（生物化学与分子生物学专业论文）果蝇幼虫细胞中非编码小分子rna的分离鉴定.pdf

中山大学倾士学位论文果蝇幼虫细胞中非编码小分子r n a 的分离箍定 果蝇幼虫细胞中非编码小分子r n a 的分离鉴定 专业：生物化学与分子生物学 硕士生：杜全生 指导教师：周惠副教授 摘要 非编码小分子r n a ( t i n yn o n c o d i n gr n a ，t n c r n a ) ，是近年来发现的一类 在生物的生长发育过程中具有重要作用的r n a 分子。对这些r n a 的的研究是后基 因组时代重要的科学前沿，因为它有可能揭示一个全新的由r n a 介导的遗传信息 表达调控网络，从而以不同于蛋白质编码基因的角度来诠释基因的结构与功能。 目前已经获得的非编码小分子r n a 还远不能达到上述目的，因此在各种模式生物 中继续分离和鉴定新的非编码小分子r n a ，对于小分子r n a 的研究具有重要的意 义。 我们从一类代谢稳定、富集于核仁区的主要指导r r n a 和s n r n a 的甲基化和 假尿嘧啶化的非编码小分子r n a ：核仁小分子r n a ( s m a l ln u c l e o l a rr n a ，s n o r n a ) 中的b o xh a c as n o r n a 研究开始。通过生物信息学的方法预测了一种新的s n o r n a 分子的存在，并根据其结构特点预测了它可能的生物学功能和基因组织方式。由 于它可能参与果蝇1 8 s rr n a 上第1 3 8 9 位置的假尿嘧啶化修饰所以命名为 p s i l 8 s 一1 3 8 9s n o r n a 。 根据该s n o r n a 分子的二级结构特征，设计了它的特异性杂交探针寡聚核苷 酸0 1 i g o l 3 8 9 b 分子。在应用该探针进行n o r t h e r nb l o t 实验对p s i l 8 s - 1 3 8 9 s n o r n a 分子进行鉴定时，在大小约1 6 0 n t 的位置得到其杂交信号。与此同时， 还发现在2 0 5 0 n t 的中间，约3 0 n t 的位置有另外一条明显的杂交信号的出现。 通过改变杂交的条件，验证了该条带并非污染，而是稳定的存在的杂交信号。 逆转录的方法同时也证明了在该区域稳定存在一类大小在2 0 、5 0 n t 之间的， 约3 0 n t 的r n a 分子。利用5 、r a c e 与文库构建相结合的方法，分离得到的5 类共 1 0 条序列片断，经过分析发现它们之间并不存在明显的保守模块，即分子之间 的同源匹配程度很低，说明位于该区域的分子不可能仅仅是一个或者一种分子， 依据实验的结果判断应当是一类分子稳定的分布于这个区段。根据上述的实验结 果综合分析之后初步断定在果蝇的三龄幼虫的这个生长发育阶段有可能在其体 中山大学硕士学位论文 果蝇幼虫细胞中非编码小分子r n a 的分离鉴定 内稳定的表达一类大小介于2 0 5 0 n t 的中间，约3 0 n t 的非编码小分子r n a 。 从上述的思路出发，用实验r n a 组学的方法来分离鉴定这类新的非编码小分 子r n a ，即通过构建果蝇三龄幼虫的非编码小分子r n a 的e d n a 文库的方式作为 基本的研究手段。 首先，在实验材料方面，严格控制果蝇的培养条件，保证在 其三龄幼虫的发育阶段分离总r n a 。其次，利用杂交位点定位的方法从p a g e 胶 中纯化回收r n a ，既保证了r n a 的纯度为将来的实验奠定基础，又晟大程度上保 证了回收的r n a 的有效性，尽可能的避免了其他r n a 的污染，为将来文库构建之 后的筛选做好铺挚。然后，通过在r n a 的两端加p o l y a 和p o l y g 的途径以最大可 能的覆盖所有的该区域的r n a 分子，确保文库中目的分子的丰度。最后，利用菌 落p c r 和杂交等手段筛选文库，获得目的质粒，测序，得到目的分子。 总之，利用5 r a c e 与文库构建相结合的方法分离的2 1 个质粒中，经过测序 得到了1 1 条有效的序列，合并相同序列总计5 类分子，这些分子序列之间的差 异性较大。在非编码小分子r n a 的c d n a 文库中得到了2 4 个重组质粒，测序结果 表明有7 条序列属于非编码小分子r n a 的范畴，其中一条序列d m t n c r 3 0 与 5 r a c e 与文库构建相结合的方法的到的d m 一3 0 的序列一致，分子的大小是3 0 n t ， 与探针0 1 i 9 0 1 3 8 9 b 分子有极好的匹配，通过b l a s t n 程序检索果蝇基因组数据库 没有发现完全一致的序列，据此，基本上可以判定d m t n c r 3 0 分子是在果蝇幼虫 的体内稳定的表达一种非编码小分子r n a 。 关键词：非编码小分子r n a 核仁小分子r n a 文库果蝇 u 中山大学硕士学位论文 果蝇幼虫细胞中非编码小分子r n a 的分离鉴定 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o nt h e t i n y n o n 。