（生物化学与分子生物学专业论文）小鼠肝脏干祖细胞及其组织定位的鉴定.pdf

浙江理工大学硕士学位论文 摘要 关于成体小鼠肝组织中肝干祖细胞存在与否及其确切组织定位的问题，至 今尚无直接证据证明。本文一方面采用脉冲追踪的方法对小鼠肝干祖细胞群及 其组织定位进行鉴定，另一方面采用尾静脉注射5 氟尿嘧啶杀死成体小鼠( 鼠龄 为3 周 4 周) 肝组织内的增殖期细胞，进而激活肝干祖细胞，并对新增殖的干 祖细胞进行脉冲追踪和定位。结果表明，标记保留细胞( l r c s ) 确实存在于成 体小鼠肝组织中，它们表达细胞周期蛋白c y e l i n d 3 及其依赖性蛋白c d k 6 ，而 不表达干细胞标志s e a - 1 和c k i t 。l r c s 主要定位在肝组织的中央静脉和门管区 周围。长期追踪发现，l r c s 的数量基本保持恒定不变。这些长期保留标记的d n a 链很可能是永生化的d n a 链。另外，与标记保留细胞群不同，成体小鼠肝组 织内还存在另一可结合凝集素d b a 的肝干祖细胞群，此群细胞并没有融入b r d u 标记，并在分化为成熟细胞的过程中逐渐丢失结合d b a 的能力。肝干祖细胞的 激活几乎在损伤后4 天被完全抑制。最终，受损的肝组织花费约一周的时间完成 再生。进一步发现，损伤后3 天和4 天，肝干祖细胞的数量变化及细胞周期同 步化是不同的。损伤后长期追踪发现，激活的干祖细胞仍然保留b r d u 标记并定 位于门管区周围。我们的研究说明5 氟尿嘧啶诱导的损伤结合标记保留的方法可 应用于研究肝脏干祖细胞及其定位，这将为临床应用带来广阔前景。 关键词肝千祖细胞；标记保留细胞；5 氟尿嘧啶；凝集素d b a ：肝再生；组 织定位 浙江理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ed i r e c te v i d e n c ea b o u tt h ee x i s t e n c ea n dp r e c i s eh i s t o l o g i c a ll o c a l i z a t i o no f h e p a t i cs t e m p r o g e n i t o rc e l l si nl i v e rt i s s u e so fa d u l tm i c ei ss t i l le l u s i v e h e r e ，t h e p u l s ec h a s em e t h o dw a su s e dt oi d e n t i f yt h ee x i s t e n c ea n dl o c a t i o n o fh e p a t i c s t e m p r o g e n i t o rc e l l si na d u l tm i c el i v e r i na d d i t i o n ，5 - f l u o r o u r a e i l ( 5 - f u ) w a s a d m i n i s t r a t e di n t r a v e n o u s l yt ok i l lt h ep r o l i f e r a t i n gc e l l so r i g i n a l l ye x i s t e d ，t h e n a c t i v a t ea n dl a b e lt h es u r v i v i n gh e p a t i cs t e r n p r o g e n i t o rc e l l s ，w h i c hf u r t h e ra l l o wt o c h a s e w ef o u n dt h a tl o n gt e r mb r d ur e t a i n i n gc e l l s ( l r c s ) d e f i n i t i v e l ye x i s t e di nt h e l i v e rt i s s u e so fa d u l tm i c ea n de x p r e s s e dc e l lc y c l ep r o t e i nc y c l i n d 3a n dc y c l i n d 3 d e p e n d a n tp r o t e i nc d k 6 ，b u tn o te x p r e s s e ds c a - 1o rc - k i t , a n dt h e yl o c a t e dp r i m a r i l y i nt h ep e r i p o r t a la n dp e r i c e n t r a lr e g i o n so ft h el i v e rt i s s u e s t h en u m b e ro fl r c sk e p t n e a r l yc o n s t a n to v e rt i m ea n dl r c sc o n t a i n e dt h e i m m o r t a ld n as t r a n d s i n a d