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浙江理工大学硕士学位论文 构建非整合型慢病毒载体的初步探索 摘要 以1 型人免疫缺陷病毒( h w - 1 ) 为基础构建的慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、 免疫反应小、携带的基因片段容量大和可整合进宿主基因组而长期表达等优点，因而成为 最理想的基因转移载体之一。然而，慢病毒的随机性整合到靶细胞染色体中也会促使细胞 基因组的一些功能基因被沉默或者引起原癌基因插入激活致细胞癌变等严重负面影响。非 整合型慢病毒载体的应用不但避免了随机整合导致插入诱变致癌的危险，而且保持了慢病 毒载体的其它优点。此外，在非整合慢病毒载体的基础上通过转座子引导的定点整合机制 可以进一步改造成定点整合慢病毒载体。 现有的非整合型慢病毒载体都是通过突变整合酶蛋白本身的一些位点或者其识别的 病毒长末端重复序列( 1 0 n g t e r m i n a lr e p e a t ，l t r ) 上的序列构建而成，存在很大的回复突变 风险，且由于没有从根本上对载体进行修饰和改造，h i v 同源序列仍然占非整合型慢病毒 基因组的2 0 。因此，我们提出一个新的逆转录系统构想，对慢病毒的序列进行精减和重 新排布，其中涉及到t r 舻引物初始结合位点( p r i m e rb i n d i n gs i t e ，p b s ) 的位置改变。 过去的研究表明慢病毒载体中p b s 位点与核心包装信号相隔较近甚至p b s 在整个病毒包 装过程中是否起作用还不清楚。此外，由于h i v5 r n a 非翻译区存在复杂的空间结构， u 5 区上游序列和包装信号形成稳定二级结构对病毒包装起重要作用，而且u 5 区下游部分 序列和p b s 部分序列配对形成u 5 p b s 发卡结构参与逆转录的起始。因此，我们设计了p b s 前四个碱基突变、p b s 的1 8 个碱基序列全部缺失和u 5 p b s 发卡结构序列缺失的三个载体 质粒来研究p b s 对病毒逆转录和病毒包装的影响。 该研究是在未经改造的慢病毒载体质粒p p g k g f p 基础上通过p c r 、酶切、连接等分 子生物学方法，经改造获得三个所需的目的慢病毒载体质粒( p p g k - g f p g 、p p g k g f p c 、 p p g k - g f p d ) 。此后，利用磷酸钙转染法生产三个经改造的病毒和l v g f p 阳性对照病毒。 经不断摸索，增加质粒转染效率，最终用包装l v g f p 病毒的细胞上清和纯化的病毒感染 h e l a 细胞，能够观察到绿色荧光。实验显示l v g f p 阳性对照病毒已成功包装，但是滴度 较低，需进一步改进以提高病毒产量。其他三个经改造的病毒上清和纯化的病毒感染h e l a 浙江理工大学硕士学位论文 细胞后没有观察到荧光。其原因有两：一是病毒已包装出来，但改造的部分对逆转录产生 影响所以观察不到荧光；二是病毒没有包装。此两种原因需要进一步的实验验证。总之， 我们所构建的三个经改造的慢病毒载体质粒为后续非整合慢病毒载体研究奠定了基础；以 及所生产出的l v g f p 病毒，尽管滴度低，但为后续慢病毒的生产奠定基础。 关键词：慢病毒载体；非整合；p b s ；u 5 p b s 发卡结构 i i 浙江理工大学硕士学位论文 t h ee l e m e n t a r ys t u d yo fd e v e l o p i n g n o n i n t e g r a t i n g l e n t i v i r a lv e c t o r e c t o r a b s t r a c t a sh u m a ni m m u n o l o g i c a lv i r u st y p e - 1 ( h i v - 1 ) b a s e dl e n t i v i r a lv e c t o rh o l d st h ec h a r a c t e r i s t i c s o ft r a n s f e c t i o nt on o n d i v i d i n gc e l l s ，l o wr a t eo fi m m u n o l o g i c a lr e s p o n s e ，l a r g e rc a p a c i t yo f t r a n s f e rg e n ef r a g m e n t sa n di n t e g r a t i n gi n t oh o s tg e n o m ef o rl o n g - t e r me x p r e s s i o