c o d i n gr n a i nd r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r l a r v ac e l l s m a j o r ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y n a m e ：d uq u a n s h e n g s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rz h o uh u i a bs t r a c t t i n yn o n c o d i n gr n a ( t n e r n a ) a r er e c e n t l ye l u c i d a t e dr n a s ，w h i c h p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ep r o c e s so ft h e1i f ed e v e l o p m e n t t h e i d e n t i f i c a t i o no ft h et n c p u n a si so n eo ft h eh o tt o p i c si nt h ep o s t g e n o m e e r a ，b e c a u s ei t i sl i k e l yt or e v e a lae n t i r e l yn o v e lr e g u l a t o r yn e t w o r k ， w h i c hd i r e c t e db yt n c r n a s i tm a y b ea n n o t a t e dt h eg e n o m es t u c t u r ea n d f u n c t i o ni nad i f f e r e n tw a yf r o mt h a to fp r o t e i nc o d i n gg e n e s h o w e v e r ， t h en u m b e ro ft n c r n a sf a ra w a ys a t i s f i e dt h ea b o v er e q u i r e m e n t s ，a sa r e s u l t ，i ti ss i g n i f i c a n tt of u r t h e ri s o l a t et h en o v e lt n c r n a si na l ls o r t s o fm o d e lo r g a n i s m s a tt h eb e g i n n i n gw i t ht h es t u d y ，b o x h a c as n o r n a ，w h i c ha r ek i n d o fm e t a b o l i c a l l ys t a b l et n c r n h s ，p r o m i n e n t l ye n r i c h e di nn u c l e o l u so f c e l l s m o s to ft h e ma r e r e s p o n s i b l ef o rg u i d i n gp s u d o u r i d y l a t i o n m o d i f i c a t i o n t h eb i o i n f o r m a t i c sm e t h o dp r e d i c t e dt h ee x i s t e n c eo fa n o v e ls n o r n a ，a sw e l la si tsg e n eo r g a n i z a t i o na n db i o l o g i c a lf u n c t i o n ， a c c o r d i n gt oi tss t r u c t u r e t h es n o r n aw a sn 锄e dp s i l 8 s 一1 3 8 9s n o r n a b e c a u s ei sm a y b ed i r e c tt h ep s u d o u r i d y l a t i o nm o d i f i c a t i o na tt h es i t eo f 1 3 8 9 o ft h ef l y1 8 sr r n a t h es p e c i f i co l i 9 0 1 3 8 9 bp r o b eo fp s i l 8 s 一1 3 8 9 bs n o r n aw a sd e s i g n e d o nt h eg r o u n d so fi t ss e c o n d a r ys t r u c t u r e t h e n o r t h e r nb l o tr e s u lt s d e m o n s t r a t et h el e n g t h so fp s i l 8 s 一1 3 8 9s n o l l n