d i t i o n ，t h e r ei sas u b p o p u l a t i o no fp o t e n t i a lh e p a t i cs t e m p r o g e n i t o rc e l l s ，w h i c h c o u l db i n dt h el e c t i nd b a , a n dt h e s ed b ap o s i t i v ec e l l sw e r eb r d un e g a t i v ea t2 w e e k s ，a n dg r a d u a l l yl o s tt h ec a p a c i t yo fb i n d i n gt h el e c t i nd b ad u r i n g t h ep r o c e s so f d i f f e r e n t i a t i n gi n t ot h em a t u r ec e l l s a f t e ri n j u r y ，w ef o u n dt h a tt h ea c t i v a t i o no f h e p a t i cs t e m p r o g e n i t o rc e l l sw a sa l m o s ti n h i b i t e dc o m p l e t e l ya td a y4 f i n a l l y ，t h e l i v e rt o o kn e a r l yo n ew e e kt oc o m p l e t er e g e n e r a t i o n t h eq u a n t i t yc h a n g ea n dc e l l c y c l es y n c h r o n i z a t i o no fh e p a t i cs t e m p r o g e n i t o rc e l l sw e r ed i f f e r e n te v e r y1 2h o u r s b e t w e e nd a y3a n d d a y 4 p o s ti n j u r i e s ，r e s p e c t i v e l y m o r e o v e r , h e p a t i c s t e m p r o g e n i t o rc e l l ss t i l l r e t a i n e db r d ul a b e lf o re x t e n d e dp e r i o d sa n dl o c a t e d d e f i n i t i v e l yi nt h ep e r i p o r t a lr e g i o n t h u s , w ec o n c l u d et h a tp u l s ec h a s em e t h o d t o g e t h e rw i t h5 f ui n j u r yp l u sl a b e lm e t h o dc o u l db eu s e d t oi d e n t i f ya n dl o c a t ea d u l t h e p a t i cs t e r n p r o g e n i t o rc e l l s ，w h i c hh o l d sc l i n i c a l l yp r o s p e c t s k e yw o r d s ：h e p a t i cs t e m p r o g e n i t o rc e l l s ；l a b e l r e t a i n i n gc e l l s ；5 - f l u o r o u r a e i l ； d o l i c h o s b i f o w sa g g l u t i n i n ；l i v e rr e g e n e r a t i o n ；h i s t o l o g i c a ll o c a t i o n n h s c s ，h p c s a s c s l r c s p c s n p c s 5 f u c k d a p i s c a - i d b a b r d u b s a p i a b c s h p c s o c d d c s p c o h e p c a m p i 撇 a a f d d p i v p h f a h 浙江理工大学硕士学位论文 缩略语 a d u l ts t e mc e l l s l a b e lr e t a i n i n gc e l l s 肝干祖细胞 成体干细胞 标记保留细胞 n o n - p a r e n c h y m a lc e l l ( s ) 5 f l u o m u r a c i l 非实质细胞 5 氟尿嘧啶 细胞角蛋白 2 - ( 4 - a m i d i n o p h e n y l ) - 6 - i n d o l e c a r b a m i d i n e 4 , 6 联脒一2 一苯基吲哚 d i h