no f t h e r a p e u t i c g e n e ，t h e r e f o r ei tb e c o m e so n eo ft h ei d e a l e s tg e n et r a n s f e rv e c t o r si ng e n et h e r a p y h o w e v e r , n o n s p e c i f i ci n t e g r a t i o ni n t oh o s tg e n o m ec a na l s ob ep r o b l e m a t i cb e c a u s eo fp o s s i b l eg e n e s i l e n c i n ga n di n s e r t i o n a lm u t a g e n e s i sw h i c hc a nl e a dt ou n d e s i r a b l ee f f e c t ss u c ha sm a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n n o n i n t e g r a t i n gv e c t o r sa v o i dt h ep o t e n t i a lm a l i g n a n tt r a n s f o r m a t i o na s s o c i a t e d w i t ht h en o n s p e c i f i ci n t e g r a t i o nb u tr e t a i nt h eo t h e rk i n d so fc h a r a c t e r i s t i c s ，a n di tc a na l s ob e e n g i n e e r e dt ot a r g e ti n t e g r a t i o nt os p e c i f i cs i t e sb yu s i n gt h es i t es e l e c t i o np r o p e r t i e so f t r a n s p o s o n s 。 a tp r e s e n t ，n o n i n t e g r a t i n gl e n t i v i r a lv e c t o rw e r ep r o d u c e db yi n t r o d u c i n gm u t a t i o n sm a d et o d i s a b l et h ei n t e g r a s ep r o t e i ni t s e l fo ra l t e rt h ei n t e g r a s er e c o g n i t i o ns e q u e n c e si nt h ev i r a ll o n g t e r m i n a lr e p e a t ( u r ) w h i c hh a st h ep o t e n t i a lp r o b l e mo fr e v e r s i o nb a c kt oa ni n t e g r a t i n g p h e n o t y p e ，a n dt h e r ei sl a r g er e g i o n so fh o m o l o g i e sb e t w e e nt h et r a n s f e rv e c t o ra n d t h e p a c k a g i n gc o n s t r u c t sa p p r o x i m a t e l y2 0 b e c a u s eo fn o nu l t i m a t em o d i f y i n ga n dr e c o n s t r u c t i o n o fv e c t o r t h e r e f o r e ，w ep u tf o r w a r dac o n c e i v ef o ran e wr e v e r s et r a n s c r i p t i o n s y s t e r 丘， c o n d e n s i n ga n dr e a r r a n g i n gt h es e q u e n c ee l e m e n to fl e n t i v i r a lv e c t o r t h i sm a yi n v o l v et h e a l t e r a t i o no ft r n a l y sp r i m e rb i n d i n g s i t e s ( p b s ) p