aa g r e ew e l lw i t ht h e i rc d n a s s i z e ，讪i c hi sa tl e a s t1 6 0 n t s i g n i f i c a n t l y ，a n o t h e ro b v i o u ss t r a n d ， i 中山大学硕士学位论文果蝇幼虫细搬中非编码小分子r n a 的分离鉴定 w h i c hs i z ei s3 0 n to r s o ， w a sd i s c o v e r e d v a r i o u s h y b r i d y z a t i o n c i r c u m s t a n c e sc o n f i r m e dt h es t r a n dw a st h ec o n s t a n te x i s t e n c e r e v e r s et r a n s c r i p t i o nc o n f i r m e dt h ep h e n o m e n as t a t e da b o v e w h i c h s i z e sr a n g ef r o m2 0t o5 0 n t ，u s u a l l y3 0 n t t e ns e q u e n c e s ，a s s o r t e dw i t h 5t y p e s ，h a v eb e e ni d e n t i f i e db yt h em e t h o dt h a t5 r a c ec o m b i n ew i t h 1 i b r a r yc o n s t r u c t i o n h o w e v e r ，a 1 1o ft h es e q u e n c e sa b s e n tc o n s e r v a t i v e m o t i f s ，t h a ti st os a y ，t h ef i v em o l e c u l e sh a v en o td i s t i n c ts i m i l a r i t y ， w h i c hs h o w st h em o l e c u l e sm a yn o tb e l o n gt oo n ef a m i l y i ti se s t i m a t e d t h e e n d o g e n o u st n c r n a s ，w h i c hs i z ev a r yf r o m2 0 n tt o5 0 n t ，m i g h tb e c o n s t a n t l ye x p r e s s e di nt h et h i r ds t a g eo ff l yl a r v a o r i g i n a t e df r o mt h et h o u g h t s ，t h ee x p e r i m e n t a lr n o m i c sw a sa p p l l e d t oc o n f i r mt h en o v e lt n c r n a s ，t h a ti st o s a y ，b yt a k i n gt h ew a yo f c o n s t r u c t i n gt h et h et h i r ds t a g ef l yl a r v at n c r n a s1 i b r a r ya st h eb a s i c r e s e a r c ht o o l s f i r s t l y ，t h ef l yl a r v ac u l t u r ew a ss t r i c t l yc o n t r o l l e d i no r d e rt om a k et h ef l yl a r v ai no n ed e v e l o p m e n ts t a g e ，a sar e s u l t ，t h e t o t a lr n ac o m ef r o ms a m ed e v e l o p m e n t a ls t a g e s e c o n d l y ，w eu t i l i z et h e s p e c i a lm e t h o d st og e tt h er n ai s o l a t e df r o mp a g ea n dw a sn o tc o n t a m i n a t e d w h i c hm a k eg o o dp r e p a r a t i o nf o rt h e1 i b r a r yc o n s t r u c t i o n t h e n ，t h et o t a l r n aw a sa d d e dt h ep o l y aa n dp o l y gb yc e r t a i ne n z y m ea tt h e3e n ds oa s t oc o v e ra sm u c hr n a sa sp o s s i b