y d r o c h l o d d e s t e r nc e l la n t i g e n - 1 d o l i c h o sb i f o w sa g g l u t i n i n 5 - b r o m o - 2 - d e o x y u r i d i n e a l b u m i n ，b o v i n e ，f r a c t i o nv 4 - 6 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e a t p b i n d i n gc a s s g r e s m a l lh e p a t o c y t e l i k ep r o g e n i t o rc e l l s o v a lc e l l s d i e t h y l d i t h i o c a r b a m a t e s i d ep o p u l a t i o n c a n a l so f h e r i n g e p i t h e l i a lc e l la d h e s i o nm o l e c u l a r p r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e n 2 - n a c e t y l a m i n o f l u o r e n e d i p e p t i d y ip e p t i d a s ei v p a r t i a lh e p a t e c t o m y 干细胞抗原- l 双花扁豆凝集素 5 溴2 脱氧尿苷 牛血清白蛋白 4 ，6 联眯2 苯基吲哚 a t p 结合转运蛋白 类小肝祖细胞 卵圆细胞 二乙基二硫代氨基甲 酸 侧群细胞 润管 上皮细胞粘附分子 增殖细胞核抗原 2 乙酰氨基芴 二肽酰肽酶i v 部分肝切除 延胡索酰乙酰乙酸水 解酶 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文， 是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注 明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的 作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：馅生 日期：矽孵年哆月日 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借 阅。本人授权浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保密口 学位论文作者签名：苎猖生 日期：矽。宕年哆月游日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名：了玺彦玲 f t 期：年月 浙江理工大学硕士学位论文 第一章肝干祖细胞的研究进展 引言 一般认为，成体干细胞是一类较原始细胞，它们位于特定的微环境中，负责 正常组织细胞的自我更新及损伤后细胞的数量再次恢复到稳态。研究者已在多个 组织或器管中鉴定到成体干细胞的存在【l 】。成体肝脏是一个具有细胞更新速率慢 而高再生能力的器官。早期动物实验表明，对成体肝组织进行部分切除( p a r t i a l h e p a t e c t o m y , p h ) 后，剩余的肝组织在较短时间内仍能完整修复自身。肝组织的 强大再生能力已使其成为世界各国生物医学领域的研究热点。w i l s o n 等【2 l 于1 9 5 8 年率先提出成体肝组织中含有肝干细胞的假说。最近，s e l l 认为肝脏中有内源和 外源来源的干细胞，并提出肝的细胞系也由干细胞、短暂增殖细胞和成熟细胞组 成的假说【3 1 。而且，采用低氧悬浮培养消除成熟肝细胞的方法，h i s a y a 等【4 】从正 常的成体小鼠肝组织中分离到一异质性的非实质细胞群。此群细胞在体外培养时 增殖迅速，在培养的最初7 天，细胞已进行了4 到5 次细胞分裂。而且，此群细胞 表达甲胎蛋白( a l p h a - f e t o p r o t e i n , a f p ) 、e 钙粘素( e - e a d h e r i n ) 和白蛋白( a l b u m i n , 灿b ) 标志。但是，它们不表达另外一个干细胞标志细胞角蛋白1 9 ( c y t o k e r a t i n l 9 ， c k l 9 ) 。最近，h e r r e r a 等【5 】从正常成人肝组织中分离到一群人肝干细胞( h u m a n l i v e rs t e mc e l l s ，h l s c ) ，这群细胞表达一些间充质干细胞标记和巢蛋白( n e s t i n ) 及波形蛋白( v i m e n t i n ) 而不表达一些造血干细胞标志和胆管上皮标志，并且在 未分化培养基培养6 个月过程中，仍可以自我更新。如果在分化培养基上培养， 这群细胞可以分化为内皮细胞、肝细胞和产胰岛素的类胰岛结构。