o s i t i o n m a n ys t u d i e ss h o w e dp b s i sc l o s e t oc o r ep a c k a g es i g n a li no r i g i n a lv e c t o r , a n de v e nw ed o n tk n o ww h e t h e rp b sh a se f f e c to nt h e e n t i r ev i r u sp a c k a g e m o r e o v e r , t h e r ei sc o m p l e xs e c o n d a r ys t r u c t u r ei nt h eu n t r a n s l a t e dl e a d e r o ft h eh i v5 r n a g e n o m e u 5 u ps e q u e n c ei si m p o r t a n tf o rp a c k a g i n gs i g n a lt of o r m a tt h er n a s e c o n d a r ys t r u c t u r e ，a n du 5d o w ns e q u e n c ew i l lp a r t n e r s h i pw i t hp b ss e q u e n c e ，s t a r t i n gt h e r e v e r s et r a n s c r i p t i o n s ow ed e s i g nt h r e ev e c t o r st o i n v e s t i g a t et h er e q u i r e m e n t si n r e v e r s e t r a n s c r i p t i o na n dr n ae n c a p s i d a t i o n ，i n c l u d i n gt h em u t a t i o nd e l e t i n gt h ee n t i r eu 5 一p b sh a i r p i n ， l i i 浙江理工大学硕士学位论文 t h em u t a t i o nd e l e t i n gt h ee n t i r ep b sa n dm u t a t i o ni nt h ep b si nw h i c ht h ef i r s tf o u rn u c l e o t i d e s w e r ed e l e t e da n df o u ra d d i t i o n a ln u c l e o t i d e sw e r es u b s t i t u t e d w eh a v eo b t a i n e dt h r e em o d i f i e dl e n t i v i r a lv e c t o r p l a s m i d s ( p p g k - g f p g 、p p g k - g f p c 、 p p g k - g f p d ) o nb a s eo fp p g k - g f pv e c t o rp l a s m i dr e s p e c t i v e l yb ya p p l y i n go fas e to f m o l e c u l a rb i o l o g i c a lp r o t o c o l s ，s u c ha sp c r ，r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ec l e a v a g e ，l i g a t i o ne ta 1 t o p r o d u c et h r e em o d i f i e dl e n t i v i r a lv e c t o r sa n dl v g f pp o s i t i v ec o n t r o ll e n t i v i r a lv e c t o rb yc a l c i u m p h o s p h a t et r a n s f e c t i o nm e t h o d ，s t u d y i n gs t e pb ys t e pa n di m p r o v i n gt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y , w e h a v eo b s e r v e daf e we x p r e s s i o no ft h eg f pg e n eb