. 沙门菌4-3-1. 供试品溶液制备和预培养. 按照通论2.6.12中的方法，取不少于10g或10ml的供试品，制成供试液（按照3-4的要求），接种于适量的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，于30-35条件下培养18-24小时。4-3-2.选择和分离培养. 取上述胰酪大豆胨肉汤培养物0.1ml,接种到10ml的RV沙门菌增菌液体培养基中，于30-35 条件下培养18-24小时。然后取少量RV沙门菌增菌液体培养物，接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，于30-35条件下培养18-48小时。4-3-3. 结果判断. 如果木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有红色菌落生长，菌落中心有或无黑色， 则说明供试品中可能含有沙门氏菌。应进一步对其进行鉴定试验，确证是否为沙门氏菌。如果平板上没有菌落生长，或者虽然有菌落生长，但不是这种菌落特征或鉴定试验结果为阴性，则判断为供试品中未检出沙门氏菌。4-4. 铜绿假单胞菌4-4-1. 供试品溶液制备和预培养. 按照通论2.6.12中的方法，取不少于1g的供试品，制成1:10的供试品溶液，取供试品溶液10ml，或相当于含供试品1g或1ml的供试液，接种于适量的胰酪大豆胨液体培养基中（按照3-4的要求），混合均匀。 如果是检测透皮贴剂，取一剂量的供试品，按照通论2.6.12中4-5-1中的方法制备供试品溶液，然后用无菌滤膜对供试品溶液进行过滤，再接种于100ml胰酪大豆胨液体培养基中。于30-35条件下培养18-24小时。4-4-2.选择和分离培养. 将上述培养物接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，于30-35条件下培养18-72小时。4-4-3. 结果判断. 如果溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长，菌落中心有或无黑色， 则说明供试品中可能含有铜绿假单胞菌。应进一步对其进行鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌。如果平板上没有菌落生长，或者虽然有菌落生长，但鉴定试验结果为阴性，则判断为供试品中未检出铜绿假单胞菌。4-5. 金黄色葡萄球菌4-5-1. 供试品溶液制备和预培养. 按照通论2.6.12中的方法，取不少于1g的供试品，制成1:10的供试品溶液，取供试品溶液10ml，或相当于含供试品1g或1ml的供试液，接种于适量的胰酪大豆胨液体培养基中（按照3-4的要求），混合均匀。 如果是检测透皮贴剂，取一剂量的供试品，按照通论2.6.12中4-5-1中的方法制备供试品溶液，然后用无菌滤膜对供试品溶液进行过滤，再接种于100ml胰酪大豆胨液体培养基中。于30-35条件下培养18-24小时。4-5-2.选择和分离培养. 将上述培养物接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，于30-35条件下培养18-72小时。4-5-3. 结果判断. 如果甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长， 则说明供试品中可能含有金黄色葡萄球菌。应进一步对其进行鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌。如果平板上没有菌落生长，或者虽然有菌落生长，但不是这种菌落特征或鉴定试验结果为阴性，则判断为供试品中未检出金黄色葡萄球菌。4-6. 梭菌4-6-1. 供试品溶液制备和热处理. 按照通论2.6.12中的方法，取不少于2g或2ml的供试品制成1:10的供试品溶液（供试品溶液的体积至少为20ml）。将供试品溶液分成两份，每份供试品溶液的体积至少为10ml。将其中一份的供试品溶液置于80加热10分钟，然后迅速冷却。另一份供试品溶液则不需要加热。4-6-2.选择和分离培养. 取上述两份供试品溶液各10ml， 或相当于1g或1ml的供试品， 分别接种于适量的梭菌增菌培养基中（按照3-4的要求），置于厌氧条件下30-35培养48小时。培养结束后，取上述每一种培养物少量，分别接种于哥伦比亚琼脂培养基平板上，置于厌氧条件下30-35培养48-72小时。4-6-3. 结果判断. 如果哥伦比亚琼脂培养基平板上有厌氧杆菌生长（有或无芽孢）， 并且过氧化氢酶反应为阴性，说明供试品中可能含有梭菌。应进一步对其进行鉴定试验，确证是否为梭菌。如果平板上没有菌落生长，或者虽然有菌落生长，但不是这种菌落特征或鉴定试验结果为阴性，则判断为供试品中未检出梭菌。4-7. 白色念珠菌4-7-1. 供试品溶液制备和预培养. 按照通论2.6.12中的方法，制备供试品溶液，取供试品溶液10ml，或相当于含供试品1g或1ml的供试液，接种于100mL的沙氏葡萄糖液体培养基中，混合均匀。