这些数据表明 成体肝组织中很可能含有干细胞。目前，采用多个诱导肝组织损伤的方法及遗传 修饰的转基因小鼠作为模型，一些研究者认为他们已分离到成体肝干祖细胞 ( h e p a t i cs t e m p r o g e n i t o r c e l l s ，h s c s h p c s ) 。从假说的提出到现在，人们已对成 体h s c 枷p c s 做了许多研究，对h s c s h p c s 的认识有了初步进展。但是，肝组织 中含有干细胞吗【6 】? 这个问题的回答仍然不是很确定，如果肝组织含h s c s h p c s 的话，这些细胞具体定位在哪里? 2 浙江理工大学硕士学位论文 1 成体肝组织中潜在的肝干祖细胞( h s c 棚p c s ) 1 1 肝细胞( h e p a t o c y t e ) 1 1 1 肝细胞的潜能 不像快速增殖组织( 例如：肠或皮肤组织) ，肝细胞在正常成体肝组织中处 于静息状态。因此，无论是手术切除肝小叶的7 0 ，还是因病毒感染、化学试剂 损伤所造成的肝细胞丢失，都将刺激剩下的肝细胞从g 0 期进入细胞周期 7 1 。最 终，肝脏将会在2 周内再生自身。一般认为，这一再生过程几乎不包含干细胞的 参与网。而且，增殖的肝细胞很快会再次回到静息状态。然而，r h i m 等【8 】分别从 两个转基因小鼠，即e l m y c 转基因小鼠和b 6 转基因小鼠中分离到遗传修饰的 肝细胞，前者携带有大鼠弹性蛋白酶基因与小鼠c m y c 结构基因融合的序列 ( e l m y c ) ，后者携带包含侧翼序列的m e t a l 1 0 t h i o n e i n - i 基因启动子与修饰后的 b 半乳糖胺结构基因融合的序列( m t 1 a c z ) 。分离的肝细胞再分别移植入白蛋 白尿激酶( a l b u m i n u r o l ( i m ) 转基因小鼠体内。由于受体肝细胞表达的白蛋 白尿激酶会对肝细胞产生毒性，最后导致肝脏的损伤。如果供体肝细胞可以再 生受损的肝，那么应当能在受体肝组织中检测到供体来源的细胞型及其表达的分 子标志物。p c r 和s o u t h e r n ( d n a ) 点杂交结果表明，移植的供体细胞在受体 肝组织内多个区域出现并形成结节状增殖灶，此增殖灶所含的细胞数量比移植所 使用的细胞数量要多很多。另外，a l b u p a 转基因小鼠的肝实质细胞几乎完全被 m t 1 a c z 肝细胞所取代，并且所有的肝细胞在其核中显示强的x g a l 染色。这些 肝细胞形成大小不等的结节状增殖灶，在4 到5 周的时间每个供体肝细胞至少已 分裂1 2 次。因此，肝细胞可以被看作为单能祖细胞。更令人吃惊的是，o v e r t u f f 等【9 】在一个肝细胞连续移植模型中发现，当肝细胞移植入延胡索酰乙酰乙酸水解 酶( f a h ) 缺陷的啮齿动物后，一部分供体小鼠肝细胞在受体肝组织内至少可 以分裂8 6 次，这群细胞具有与造血干细胞相似的生长潜能。 另外，如果采用胆管毒素亚甲基双苯胺( d a p m ) 抑制卵圆细胞的形成， g e o r g ek 等【l o 】发现，移植来自于二肽基肽酶i v ( d p p i v ) 阳性供体的肝细胞进入 预先用倒千里光碱( r e t r o r s i n e ，r s ) 处理的二肽基肽酶i v 阴性的受体。移植前受 体的肝细胞和胆管上皮细胞不表达酶标志d p p i v ，而移植后，d p p i v 阳性的胆管 3 浙江理工大学硕士学位论文 上皮细胞数量增加并且显示为p c n a 阳性，这表明这些细胞是由移植后的肝细胞 转分化而来。门管区的肝细胞表达卵圆细胞和胆管标志o v 6 ，在后期，这些细胞 也表达c k 7 标志。最近，采用改良的w i l l i a m s e 培养基，f o u 9 6 r e d e s c h a t r e t t e 等 1 建立了c 5 7 b l 佑品系雌性小鼠的肝细胞原代培养体系。在肝细胞培养期间， 他们发现，从正常成体小鼠肝组织分离的肝细胞表达胆管卵圆细胞、胎肝和新 生小鼠肝及成体肝脏的肝细胞标志。而且，进一步的证据表明，当这些细胞被移 植入一个a l b u p a s c i d ( a l b u m i n - u r o k i n a s e t y p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r ( u p a ) s e v e r e c o m b i n e di m m u n e d e f i c i e n t ) 肝再生小鼠模型中后，它们可以分化为肝细胞和胆 管细胞。因此，他们认为这些肝细胞能作为假定的肝干细胞发挥功能。由于近来 的研究，研究者可能要改变以前那种单一的看法。肝细胞极有可能是潜在的功能 干细胞之一。 1 1 2 有干细胞特性的肝细胞来源 假定的干细胞一肝细胞一是否有可能来自于肝外组织。