yf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p eb yt r a n s d u c t i o n h e l ac e l l su s i n gv i r a lm e d i u ma n dp u r i f i e dv i r a lv e c t o r so fl v g f p i tp r o v e st h a tl v g f pp o s i t i v e c o n t r o lv i r a lv e c t o r sh a v eb e e np r o d u c e d ，b u tt i t r a t i o ni sv e r yl o wr e q u i r i n gi m p r o v e d b u tw e h a v e n td e t e c t e de x p r e s s i o no fg f pg e n eb yf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p eb yt r a n s d u c t i o nh e l ac e l l s u s i n gv i r a lm e d i u ma n dp u r i f i e dv i r a lv e c t o r so ft h r e eo t h e rm o d i f i e dv e c t o r s m a y b et h e r ea r e t w or e a s o n se x p l a i n i n go ft h i sp h e n o m e n a ：o n ei sv i r a lp a r t i c l e sa r ep r o d u c e db u tc a n n o tu n d e r g o r e v e r s et r a n s c r i p t i o nr e s u l t i n gn o td e t e c t e df l u o r e s c e n c e ，t h eo t h e ri sv i r a lp a r t i c l e sa r en o t p r o d u c e d ，a n dt h e s et w or e a s o n sr e q u i r ef u r t h e ri n v e s t i g a t e d i nc o n c l u s i o n ，t h r e em o d i f i e d l e n t i v i r a lv e c t o rp l a m i d ss e tu pab a s i sf o rf u r t h e rr e s e a r c ho fn o n i n t e g r a t i n gl e n t i v i r a lv e c t o r t h el v g f pp o s i t i v ec o n t r o lv i r a lv e c t o rp r o d u c e df o u n d e dab a s i sf o r f u r t h e rp r o d u c t i o n ， a l t h o u g ht h et i t r a t i o ni sl o w k e yw o r d s ：l e n t i v i r a iv e c t o r ；n o n i n t e g r a t i n g ；p b s ；u 5 - p b sh a i r p i ns t r u c t i o n i v 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师 的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：学、为 日期：如护眵年岁月坪e t 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保密口 学位论文作者签名：兹葛 日期：伽g 年乡月力妒日 年解密后使用本版权书。 指剥币虢鲜花 日期：别年乡月z 矿e t 浙江理工大学硕士学位论文 1 前言 随着对人类疾病发生的基因水平认识的逐步加深，基因治疗已经成为治疗肿瘤和遗传 病等难治性疾病的有效方法。目前用于基因治疗的载体包括病毒和非病毒载体两大类。非 病毒载体基因转移效率较低，因而用于临床试验的基因治疗方案大多数为病毒载体。常用 的病毒载体包括腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体和疱疹病毒 载体等。