质粒浓度测定.doc_第1页
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文档简介

用分光光度计测定质粒DNA的浓度一、目的熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。二、原理DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1g / ml时，DNA钠盐的OD2600.02当OD2601时， dsDNA浓度约为50g / ml ssDNA浓度约为37g / ml RNA浓度约为40g / ml 寡核苷酸浓度约为30g / ml当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。经验值：纯DNA：OD260/OD2801.8(1.9,表明有RNA污染；1。6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：1.7 OD260/OD2802.0（1.7时表明有蛋白质或酚污染；2.0时表明可能有异硫氰酸残存）若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量。三、材料、试剂及器具1、 材料提取的PUC19样品、PUC19标准样品2、 试剂灭菌重蒸水，TE缓冲液3、 器皿石英比色皿；UV-240紫外分光光度计四、操作步骤1、 UV-240紫外分光光度计开机预热10min.2、 用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。3、 设定狭缝后校零。4、 将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5l或RNA4l用TE缓冲液稀释至1000l）后，记 录编号和稀释度。5、 把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。6、 设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。7、 计算待测样品的浓度与纯度。DNA样品的浓度（g / l）:OD260稀
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