最近，采用延胡索酰乙 酰乙酸水解酶( f a h ) 缺陷的小鼠作为模型，l a g a s s e 等【1 2 】分别把r o s a 2 6 1 2 9 s v j 品系，野生型和携带有e c o l il a c z 基因的雄性小鼠的骨髓移植入f a h 缺陷的雌 性小鼠后，发现骨髓细胞可以治疗f a i l 缺陷小鼠的代谢性肝疾病，并且进一步 证明只有高度纯化后的造血干细胞( h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s ，h s c ) 可以分化为 成熟肝细胞以重建f a h 缺陷小鼠的肝脏。免疫组化结果显示这些肝细胞是6 半 乳糖胺阳性，共表达f a h 蛋白。而且，用可识别y 染色体s y c 基因区的分子探 针进行原位杂交后，也发现受体肝组织内出现y 染色体阳性细胞。同一年，n e i l d 等1 1 3 】的研究也发现，如果移植年龄相匹配的雄性b 6 d 2 f 1 小鼠的全骨髓进入接受 致死辐照的雌性小鼠，受体肝组织内的一部分肝细胞核内也可检测到y 染色体。 后来，w a n g 等【1 4 】的研究表明，肝细胞与来自骨髓的细胞采用非肝系细胞融合的 方式以再生受损的肝脏。而且，几乎不能检测到h s c s 转分化为肝细胞。相反， j a n g 等【1 5 1 的研究发现，移植的h s c s 并不是与肝细胞融合而是通过转变为功能肝 细胞以帮助受损的小鼠肝再生，并且肝功能在2 到7 天的时间即可恢复正常。 以上结果表明，骨髓很可能是其中的造血干细胞，其在肝脏受到严重损伤后不仅 可以分化为成熟肝细胞，也有可能采用与肝细胞融合的方式以再生肝脏。 4 浙江理工大学硕士学位论文 相反，y o s h i y u k ik a d a z a w a 等【1 6 l 研究了三个骨髓细胞形成肝细胞的模型，将 g f p 或d 半乳糖胺酶转基因小鼠的骨髓移植到受体后，研究者并不能在受体肝组 织内检测到g f p 阳性的肝细胞和x g a l 阳性染色。而且y 染色体阳性的细胞所 占的比例仅约为l ：1 0 0 ，0 0 0 。因此，他们得出骨髓来源的肝细胞不仅不能对受损 肝脏恢复至正常做出贡献，而且也不能治疗肝损伤的结论。骨髓可能并不像人们 想象的那样具用可塑性【1 7 1 。但是，也有研究者1 8 1 提出骨髓可塑的潜能受到以下 因素的影响：年龄、移植的骨髓的造血干细胞的细胞周期( 是否处于g 0 期) 和 造血干细胞能否正确归巢。此外，转基因的表达受供体来源细胞的移植、扩充所 影响。这些因素很可能就是为什么有些骨髓移植实验并不支持骨髓尤其是造血干 细胞具有可塑性的论断。 另外，又有实验数据表明：成体肝组织本身存在极少量的骨髓h s c s ，它们 能在肝脏组织受损后再生肝脏。例如，t o n i g u c h i 等【1 9 1 研究组从成体啮齿动物的 肝组织中分离到了表达骨髓造血干细胞表面标志的细胞群，即l i n s c a - 1 + c k i t + ( k t l s ) 细胞群，此群细胞在肝组织中所占的百分比仍高于它在外周血中所占 的百分比。另外，在用p b s 缓冲液灌注至外周血全部冲出后，肝组织内的k t l s 的数量仍保持不变。如果在体外培养1 2 天后，k t l s 细胞群可形成高增殖潜能 集落形成单位( h i g hp r o l i f e r a t i v ep o t e n t i a lc o l o n y f o r m i n gu n i t s ，h p r - c f u ) 。令人 吃惊的是，仅仅注射5 0 0 个k t l s 细胞即可重建接受过致死辐射的小鼠的造血系 统。另外，在移植入受体后的1 2 天k t l s 细胞即可形成脾集落形成单位 ( c o l o n y f o r m i n gu n i t s - s p l e e n ，c f u s ) 。因此，以上数据表明造血干细胞( h s c s ) 极有可能居住于成体肝组织中，并在肝损伤后参与肝再生。此结果也从侧面说明 了具有干细胞特性的肝细胞的肝内起源。因此，肝很可能拥有两个独立的机制以 再生它本身。以上研究使得干细胞特性的肝细胞来源问题变得更加复杂。从整体 的观点来看，在实体器管再生的过程中，骨髓的影响不容被忽视。 1 2 卵圆细胞( o v a lc e l l s ) 1 2 1 卵圆细胞的特征 1 9 5 6 年f a r m r 首次使用了卵圆细胞这一术语，在过去的几十年里关于 人类和啮齿动物肝内卵圆细胞的激活及定位、潜能及分子表达谱的研究从未停止 过。一般认为，在正常的成体肝内并不能检测到卵圆细胞的存在，只有在病理条 浙江理工大学硕士学位论文 件下，即肝内的肝细胞增殖受损，或其增殖被阻碍后，卵圆细胞才会出现。它们 是在肝损伤后，由位于润管( t h ec a n a lo f h e r i n g ，c o i l ) 处的肝干细胞分化而来。 激活后的卵圆细胞群可以分化为肝细胞及胆管细胞系，其所表达的分子标志见表 l 。近来，卵圆细胞通过其他分子表面标志的表达得到了进一步描述。例如类d e l t a 蛋白【2 0 1 ，上皮细胞黏附分子( e p c a m ) 2 1 】，小鼠a - 6 蛋白瞄】。分析卵圆细胞表 达的标志表明，增殖性的卵圆细胞群是由一个异质性的细胞区室组成( 或卵圆细 胞室) ，它们含有处于不同分化能力和分化时期的细胞网。 