腺病毒载体虽然可感染分裂和非分裂细胞，但其免疫原性强，且目的基因不整合 进靶细胞基因组而使表达时间较短；逆转录病毒载体主要缺陷在于不能有效转导非分裂细 胞。其它病毒载体如腺相关病毒载体和疱疹病毒载体也存在诸如可插入基因容量小和毒性 较大等不足。以1 型人免疫缺陷病毒( h i v - 1 ) 为基础构建的慢病毒载体具有可感染非分 裂细胞、免疫反应小、携带的基因片段容量大和可整合进宿主基因组而长期表达等优点， 因此被认为是目前最有效的基因转移载体之一，并成为转基因动物和基因治疗研究的重要 工具。 慢病毒载体的最大优点是能够将外源基因通过病毒的包装、感染，随机整合到靶细胞 的染色体上并得到持久性表达。然而，随机整合是一把双刃剑，也可能导致诱变效应如原 癌基因被插入激活，或者引起效应基因被关闭而影响细胞的功能【。有研究报道部分应用 整合型逆转录病毒载体进行基因治疗x 连锁的重症联合免疫缺陷症的患者出现白血病样 综合征等严重后果【2 ，3 1 。因此，发展一种能够真正为临床应用的安全性好的慢病毒载体非常 必要。将目前的随机整合型慢病毒载体进行改造成没有整合能力的非整合型慢病毒载体， 尤其是对应用于分裂后组织的治疗能够减小插入突变的危斛4 1 。 1 1 慢病毒载体的生物学特性 慢病毒载体根据其生物来源不同，主要有以下几种类型：人类免疫缺陷病毒( h i v ) 、 猴免疫缺陷病毒( s i v ) 、猫免疫缺陷病毒( f i v ) 、马传染性贫血病毒( e l w ) 和牛免 疫缺陷病毒( b i v ) 等。其中人h i v 1 型载体系统研究得最为广泛和深入。 1 1 1f l l v 1 病毒的形态结构 h i v - 1 病毒直径1 0 0 - - - , 1 2 0 m ，呈2 0 面体对称结构、球形，在电镜下可见h i v - 1 有一 颗似子弹头形状的病毒核心。该病毒核心由衣壳蛋白所组成，其内包含逆转录酶、整合酶、 蛋白酶、核壳蛋白( n c ) 和两个完全一样的病毒r n a 分子。h w - 1 病毒的表面为脂蛋白 包膜，其来源于宿主细胞膜的膜质结构，膜上有表面蛋白( g p l 2 0 ) 和跨膜蛋白( g p 4 1 ) ， 包膜内面为p 1 7 构成的基质蛋白( m a t r i x ) 。 浙江理工大学硕士学位论文 1 1 2 h i v 1 病毒基因组结构及其功能 h i v 1 的基因组全长大约有9 2 k b ( 见图1 ) 。其基因组包含3 个结构基因g a g 、p o l 、 e n v ，4 个辅助基因v i f 、v p r 、n e f 、v p u 和2 个调节基因t a t 、r e v ，并且在病毒基因组的5 端和3 端各有一段相同而又不转录的核苷酸序列，称为长末端重复序列( 1 0 n gt e r m i n a l r e p e a t ，l t r ) 。结构基因g a g 编码病毒核心蛋白，p o l 基因编码病毒复制所需要的酶，e n v 基因则编码病毒的包膜糖蛋白；调节基因t a t 和r e v 编码的蛋白分别在转录及转录后水平调 控病毒基因表达；辅助基因v p u 参与病毒颗粒的组装，v i f 基因编码的蛋白质与病毒的感染 性有关，n e f 基因编码负调节蛋白，对结构和调节基因的表达有下调作用，v p r 基因编码的 产物参与形成整合前复合物。 5 l t r g a f fv i f 皿1 l _ 3 l t r v p rv p u 图1 野生型i t i v 1 的基因结构 f i g 1g e n o m es t r u c t u r eo fw i l d t y p eh i v - 1 1 1 3h i v - l 的生活周期 首先，h i v - i 病毒颗粒利用其表面蛋白g p l 2 0 与靶细胞膜表面的c d 4 分子相结合而进 入易感靶细胞。一旦与细胞膜上的特异受体结合，慢病毒膜和细胞膜融合随后病毒核心释 放入细胞浆里。病毒r n a 逆转录合成双链线性d n a 而转运至细胞核。线性病毒d n a 永 久性的整合入染色体d n a ( 宿主基因组) 中，形成前病毒，成为永久的遗传成分，在细胞 周期中与靶细胞基因一样进行复制，传给子代细胞。前病毒d n a 转录成r n a 后再转运至 胞浆，在胞浆中r n a 翻译成病毒蛋白。此后，病毒前结构蛋白、复制酶和病毒r n a 组装 成新的病毒核心，从包装细胞获得病毒包膜蛋白后以出芽的方式从细胞膜释放出来。病毒 前结构蛋白经进一步处理而最终形成成熟的具有感染性的子代病毒颗粒。 