l e f i n a l l y ，t h ep l a s m i dw a si s o l a t e db y t h ew a yo fs c r e e n i n gt h e1 i b r a r ya n dt h es e q u e n c i n ga l s ow a sc a r r i e do u t t os u m m a r i z e ，t h e r ea r e2 1p l a s m i d s ，w h i c hs e p a r a t e df r o mt h e 5r a c ea n d1 i b r a r yc o n s t r u c t i o nm e t h o d a m o n go ft h e m1 1w e r es e q u e n c e d t h a ta s s o r t e dw i t hf i v eg r e a td i f f e r e n tf a m i l i e s i na d d i t i o n ，2 4 r e c o m b i n e dp l a s m i d sw e r eg e n e r a t e df r o mt n c r n ac d n al i b r a r y t h es e v e n t n c r n a sm o l e c u l es e q u e n c e sa r eb e l o n gt ot n c r n af a m i l y e s p e c i a l l y ， d m t n c r n a 3 0i st h es a m ew i t ht h ed m - 2 2 ，w h i c hc a m ef r o mt h e5 r a c ea n d 1 i b r a r yc o n s t r u c t i o nm e t h o d t h es e q u e n c eo fd m t n c r n a 3 0e x a c t l ym a t c h e s w i t ho li 9 0 1 3 8 9 bp r o b e b e s i d e st h a t ，t h el e n g t ho fd m t n c l l n a 3 0i s3 0 n t ， w h i c hp r o p e r l yc o r r e s p o n dw i t ht h en o r t h e r nb l o tr e s u l t b u ti th a sn o t 中山大学硕上学位论文果蝇幼虫细胞中非编码小分子r n a 的分离鉴定 b e e nf o u n dt h ec o m p l e t e l ym a t c h e ds e q u e n c e si nt h ef l yg e n o m ed a t a b a s e t od m t n c r n a 3 0s of a r f i n a l l y i ti sc o n s i d e r e dd m t n c r n a 3 0i so n eo f t h et n c r n a sc o n s t a n t l ye x i s ti nt h ef l yl a r v ac e l l s k e yw o r d s ：t i n yn o n c o d i n g r n as m a l ln u c l e o l a rr n a l i b r a r y v 中山大学硕士学位论文果蝇幼虫细胞中非编码小分子r n a 的分离鉴定 缩写词 a m pa m p i c i l l i n 氨苄青霉素 a pa m m o n i u mp e r s u l f a t e 过硫酸铵 b i s n ，n - m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d en ，n - 亚甲叉双丙烯酰胺 b pb a s e p a i r 碱基对 d n ad e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 c d n ac o m p l e m e n t a r yd n a 互补d n a r d n ar i b o s o m a ld n a 核糖体d n a c p mc o u n t i n gp e rm i n u t e 每分钟计数 d e p cd i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 d m s od i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲基亚砜 d n t pd e o x y r i b o n u e l e o s i d et f i p h o s p h a t e 脱氧核糖核苷三磷酸 d t td i t h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇 e