1 2 1 卵圆细胞的来源 关于卵圆细胞的来源问题一直争论不止。p e t e r s e n 等【2 4 】通过骨髓移植和全肝 移植到相应受体的方法以论证卵圆细胞和其他肝细胞是否可能起源于骨髓。他们 最后发现受体肝组织内可以分别检测到y 染色体阳性细胞( 占肝细胞总数的百 分比是0 1 4 ) 及表达成熟肝细胞标志h 4 和c c a m 的二肽酰肽酶阳性细胞。 最终的证实方法是采用全肝移植，结果发现表达组织相容性复合物i i 类分子 ( l 2 1 6 同工酶) 的供体细胞在全肝移植后出现在受体( 不表达l 2 1 6 抗原) 肝 组织内。随后，来自人类的研究结果也表明h s c 可以作为肝卵圆细胞的来源【2 5 】。 相反，m e n t h e n a 等【2 6 j 发现正常同系雄性d p p i v 阳性大鼠骨髓移植入d p p i v 阴性雌性受体后，虽然d p p i v 阳性细胞确实在受体肝组织中出现，但是当再对 此受体肝分别进行2 - a a f p h ，d g a l 和r s p h 损伤后，他们发现肝组织内出现 另一群c k l 9 阳性并能形成类管状结构的卵圆细胞群，此群细胞增殖迅速并形成 c k l 9 阳性的分支管状结构。然而，d p p i v 阳性的细胞数量并没有在损伤后增加， 而且也不表达c k l 9 标志。因此，并不能认为来自骨髓的祖细胞能转分化为卵圆 细胞以再生受损的肝脏。另外，w a n g 等【2 7 】的实验结果也发现，损伤后激活的卵 圆细胞是肝内起源。从以上的结果来看，卵圆细胞也很可能有众多来源，其表达 的分子标志和造血干细胞所表达的分子标志也可能有交叉重叠。卵圆细胞的分子 标志情况比较复杂，因物种的不同而不同，甚至因损伤方法的不同而有差异。 1 3 一个新的、独立的类干细胞群：类小肝细胞祖细胞 1 3 1 类小肝祖细胞的特征 小肝细胞的特点是体积小，大小是成熟肝细胞的1 3 1 2 ，其形态类似肝细 6 浙江理工大学硕士学位论文 胞，在体外有强大的克隆扩增功能，能在培养板中分裂3 天，单个克隆在1 0 天 左右可扩增1 0 0 倍。而且他们能持续增殖至少2 个月并分化为成熟肝细胞【2 蜘。 对d p p i v 缺陷的雄性德国品系f i s c h e r3 4 4 大鼠进行部分肝切除后，再用倒千里 光碱损伤肝，g o r d o n 等用激光捕获显微切割( l c m ) 结合原位免疫组化技术的 方法分析类小肝细胞祖细胞( s m a l lh e p a t o c y t e - l i k ep r o g e n i t o rc e l l s ，s h p c s ) 的基 因表达情况，结果表明，此群细胞在早期( 部分肝切除后3 到7 天) 表达大多数 肝富集转录因子的m r n a 或蛋白、w t l 、a f p 和p - g l y c o p r o t e i n 9 ( p g p ) 。另外， s h p c s 不表达c y p i 酶，因此对倒千里光碱的抑制有丝分裂效应有抵抗效应。这 些结果都表明当部分肝切除刺激的肝细胞增殖再被倒千里光碱所抑制或损伤之 后，成体肝组织中将出现一个独特的实质祖细胞群，即类小肝细胞祖细胞群 ( s h p c s ) 2 9 1 。这也在另外两个研究组中得到证实 3 0 - 3 1 1 。 1 3 2 类小肝细胞祖细胞的来源 然而，仍很难确切的回答s h p c s 的起源。目前的证据表明，s h p c s 不仅具有 类干细胞的特性，而且也具有成肝细胞、卵圆细胞和成熟肝细胞的部分表型，并 在肝再生过程中可作为祖细胞发挥功能。由于重组病毒载体能够稳定所携带基因 的表达和整合，因此，研究者采用重组逆转录病毒载体标记成熟肝细胞，以研究 s h p c s 的来源。如果对s p r a g u ed a w l e y 品系的l a cz 转基因雄性大鼠进行部分肝 切除之后再用倒千里光碱处理，a v r i l 等1 3 2 】发现，类小肝细胞祖细胞簇在肝组织 中出现，这些细胞表达k i 6 7 抗原，并具有高的有丝分裂指数的特性。而且，p 半乳糖胺酶免疫组化结果表明此群细胞起源于标记的肝细胞，s h p c s 与成熟肝细 胞之间有世系关系，a v r i l 等【3 2 】进一步提出这样一个假说：s h p c s 来源于一个稀有 的表达低水平c y p 蒋的成熟细胞，它们对倒千里光碱有抵抗性。这与先前的报道 相似 2 9 0 0 】。如果肝组织被部分切除后再用烷基化试剂d i p i n 处理小鼠肝脏，研究 者发现肝细胞可以作为小肝细胞增殖灶的前体细胞型【3 3 】。然而，有研究者认为， 需要进一步研究去证实s h p c s 是否源自一个与肝细胞形态相似的实质细胞亚群 【3 4 】 o 相反，v i g 等t 3 5 】进行了内源性再生压力之下的慢性肝损伤研究。在一个肝炎 b 表面抗原小鼠模型中证实了以下方面：s h p c s 在肝组织内形成小结节，结节内 的细胞是高增殖的，它们不仅表达细胞周期标志鼬6 7 和m c m 2 ，也表达c k 8 1 8 7 浙江理工大学硕士学位论文 和肝细胞及成肝细胞的分子标志如a l b 和a f p 。