1 1 4h i v - 1 整合的分子机制及转导非分裂细胞的机制 病毒d n a 与宿主d n a 整合的第一步是从病毒d n a 3 端切割掉2 个核苷酸，暴露出高 度保守的3 t 末端是c a 核苷酸( 3 - e n dp r o c e s s i n g ) ；第二步是链转移( s t r a n dt r a n s f e r ) ，整 合酶切割宿主细胞染色体d n a ，产生间隔5 个碱基的交错切口，病毒d n a3 端带自由羟 2 浙江理工大学硕士学位论文 基的碱基与宿主d n a 5 端共价连接；第三步是宿主细胞酶修补病毒d n a 与宿主d n a 之 间的裂隙，完成整个整合过程。 在病毒复制过程中，h i v - 1 的d n a 与g a g 编码的基质蛋白、p o l 编码的整合酶和v p r 辅助蛋白形成整合前复合物，其本身具有核定位信号，有利于整合前复合物进入靶细胞核， 而不完全依赖靶细胞的分裂状态，此为慢病毒载体能转导非分裂期细胞的主要机制。 1 1 5h i v - 1 来源的慢病毒载体构建及应用 近年来，以慢病毒为载体的基因治疗研究发展非常迅速。从第一代慢病毒载体的应用 至第三代慢病毒载体系统的改进以及自我灭活型慢病毒载体系统( s e l f - i n a c t i v a t i o nv e c t o r s ， s 玳) 的产生，通过逐步去除野生型病毒基因组中的致病基因而大大提高了其生物安全性。 第一代慢病毒载体系统的构建以n a l d i n i 等i 5 j 应用的三质粒系统为代表，由包装、包膜及载 体质粒组成，生产慢病毒的同时降低了野生型病毒产生的可能。在此基础上，应用水泡性 口炎病毒g 蛋白( v s v - g ) 包膜构建的假构型慢病毒载体，其病毒滴度和病毒感染能力都 得到了提高，使之能够感染原代肝细胞、外周血淋巴细胞和成纤维细胞等。为进一步降低 野生型病毒产生的可能性，第二代慢病毒载体系统又去除包装质粒中的4 个辅助基因。结 果表明不但没有降低病毒滴度，而且增加了生物安全性【引。第三代慢病毒载体系统的构建 是在三质粒系统基础上增加一个含r f v 基因的质粒而形成四质粒载体系统【7 1 。改进后的系 统进一步减少了h i v - 1 包装所需的序列同源性结构，且对病毒滴度和转导效率都没有影响。 s i n 慢病毒系统将病毒基因组3 端l t r 中u 3 区的增强子和启动子序列去除，使l t r 区的 转录激活能力下降，并使得所形成的载体缺少h i v 增强子和启动子而产生失活的前病毒， 因此消除了对外源启动子的干扰作用和对下游基因组中原癌基因的激活【引。目前，人们已 成功应用慢病毒载体有效感染造血干细胞、神经细胞、肝细胞、视网膜色素上皮细胞和肌 肉细胞及进行相应疾病的治疗等，尤其在血液系统疾病治疗中有广泛的应用，如血友病、 白血病、f a n c o n i 贫血症和镰刀状细胞贫血症等。 1 2 非整合型慢病毒载体 1 2 1 非整合型慢病毒载体的研究现状 以h i v - 1 为基础构建的慢病毒载体因为具有相对较大的包装容量、能够感染多种不同类 型的细胞包括分裂后细胞而成为很有前景的基因转移载体 5 1 。然而，慢病毒载体的随机整 合特性会给细胞带来负面影响甚至恶性转化【9 ，1 0 1 。非整合慢病毒载体能够避免随机整合引 起的不利影响而仍然保持慢病毒载体的优点，因此非整合慢病毒载体的研究与开发具有非 常重要的意义，可以很好地提高其应用的安全性。c a r a 等【1 1 】研究发现慢病毒基因组r n a 进 3 浙江理工大学硕士学位论文 入宿主细胞，在逆转录复合物介导下进行逆转录后会以三种形式存在，分别为双链线性 d n a 、1 - l t r 环状和2 l t r 环状。研究显示含有一个l t r 的环状d n a 是由于两个l t r 之间 产生序列同源重组，而含有两个l t r 的环状d n a 则被认为是非同源重组造成【1 2 1 5 】。b u t l e r 等1 1 6 j 对慢病毒载体感染的分裂细胞中的1 l t r 环状和2 l t r 环状d n a 进行定量分析，发现 两者比例大约为9 ：1 。同样，t e r s k i k h 等【1 7 l 在感染了整合型慢病毒载体的鼠造血干细胞的 传代细胞中观察到游离的环状d n a 结构体。而又有研究者发现尽管高效率的目的基因表达 要依赖游离d n a 的量、结构和细胞种类但是目的基因能够从非整合的d n a 上得到表达 【1 8 2 l 】 o 慢病毒的整合由3 2k d a 的整合酶介导。整合酶由p d z 基因编码，该基因包含三个功能区： n 端锌指结构区、中心催化区和c 端d n a 结合区阮2 3 1 。整合酶不但参与前病毒d n a 的整 合还与h i v 1r n a 的逆转录和前整合复合物的入核有关【2 4 , 2 5 1 。因此，为了得到有功能的非 整合慢病毒载体，研究者们没有将编码整合酶的基因完全删除而是进行特定的点突变使整 合酶的介导整合功能丧失。e n g e l m a n a - 尊 2 6 】把整合酶基因上的突变分为i 和i i 类。