乳铁蛋白的分离与纯化.ppt

乳铁蛋白的分离与纯化,乳铁蛋白的分离与纯化,乳铁蛋白的价值,乳铁蛋白具有多种生物学功能,能提高肠道细胞对铁离子的吸收，具有抗菌，抗病毒，抗氧化，抗癌，调节机体免疫反应等多种功能，并己广泛应用于食品，畜牧等行业。LF可耐受较高温度,使之在饲料加工过程中不易变性失活，它促进铁的转运和吸收,可以治疗仔猪贫血。它具有广谱的抗菌，抗病毒作用,可用来预防和治疗仔猪腹泻:它具有调节免疫系统活性的作用，增强家畜对疾病的抵抗力，它具有抗真菌和抗脂质氧化作用,可用作防霉剂和抗氧化剂。,乳铁蛋白LF,是存在于哺乳动物外分泌液中的一种铁离子结合蛋白结构与转铁蛋白相似，但铁结合能力是转铁蛋白的260倍，LF是由689个氨基酸组成的单一多链分子。每个分子中有2个金属结合位点，每个位点可结合一个Fe3+和一个HCO3-或CO3。Lf的铁结合能力与盐的种类和浓度有关，在有较高浓度碳酸盐的场合，其铁结合能力增强，而在有较高浓度柠檬酸盐的情况下，其铁结合能力则减弱。,自1960年以来人们就试着采用各种方法来制备LF如离子交换层析色谱,超滤,固定化单克隆抗体,亲和层析等从人乳或牛乳中分离纯化LF，但色谱法和固定化单克隆抗体法虽能获得较高纯度的LF但价格昂贵技术要求高,所以并不适用于工业化生产.超滤法简便费用低,易形成工业化生产，但LF纯度低膜需要经常清洗。,色谱法-吸附色谱法,是利用固定基质和吸附质间物理或化学吸附强度的不同来分离物质的。疏水性的相互作用色谱在乳铁蛋白的分离上有重要的应用。一般以Toyopearl为基质,在(NH4)2SO4溶液中达到吸附平衡后再装柱,用去离子水0.25mol/LHAc和0.25mol/LNaOH洗脱,得纯度为80%的乳铁蛋白,其缺点是吸附容量比较小,效率比较低.,离子吸附法,1最早利用DEAE纤维素阴离子交换树脂分离纯化得到较纯的Lf.2磷酸纤维素交换色谱法羧甲基阳离子交换色谱法被广泛应用于Lf和乳过氧化氢酶的分离纯化,用pH值7.7,浓度0.05mol/L的磷酸钠溶液或浓度0.3mol/LNaCl溶液作为洗脱液来洗脱,它可将Lf的a,b两种变异体分离出来,而且树脂能用浓度0.2mol/L的NaOH溶液和浓度0.2mol/L的HCI溶液再生,此法相对来说要更有效,亲合色谱法,不容基质-连接物-隔离臂-连接物-配体，基质一般用琼脂多糖,隔离臂一般多是有一定长度的可以连接基质的有机物例如，肝素琼脂糖亲合色谱能从琼脂乳中一步分离来得到乳铁蛋白,并且经电泳分析表明其纯度极高。,例如，换Cu2+的1,4一丁二醇二环氧甘油醚亚氨二乙酸琼脂糖,用Cu2+交换后该树脂呈蓝色,装柱时上面1/2或2/3是铜树脂下半部分未直接交换的Cu2+树脂,洗脱液为用pH值8.0-2.8浓度0.05mol/L的Tris-HAC溶液或浓度0.5mol/L的NaCI溶液作为洗脱液，一般来说,25mL的树脂可以吸附1L干酪乳清的Lf和免疫球蛋白,并且产品的纯度极高。,固定化单克隆抗体法,利用抗原-抗体之间的高特异性结合在68周的鼠腹中注入人或牛的乳铁蛋白进行免疫,经一系列操作分离出抗体,用抗体和异丙醇活化的亲合凝胶混合制得免疫亲合色谱。用脱脂牛初乳或常乳作为料液,用洗脱0.2mol/LpH2.7醋酸缓冲液(含0.15mol/LNaCl)洗脱。-成本贵,超滤法,是一种基本的膜分离技术，其原理是根据膜孔径不同可以实现不同分子质量和分子形状的大分子物质的分离，非常适合热敏性的功能性组分的分离。选用孔径或截留分子量不同的一系列超滤膜，可以以干酪乳清为原料生产Lf基料。,盐析法和层析法,从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白并利用电泳和分光光度法检测其纯度和含量所获得的乳铁蛋白的分子质量为90000u,纯度大约为92%。采用3次盐析和1次凝胶层析的方法。,试验方法,乳样前期处理：乳样在盐析和凝胶层析之前要进行前期处理,即除去脂肪和大量的酪蛋白,物料的前期处理方法基本相同采用新鲜牛初乳通过离心脱去脂肪(4，3000r/min、30min)得到脱脂乳，将脱脂乳稀释后，边搅拌边向其中加入1mol/L盐酸溶液调整脱脂乳的pH值到4.6(酪蛋白的等电点)，室温放置30min，离心除去酪蛋白(4、10000r/min、30min)，得到的上清就是我们需要的乳清，用它来分离Lf,盐析：选用硫酸胺沉淀以除去分子量比较小的蛋白，将乳清用30%的饱和硫酸铵沉淀30min后，4条件4000r/min离40min;将得到的上清液再用50%的饱和硫酸铵沉30min后,4条件下4000r/min离心40min，除去免疫球蛋白沉淀，将得到的上清液用85%的饱和硫酸铵沉淀30min。此时需在PH8.5的情况下，44000r/min,离心40min。此时收集沉淀，并用蒸馏水溶解。,凝胶层析：为了获得较高纯度的LF，选用sephadex-G-100对LF进行分离和纯化。将透析后的乳清1mL加入平衡过的凝胶层析柱，在20条件下以0.2mL/min的流速进行洗脱，洗脱液选用pH7.4的PBs（Nacl含量8g/1000mL)，待出现峰值后收集洗脱液，每管收集lmL。,LF的鉴定,采用非连续性SDS-PAGE电泳对脱脂乳和盐析分离得到的上清液，以及凝胶层析的洗脱产物进行检测。采用分光光度法对凝胶层析所得到的乳铁蛋白的浓度进行测定。,结果与分析,由于LF的pH为7.0-8.0,所以本试验凝胶层析选用的洗脱液为pH7.4的PBS，在这个pH范围内均可以得到LF。由图1可知峰l显示样品的吸收峰峰值较小，说明LF含量较低，但是非LF成分含量却很低,可以忽略,样品纯度比较高经SDS-PAGE电泳检测仅出现一条可见的区带,相对分子质量为9000u,对电泳凝胶进行扫描和计算机分析LF的纯度达到92%,LF峰2和峰3显示样品的吸收峰峰值较大,说明LF含量较高,但是样品不纯,含有其他成分,经SDS-PAGE电泳检测结果为峰2样品中含有两种成分,峰3样品中含有三种成分。峰IV则说明样品的各个成分含量都很低,经SDS-PAGE电泳检测可见条带非常不清晰.,分光光度法采用分光光度法测定LF浓度,首先利用纯度为92%的LF溶液在400-650nm下扫描，发现在475nm波长产生特征吸收峰(见图3)于475nm测定其吸光度,作出浓度C与吸光度A之间关系的线性回归方程,如图四,得方程为:c=827.49A+5.7315(R2=