c o l ie s c h e r i c h i ac o l i 大肠埃希氏杆菌 e d t a e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e t se x t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r 外转录区 gm i c r o g r a m 微克 h e p e sn 一2 一h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - n 一2 一e t h a n e s u l f o n i ca c i dn 一2 一羟乙基哌嗪- n 一 乙磺酸 i p t g i s o p r o p y l t h i o b d g a l a c t o s i d e 异丙基硫代- 8 - d 一半乳糖苷 i t si n t e m a it r a n s c r i b e ds p a c e r 转录间区 k bk i l ob a s e s 千碱基 k d ak i l od a l t o n s 干道尔顿 m o l m o l a r 摩尔 m l m i l i l i t e r 毫升 m r pm i t o c h o n d r i a lr n a p r o c e s s i n g 线粒体r n a 加工 n t n u c l e o t i d e 核苷酸 n t sn o nt r a n s c r i b e ds p a c e r非转录区 o r f o p e nr e a d i n gf r a m e 开放读码框 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 vp s e u d o u r i d i n e假尿嘧啶 r n ar i b o n u c l e i ca c i d 核糖核酸 r r n ar i b o s o m a lr n a 核糖体r n a t r n at r a n s f e rr n a转运r n a r n a s er i b o n u c l e a s e 核酸酶 r n p r i b o n u c l e o p r o t e i np a r t i c l e s 核糖核蛋白体颗粒 s n o r n ps m a l ln u e l e o l a r r n p 核仁小分子r n a 核蛋白体颗粒 s s e v d b e r gu n i ts e v d b e r g 单位 中l h 大学硕士学位论文果蝇幼虫细胞中非编码小分子r n a 的分离鉴定 s n r n as m a l ln u c l e i cr n a 核小分子r n a t i n yn o n c o d i n gr n a非编码小分子r n a s n o r n as m a l ln u c l e o l a rr n a 核仁小分子r n a s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 t e m e dn ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n en ，n ，n ，n - 四甲基乙二胺 t m gt r i m e t h y lg u a n o s i n e 三甲基鸟嘌呤 t r i st r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三( 羟甲基) 氨基甲烷 x - g a l5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 i n d o l y l b d g a l a c t o s e5 - 溴4 氯一3 一吲哚一p d 一半乳糖苷 dm e l a n o g a s t e rd r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 果蝇 中山大学硕士学位论文 果蝇幼虫细胞中非编码小分子r n a 的分离鉴定 第一章非编码小分子r n a 的研究概述 绪言：r n a 研究的简要回顾 纵观r n a 的研究历史可以发现r n a 研究通常得益于d n a 的研究成果，要么受 其理论上的启发，要么是在方法学上得到借鉴，一般来说每当d n a 研究取得重大 突破的时候，总会带来r n a 研究的一个新的突破”。从1 8 6 8 年f m i e s c h e r 最早从脓细胞的核中分离出d n a 及至1 8 9 4 年0 h a m m a r s t e n 始证明，酵母中存 在另一类糖成分不同的核酸，也即现在知道的r n a 。其后，以1 9 5 3 年w a t s o n 和 c r i c k 提出的d n h 双螺旋结构为代表的2 0 世纪5 0 年代d n a 研究的巨大成就导 致6 0 年代出现了一个r n a 研究的高潮”1 。