而且，对y 染色体的o c 基因区进 行原位杂交后，研究者并不能在受体肝组织内检测到y 染色体阳性细胞的出现。 这都说明s h p c s 很可能来自于肝自身，并不来源于骨髓。另外，用c k 8 1 8 分子 对连续切片的肝组织进行染色之后，对这些连续切片构建一个三维模型，他们发 现细胞角蛋白致密的卵圆细胞位于s h p c s 形成的结节周围，或者从多个位点刺入 结节内部直接与c k 8 1 8 阳性的s h p c s 相连并与c k 8 1 8 阴性的s h p c s 掺杂在一 起，这都表明卵圆细胞很可能是s h p c s 的祖先。骨髓移植后三个月，仅有少量 c k 8 1 8 阳性的肝细胞是y 染色体阳性，这表明骨髓对肝实质再生的贡献有限。因 此，在倒千里光碱部分肝切除模型中观察到的s 肿c s 很可能代表着一个新的、 独特的类干细胞，它们在形态和表型上不同于其他可识别的肝干细胞。从以上结 果看，这个新的s h p c s 细胞群的来源问题仍存在争议。需要进一步的实验证据确 认其起源。s h p c s 表达的分子标志见表1 。 c e l l l i n e a g em a r k e r sh e p a t o c y t e o v a lc e l l ss h p c s a l b u m i n 七 七l - 七 t r a n s f e r r i n + + g l y c o g e n + 一 + b f i ec a n a l i c u l i + - + o v 6 o c 2a n do c 3 b d 1 b d 2 o c 4 o c 1 0 a f p g l u c o s e - 6 p h o s p h a t a s e t h y 1 c y t o k e r a t i n s8a n dl8 s c f c k i t v i m e n t i n g g t c y t o k e r a t i n s7 1 4a n d1 9 表1 潜在的肝组织：f 祖细胞表达的分子标志类型【3 0 3 5 l t a b l e1m o l e c u l a rm a r k e r se x p r e s s e db yp o t e n t i a lh e p a t i cs t e m p r o g e n i t o rc e l l sa f t e r i n j u r y l 3 0 3 5 j + ，表示细胞表达此分子标志，- 表示细胞不表达此分子标志，q i ，_ ”表示不确定是否表 达此分子标志。 + i n d i c a t e st h a tt h e s ec e l l se x p r e s st h e s em a r k e r s 。“- ”i n d i c a t e st h e s ec e l l sd on o te x p r e s s t h e s em a r k e r s “+ - ”i n d i c a t e st h a ti ti su n c l e a rw h e t h e rt h e s ec e l l se x p r e s st h e s em a r k e r s 8 - - - - - + - - + - - - - + + + - - + - + + + + + + - - - - + + - + 浙江理工大学硕士学位论文 1 4 肝侧群细胞( 1 i v e rs i d ep o p u l a t i o n ) 分化程度较低的干祖细胞通常表达一些a t p 结合转运蛋白( a t p b m d i n g c a s s e t t e ，a b c ) 。细胞将会利用筒呼能量把外来的有毒物质从细胞内排出以保护自 身。g o o d e l l 等【3 6 】发现，当用h o e c h s t 3 3 3 4 2 对骨髓进行染色后，造血干细胞具有 很强的排出此染液的能力，被称为s p 细胞( s i d ep o p u l a t i o n ) ，这些细胞表达a t p 结合转运蛋白家族之- - a b c g 2 。而骨髓中其他细胞排出此染液的能力比较低。 他们所建立用于筛选造血干细胞的s p 细胞的方法已被推广用于从其他成体组织 类型中筛选组织特定的干细胞。例如，w u l 蹲1 37 】从小鼠肝组织中分离到一群侧 群细胞( s p ) ，此群细胞占的百分比是1 。当对此群细胞进行分子标志分析时， 他们发现此群细胞表达c d 3 4 、c - k i t 、s c a - 1 和t h y - i 而不表达成熟肝细胞标志f a h 和胆管上皮标志c k l 9 和a 6 。并且，当移植至u d i e t h y l d i t h i o c a r b a m a t e ( d d c ) 处 理的受体肝组织内后，这群细胞可以分化为肝细胞和胆管上皮细胞。他们认为此 群细胞是假定的肝干细胞群。最近，k o t t o n 等【3 8 】也从成体小鼠肝组织中分离到一 个与骨髓s p 相异的s p 细胞，即c d 4 5 + c k i t 一的稀有细胞亚群，这群细胞被命名为 c d 4 5 + 肝侧群末梢细胞。