置于 30-35 条件下培养 3-5 天。4-7-2.选择和分离培养. 将上述培养物接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，于30-35条件下培养24-48小时。4-7-3. 结果判断. 如果沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上有白色菌落生长， 则说明供试品中可能含有白色念珠菌。应进一步对其进行鉴定试验，确证是否为白色念珠菌。如果平板上没有菌落生长，或者虽然有菌落生长，但不是这种菌落特征或鉴定试验结果为阴性，则判断为供试品中未检出白色念珠菌。以下信息仅供参考。 5.推荐使用的稀释剂和培养基以下稀释剂和培养基适用于药典中所规定的微生物检查，其他培养基在证明其适用性后也可用于微生物检查。缓冲液储备溶液. 取磷酸二氢钾34 g，置于一个1000 mL 的容量瓶中， 用500 mL的 纯化水溶解，用氢氧化钠将pH 值调节至7.2 0.2，然后用纯化水稀释至1000.0 mL，混合均匀。分装至容器中进行灭菌。于 2-8条件下贮存。pH7.2的磷酸盐缓冲液：将上述缓冲液储备溶液与纯化水混合(1:800V/V)稀释，灭菌。pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液磷酸二氢钾3.6 g磷酸氢二钠7.2 g, 相当于 0.067 M 磷酸盐二水合物氯化钠4.3 g蛋白胨 (肉类或酪蛋白)1.0 g纯化水1000 mL在高压灭菌器中灭菌，灭菌条件已经过验证。胰酪大豆胨肉汤培养基胰消化酪素17.0 g大豆粉木瓜蛋白酶消化物3.0 g氯化钠5.0 g磷酸氢二钾2.5 g葡萄糖一水合物e2.5 g纯化水1000 mL调节pH值，使其灭菌后在25条件下为7.3 0.2。在高压灭菌器中灭菌，灭菌条件已经过验证。胰酪大豆胨琼脂培养基胰消化酪素15.0 g大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0 g氯化钠5.0 g琼脂15.0 g纯化水1000 mL调节pH值，使其灭菌后在25条件下为7.3 0.2 在高压灭菌器中灭菌，灭菌条件已经过验证。沙氏葡萄糖琼脂培养基葡萄糖40.0 g胰消化酪素和动物组织胃消化物（1:1）的混合物 10.0 g 琼脂15.0 g纯化水1000 mL调节pH值，使其灭菌后在25条件下为5.6 0.2。在高压灭菌器中灭菌，灭菌条件已经过验证。马铃薯葡萄糖琼脂培养基马铃薯提取物200 g葡萄糖20.0 g琼脂15.0 g纯化水1000 mL调节pH值，使其灭菌后在25条件下为5.6 0.2。在高压灭菌器中灭菌，灭菌条件已经过验证。沙氏葡萄糖液体培养基葡萄糖20.0 g胰消化酪素和动物组织胃消化物（1:1）的混合物10.0 g 纯化水1000 mL调节pH值，使其灭菌后在25条件下为5.6 0.2。在高压灭菌器中灭菌，灭菌条件已经过验证。肠道菌增菌液体培养基-肠内杆菌培养基明胶胰酶水解物10.0 g葡萄糖一水合物5.0 g脱水牛胆汁20.0 g磷酸二氢钾2.0 g磷酸氢二钠二水合物8.0 g亮绿15 mg纯化水1000 mL调节pH值，使加热后在25条件下的pH值为7.2 0.2。 在100 加热保温30分钟，然后迅速冷却。紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基酵母浸出粉3.0 g明胶胰酶水解物7.0 g胆盐1.5 g氯化钠5.0 g葡萄糖一水合物10.0 g琼脂15.0 g中性红30 mg结晶紫2 mg纯化水1000 mL调节pH值，使加热后在25条件下的pH值为7.4 0.2。加热至沸腾；不得在高压灭菌器中加热。麦康凯液体培养基明胶胰酶水解物20.0 g乳糖一水合物10.0 g脱水牛胆汁5.0 g溴甲酚紫10 mg纯化水1000 mL调节pH值，使其灭菌后在25条件下的pH值为7.3 0.2。 在高压灭菌器中灭菌，灭菌条件已经过验证。麦康凯琼脂培养基明胶胰酶水解物17.0 g蛋白胨 (肉类或酪蛋白)3.0 g乳糖一水合物10.0 g氯化钠5.0 g胆盐1.5 g琼脂13.5 g中性红30.0 mg结晶紫1 mg纯化水1000 mL调节pH值，使其灭菌后在25条件下的pH值为7.1 0.2。 加热煮沸1分钟，并不断振摇，在高压灭菌器中灭菌，灭菌条件已经过验证。RV沙门菌增菌液体培养基大豆蛋白胨4.5 g氯化镁六水合物 29.0 g氯化钠8.0 g磷酸氢二钾0.4 g磷酸二氢钾0.6 g孔雀绿0.036 g纯化水1000 mL缓慢加热使其溶解，在高压灭菌器中进行灭菌，灭菌条件已经过验证，灭菌温度不得超过115。调节pH，使其加热灭菌后在25条件下的pH值为5.20.2。木糖醇赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基木糖3.5 gL-赖氨酸5.0 g乳糖一水合物7.5 g蔗糖7