其间发现了m r n a ，测定了一种t r n a 的 序列，破译了遗传密码。但是由于整体认识上的局限性这一时期始终将r n a 仅看 作是d n a 在传递遗传信息到蛋白质过程的中间体。2 0 世纪7 0 年代初d n a 重组 技术有了重大突破，并带动生物技术的迅速发展，引起了生物科学的第二次革阍。 这一由技术突破引起的革命不仅改变了生物科学理论研究的面貌，而且促使生物 科学与工程实践相结合，推动了生物技术产业的蓬勃发展。在其影响下又出现了 一个r n a 研究的高潮。8 0 年代初t c e c h 发现四膜虫r r n a 前体能够通过自我 拼接切除内含子，表明r n a 也具有催化功能，称之为核酶( r i b o z y m e ) 7 1 0 这对于 认为“酶一定是蛋白质”的传统观点是一次大的冲击。反义r n a ( a n t i s e n s e l n a ) 吲的发现表明，r n a 不仅是信息传递体，还具有调节基因表达的功能。其后 发现一个基因转录产物通过选择性剪接( a l t e r n a t i v es p l i c i n g ) 例可以形成多 种同源异形体( i s o f o r m ) 蛋白质，从而使“一个基因一条多肽链”的传统观点也 被打破。r n h 编辑( r n he d i t i n g ) 1 0 , 1 i 和r n a 再编码( r n ar e c o d i n g ) f 1 的发现， 使基因与其产物多肽链的共线性关系也被打破了。1 9 8 6 年，w g i l b e r t 提出 “r n a 世界”的假说1 4 , 1 3 , 1 4 1 ，认为r n a 既能携带遗传信息，又具有催化功能，因此 生命起源最早出现的应是r n a ，后来才有“蛋白质世界”和“d n a 世界”f l ”。在 2 0 世纪9 0 年代后期以人类基因组计划 1 6 , 1 7 i 为代表的大规模的基因组研究推动下， 人们对r r a 的认识不断深入，最近十年时间r n a 的研究得到了人们普遍的关注。 尤其是非编码小分子r n a 的研究在理论上有了新的突破，技术上获得新的发展， 取得了一系列的巨大成果。耳前人们对非编码小分子r r a ( t i n yn o n c o d i n g r n a ，t n c l 州a ) 1 8 a 9 , 删的研究有这样的共识：这些不编码蛋白质并且在生物体内具 有重要生物学功能的d i a 分子，它们在细菌、真菌、哺乳动物等许多生物体的 重要生命活动中发挥着极广泛的调控作用，如在染色体的修饰，基因的转录与失 中山大学硕士学位论文果蝇幼虫细胞中非编码小分子r n a 的分离鉴定 活、基因的表达与调控、细胞凋亡和细胞周期，脂肪代谢，神经元的不对称分布 乃至个体发育等系列关键的生命过程中均扮演重要的角色。对这些广泛存在于各 种生物尤其是高等生物如人类细胞中，数量巨大功能未知的非编码r n a 的结构及 其功能的研究是后基因组时代重要的科学前沿，因为它有可能揭示一个全新的由 r n a 介导的遗传信息表达调控网络，从而以不同于蛋白质编码基因的角度来注释 和阐明人类基因组的结构与功能。同时，基于非编码小分子r n a 研究所获得的新 发现，将为人类的疾病研究和治疗提供新的技术和思路。 1 1 非编码小分子r n a 的结构与分类 1 ，1 1 非编码小分子r n a 的分类 目前人们根据非编码小分子r n a 的所在位置、大小、特征及功能给予命名。 据统计已经实验证实并得到广泛承认的n c r n a 大致有十余种，包括( 1 ) 催化r n a ( c r n a ) ，也称为核酶，是r n a 拟酶和其它r n a 自我催化分子 2 1 , 2 2 1 ：( 2 ) 类m r n ar n a ， 是一类37 端有p o l y a ，无典型o r f ，不编码蛋白质的r n a 分子，与细胞的生长和分 化、胚胎的发育、肿瘤的形成和抑制密切相关的调节子：( 3 ) 指导r n a ( g u i d er n a ， g r n a ) 口3 1 ，是指导m r n a 编辑的d r n a 分子，多用来指导在m r n a 转录产物中加 入u 的过程位o ：( 4 ) t m r n a ，功能上既是t r n a ，又是m r n a ，在翻译时既可以转运氨 基酸，又可以当作模板：( 5 ) 端粒酶r n a ( t e l o m e r a s er n a ) ，作为真核染色体端粒 复制的模板 2 5 1 ：( 6 ) 信号识别颗粒( s i g n a lr e c o g n i t i o np a r t i c l e ，s r p ) r n a ”6 2 “，是s r p 的重要组成部分，与细胞内蛋白质的运转有关( 7 ) 细胞核小分子 r n a ( s n r n ) ，是m r n a 前体剪接体的必要组分，与m r n a 的加工修饰，选择性拼接有 关m 1 ：( 8 ) 核仁小分子r n a ( s n o r n a ) j ，参与r r n a 的加工，并指导r r n a 上特异 位点的甲基化或假尿嘧啶化修饰：( 9 ) 微r n a ( m i c r o r n a ) ，长度约2 2 n t ，广泛的参 与生物体内的代谢过程，基因表达调控、细胞周期调节以及个体发育过程，是目 前认为最重要的功能性非编码小分子r n a 之一口o i ：( 1 0 ) s i r n a ，是一种与微r n a 大 小相似的双链r n a 分子，它在r n a 干扰( 1 n a i ) 途径中主要介导序列专一的互补 m r n a 链的降解过程口1 1 。 