此群细胞拥有有力的、充沛的、长期重建造血能力。 以上研究表明，肝组织内居住一个s p 细胞群，此群细胞具有类造血干细胞 特性，然而s p 群细胞仍含有许多亚群。它们可能是潜在的肝内干细胞。 2 肝干祖细胞的定位 一般来说，干细胞居住于相应的微环境中( 小生境) 。对干细胞来说，微环 境是一个特定的解剖部位，它调节干细胞自我更新和组织再生、维持和修复。成 体肝干细胞存在的具体定位目前仍不清楚。自2 0 年前在胆管系统外发现了潜在 的微环境以后，成体肝中存在单一的微环境这一论断被推翻。根据目前的研究， 假定肝干祖细胞的组织定位有四个：1 ) 润管( c o h ) 3 9 1 ；2 ) 门管和中央静脉 周围嗍；3 ) 管状周围【3 4 1 】；4 ) 血管微环境。润管桥接两个部分：胆管细胞和肝 板的最远端肝细胞，这代表真正的肝一胆交界。实验数据表明，肝干细胞居住于 润管，肝脏在损伤后干细胞从那里被激洲3 9 1 。此外，其他研究者的研究表明胆 管系统外部也可能蕴含有干细胞【4 2 l 。干细胞常常从门管区增殖并扩展至肝实质 中，如果对门管区选择性的造成损害，增殖的干细胞数目减少，这进一步提示门 9 浙江理工大学硕士学位论文 管周围的某个地方必定含有肝干细胞m4 ”。更重要的是，w r i 曲t 等【删从年轻成体 小鼠肝组织分离到一群双潜能盯祖细胞，它们可以分化为肝细胞和胆管细胞系， 并定位在门管区周围。胚胎期，由于造血干细胞在肝脏中有短暂的居住，并且也 从_ f 常成体肝脏中分离到表达造血干细融分子标志的细胞群m3 ”。更重要的是， 有数据表明成体肝脏内保留一个造血系统微环境的残余部分1 1 9 j 这很可能 是胚胎期造血干细胞迁移肝脏后留下的。因此，成体肝组织内很可能含有另外 个特定的血管微环境，其作为一个储存循环造血干细胞的容器而笸挥作用。 综合以上的研究，我们认为，啦饰肝脏是i i l 一个多元的微环境所组成，其包古多 种类l ! 的肝十细胞，这些微环境共同组成个有机整体以应对小问的肝损伤，如 图l 所示。 圈l 不同类型的肝损伤很可能从不同的位点激活成体肝组织中的干细胞。这些细胞存在复 杂的关系 f i g l t h ea c t i v a t i o no f h e p a t i cs t e mc e l l sr e s i d e d i nd i f f e r e n tc o m p a r t m e n t s w a s i n d u c e db y d i s t i n c t i n j u r i e s t h ec o m p l e xr e l a t i o n s h i pe x i s t sa m u n g t h e s e h e p a t i cs t e mc e i l s 3 总结与展望 肝十细胞的研究是当前的研究热点并已取得了迅速的进展。综合以上研究 浙江理工大学硕士学位论文 成体肝组织中很可能有多种不同类型的肝干细胞以应对不同的损伤，不同区域蕴 含不同的干细胞。然而，未知的问题目前仍然存在：1 ) 肝组织内的成体干细胞究 竟在哪里? 2 ) 虽然不断有新的分子标志出现1 4 5 j ，然而目前还没有发现一个可靠 的肝干细胞的表面分子标志，结合侧群和分子表面标志筛选真正的成体肝干细胞 或许是一个新的思路；3 ) 每个实验室有它自己的损伤版本，且大多数用于激活 肝干细胞区室的实验步骤需要一个相对较长的时间【4 3 l 。另外，试验动物的年龄、 品系和物种的差异常被忽略i l 嚣j ；4 ) 由于骨髓的造血干细胞在肝脏发育过程中与 肝脏交织在一起，在损伤后的肝再生过程中，骨髓的影响是否应该被考虑在内? 成体肝脏干细胞的研究为肝细胞移植提供一种新的细胞来源，并可以缓解器管移 植供体紧张所面临的压力。应用肝干细胞治疗疾病比移植的方法具有许多优点， 如减少排斥反应。肝干细胞的研究也可推动生物人工肝的研究，在临床上也用于 治疗其他疾病。这都为肝干细胞的应用带来希望和广阔的前景。 浙江理工大学硕士学位论文 第二章实验方案设计 1 研究目的和意义 在大多数成体组织中，干细胞负责正常组织细胞更新及组织受到损伤后其内 的细胞数量再次恢复到稳态。目前，关于成体小鼠肝组织是否存在肝干祖细胞， 以及其居住的部位在哪里的问题，还没有直接的证据证明。本研究一方面，通过 皮下注射5 溴2 脱氧尿苷( b r d u ) 于5 天大的新生小鼠脉冲追踪肝干祖细胞及 其组织定位。脉冲追踪的方法已用于鉴定其他成体组织中的干细胞及其组织定 位。该研究可以为筛选新的肝干祖细胞分子标志提供一个新的思路。而且，未 来的研究将需要进一步分离这些标记保留细胞以分析其治疗潜能。 此外，用凝集素d b a 作为潜在的肝干祖细胞分子标志以鉴定其是否在成 体小鼠肝组织内存在，并鉴定是否能从成体小鼠肝组织中分选出d b a 阳性的细 胞群。期望寻找到较原始的肝干祖细胞群。 另一方面，我们采用尾静脉注射5 氟尿嘧啶( 5 f u ) 杀死处于迅速增殖期 的细胞，而干细胞则会抵抗5 - f u 的细胞毒效应。最后，干细胞将会被强制性的 进入细胞周期。这相当于对原始的干细胞产生一种富集效应。同时，用一种胸腺 嘧啶核苷的类似物质b r d u 标记这些激活的肝干细胞，进