1 1 2 以s n o r n a 和m i c r o r n a 为代表的非编码小分子r n a 的结构特征 1 1 2 1s n o r n a 的结构特征 中山大学硕士学位论文果蝇幼虫细胞中非编码小分子r n a 的分离鉴定 细胞核仁中含有大量的s n o r n a m 矧，根据它们的结构与功能特点，主要分为 两大类：b o xc ds n o r n a 和b o xh a c as n o r n a ；此外。还有一种s n o r n a ：r n a s e m r pr n a ，由于它不具备b o xc ds n o r n a 或b o xh a c as n o r n a 的结构特征，因 而单列成一类。 1 1 2 1 1b o xc d 类s n o r n a 的结构特征 最早发现的为b o xc ds n o r n a m l ，具有以下结构特征：5 端具有保守的b o x c 序列( 57 一r u g a u g a 一3 ) ，r 代表嘌呤核苷酸a 或者g ，3 端具有保守的b o x d 序列5 一c u g 卜3 。在分子的末端，多数b o x c ds n o r n a 具有4 n t 以上的末端 反向重复序列，可以相互配对形成较为稳定的短茎结构，将b o x c 和b o x d 的空 间位置拉近，这种由末端短茎结构和两个b o x 元件共有构成的结构( t e r m i n a l s t e m b o xs t r u c t u r e ) ，称为b o xc dm o t i f ( 图1 1 ) 。已有实验证明3 ”，b o xc d m o t i f 既是s n o r n a 加工成熟过程中外切酶的识别信号，也是核仁蛋白识别以及 s n o r n a 定位核仁的重要信 号。此外，在部分b o xc d s n o r n a 序列的中部，还具有 类似于b o x c 和b o x d 的结构， 分别称之为b o xc 、和 b o x d 、【3 5 】，与b o xc 和b o x d 比较，通常表现为卜2 个核苷 酸的差异，b o x c l 和b o x d 的间 距一般为3 - 9 个n t ，当超过 此闻距时，通常也会形成一个 小茎环结构将它们的空间间 距拉近。大部分b o x c d 图l 1b o x c r d 结构示意图 s n 。r n a 在b o x d 或d ，的上 f i g1 1m e8 叽。t t t r eo f b 。1 c 仍m o 游包含一段长i 0 2 i n t 的片段，称为反义序列，能与成熟r r n a 形成严紧配对， 指导r r n a 互补区中特定位点的2 乙0 一核糖甲基化修饰。这种指导核糖甲基化修 饰的b o x c ds n o r n a 又称为反义s n o r n a ( a n t i s e n s es n o r n a ) 3 6 1 o 1 1 2 1 2b o xh a c a 类s n o r n a 的结构特征 皇坐大学硕士学位论空果蝇幼虫细胞中非编码小分子r n a 的分离鉴定 相比于c d 类s n o r n ab o xh a c as n o r n a 的一级序列特征不明显( 如图1 2 所示) ，仅在分子3 末端，有一个 较保，守的“a c a ”或者是 “a a a ”“a u a ”的三核苷酸序列， 称为b o x a c a ，它总是与3 、末端相 距3 个核苷酸闻。 正因为如此，b o xh a c as n o r n a 发现和功能确定均晚于b o x c d s n o r n a ，而且，几乎所有的a c a 类 s n o r n k 都通过实验的途径获得，而 b 。xc ds n o r n a 中相当一部分均由 图1 2b o xh a c as n o r n a 的二级结构 计算机程序在基因组中系统搜索获 f i g1 2 t h es e c o n ds t r u c t u r eo fb o x 得。不过，b o xh a c as n o r n a 都具h a c a s n o r n a 有保守的二级结构：分子可以形成 两个发夹环，发夹环之间由一条短的单链结构相连，在分子的末端也具有一条类 似单链结构，将这种二级结构简称为：“发夹一铰链一发夹一尾部”的二级结构。 b o x a c a 位于“尾部”处，在铰链处还有一保守的b o x h 即“a n a n n a ”“n ”可以 是任意核苷酸m 3 5 ”1 。在5 端茎环和或3 端茎环的中部，具有一个泡状结构 ( p s e u d o u r i d y l a t i o np o c k e t ) ，是b o xh a c as n o r n a 的功能环；位于泡状结 构的两段序列可以与r r n a 中的一段序列形成配对，指导r r n a 中特定位点的假 尿嘧啶化修饰 3 8 , 3 9 1 。实验证明m 】，b o x h 和b o x a c a 不仅是s n o r n a 正确行使功能 必需的结构，而且与s n o r n a 在细胞中具备完整的分子末端，并稳定存在密切相 关。此外还发现位于b o xh a c as n o r n a 功能环两侧的短茎结构也是s n o r n a 正 确行使功链必需的。 1 1 2 1 3 r n a s em r pr n a 的结构特征 r n a s em r pr n a ，又称7 2 r n a ，为s n o r n a 研究初期发现。仅发现这一种。 大约长为2 6 0 - 2 8 0 个核苷酸，不具备b o xc ds n o r n a 或者b o xh a c as n o r n a 的 类似结构，由于细胞内大部分r n a s em r pr n a 富集在核仁，是核蛋白复合物的 重要组成，因此认为r n a s em r pr n a 为一种核仁小分子r n a 【4 2 】。7 2 r n a 在酵母 中由核内单基因编码，为酵母生长所必需”，它是r n a s em r p 酶的r n a 组成成分。 r n a s em r p 具有位点特异性的核糖核酸内切酶活性，已证明它与r r n a 前体的加 工成熟密切相关，负责r r n a 前体i t s 区l ，a 3 位点的剪切，即与5 8 s 的加工 中山大学硕士学位论文 果蝇幼虫细胞中非编码小分子r n a 的分离鉴定 剪切紧密相关，此过程必需有r n a s ei d r pr n a 的参与4 3 , 4 4 , 4 5 1 。r n a s em r p 在系 统发生中保守，广泛存在于包括脊椎动物、植物和酵母在内的各种真核生物中。 7 - 2 m r pr n a 的二级结构和r n a s epr n a 的二级结构很相似】，两者都具有中 央笼状的保守结构元件，并形成类似的假节，具有相同的结合蛋白。由此推测 7 - 2 m r pr n a 与r n a s epr n a 在系统发育上密切相关1 4 7 j 。 1 1 2 2m i r n a 的结构特点 经过对大量m i r n a 序列数据的分析以后，人们发现m i r n a 有以下几 个特点 3 0 , 4 8 4 9 5 0 1 ：( 1 ) 大小在2 i n t 左右，目前普遍认为的范围是1 7 2 7 n t ；( 2 ) 通 过杂交( 通常为n o r t h e r n 杂交) 可以正向鉴定出来；或者在小分子心队文库筛 选到大约为2 i n t 大小的分子，而这些分子序列与该生物基因组中的序列完全匹 配；( 3 ) 用经典t u 、a 二级结构折叠程序分析m i r n a 的前体可以形成发夹型茎 环结构，而成熟m i r n a 位于该结构的臂上。该二级结构符合最低自由能的规则， 内部没有大的侧环或者泡状结构，特别是不对称的泡状结构。动物m i r n a 前体 的大小一般为6 0 - 8 0n t ，植物的m i r n a 前体会有较多的变化；( 4 ) m i r n a 序列 及其预测二级结构在系统发生上是保守的；( 5 ) 在组织里当缺失了负责加工成熟 m i r n a 的蛋白复合物d i c e r 时m i r n a 前体积累量会增加，成熟分子的量会相应 减少【2 0 1 。当然不是每一个n f i r n a 都具备以上全部的特点，但前三个特点是绝大 多数m i r n a 分子都具备的。 值得关注的是，几乎所有已发现的动物m i r n a 在亲缘关系较近的物种中 是保守的，如m i r - 4 、n f i r 9 8 和m i r 一1 2 5 在人和小鼠中高度保守【1 5 】，而m i r - 1 2 4 ， m i r - 2 2 8 等在线虫的两个不同种，ce l e g a n s 和cb r i g g s a e 中也是相当保守的。 而且基因序列比较和表达分析证明，与核糖体r n a ( r i b o s o m a l r n a ，r l l n a ) 及核 仁小分子r n a ( s m a l ln u c l e o l a r r n a ，s n o r n a ) 的保守性相似。m i r n a 序列在进 化关系较远的物种中也具有显著的保守性。超过三分之一的线虫ce l e g a n s n f i r n a 在人细胞里都可以找到同源分子，如l i n 一4 、m i r 1 和l e t - 7 家族等等m 砸5 “。 1 2 非编码小分子r n a 的基因组织 中山大学硕士学位论文果蝇幼虫细胞中非编码小分子r n a 的分离鉴定 本世纪初，人类基因组计划的完成为代表的生命科学研究表明，编码蛋白质 的序列仅仅占整个基因组序列大约1 5 的比例。而占生物基因组的绝大部分的 非编码区域，例如在动物基因组的非蛋白质编码区( 包括蛋白质基因中的内含子