他们认为 改变n 末端组氨酸和半胱氨酸残基保守序列的i i 类突变会对病毒包装和逆转录产生影响， 从而导致目的基因的表达减少。因此，i i 类突变的方法不适合发展非整合型慢病毒。而i 类突变能够在不影响病毒包装、逆转录、双链d n a a 核、目的基因高效转录和翻译的基础 上使慢病毒整合功能缺失。如l u i s 等【2 7 】使用了两种方法来阻止整合以构建非整合型慢病毒 载体。第一种方法采用i 类突变使整合酶上的d 6 4 、n 1 2 0 、q 1 4 8 和w 2 3 5 四个位点突变， 其中氨基酸残基q 1 4 8 参与病毒d n a i 拘结合【2 8 , 2 9 ，而n 1 2 0 和w 2 3 5 与结合到宿主基因d n a 有 关m 3 ，d 6 4 贝l j 是整合酶中心催化区三个氨基酸中的一个并与慢病毒的整合有必然联系【3 0 】。 第二种则是把病毒基因l t r 上整合酶识别序列的保守c a - - - 核苷酸突变成t g 。实验结果表 明，无论是i 类突变还是整合酶识别序列保守碱基的突变都不影响病毒生产，同时在非分 裂细胞中有高效的外源基因表达，而且体内实验也证明外源基因高效表达旧。 上述构建非整合型慢病毒载体的方法都是通过整合酶上的点突变或其识别序列的突 变来达到目的。此外，也可选择其它方法来阻断慢病毒载体整合。例如二酮酸是h i v 1 整 合酶的抑制剂，在不影响前病毒d n a 合成的条件下能够特异抑制整合酶的链转移功能，并 且二酮酸的存在会导致环状游离病毒d n a 的累积。更有研究表明，二酮酸在体内实验时能 抑制慢病毒整合1 3 2 1 。因此，理论上我们能够利用二酮酸来构建更为安全的基因转移非整合 型慢病毒载体。有研究认为，一些宿主因子与整合酶及其整合能力密切相关，这些因子包 括h m g a l 、i n i l 、b a f 和p 3 0 0 等 3 3 - 3 6 】。c h e r e p a i l o v 等f 3 7 】发现晶状体上皮生长因子转录激活 4 浙江理工大学硕士学位论文 因子p 7 5 ( l e d g f p 7 5 ) 与整合酶有关，而b u s s c h o t s 等【3 8 1 又发现它与整合酶结合到宿主d n a 的过程相关联。随后，又有研究发现整合酶的q 1 6 8 a 突变能够阻断l e d g f p 7 5 与整合酶的 相互作用【3 9 1 。因此，发展没有整合能力的慢病毒载体既要维持外源基因的高效表达也可以 通过抑制与整合过程关系密切的宿主因子来实现。 1 2 2 非整合型慢病毒载体存在的不足 目前，非整合型慢病毒载体的构建是通过突变整合酶蛋白本身的一些位点或者其识别的 病毒l t r 上的序列来实现。尽管在分裂后组织或细胞如肌肉细胞、脑组织等，非整合型慢 病毒介导的外源目的基因可实现稳定长期表达【2 7 1 ，但在分裂细胞中目的基因也得到了高的 瞬时表达【矧。然而，这些策略都存在很大的回复突变为整合型的风险，同时这些改造没有 对慢病毒载体做最根本的改变，且同源序列占h i v 基因组的2 0 。 1 2 3 突变或缺失p b s 对慢病毒包装和逆转录的影响 为改进上述不足，我们提出一个新的逆转录系统的构想，即一步逆转录成d n a ，不需 要模板的两次跳跃过程。在新的逆转录病毒设计中会涉及到t r n a 啪引物初始结合位点 ( p r i m e rb i n d i n gs i t e ，p b s ) 及与其部分配对的u 5 区下游的位置的移动，而p b s 位置的移动 又会带来新的思考。p b s 在逆转录过程的启始和模板的第二次跳跃过程中有非常重要的作 用，而其对与之相隔较近的病毒包装信号是否有影响还有待于研究，也畏p p b s 是否能够移 动有待研究。 已知h i v 的5 戳蛆非翻译区对h i v 的逆转录、r n a 的二聚化以及h i v 的包装有重要的 作用和影响【4 。p b s 是离h i v - 1r n a 5 端大约1 8 0 个核苷酸的1 8 个核苷酸序列，它与t r n a l y s 3 末端互补。早期人们研究了突变p b s 位点对病毒复制的影响。h y a n g s h u k 等1 4 2 】设计了几种 不同方式的p b s 突变，分别为删除全部的p b s 序列、删除前面9 个序列、删除后面9 个序列、 删除后面1 2 个序列和用别的碱基序列代替后面9 个核苷酸序列。通过这些突变进一步研究 p b s 中对逆转录所必须的序列。研究发现表明，全部删除p b s 序列和删除p b s 前面9 个序列 的突变体严重影响h i v - 1 的逆转录，面其它三种情况的缺失或突变不会影响其逆转录。同 时，用a i d s 病人血清进行免疫沉淀反应能够检测到在任何一种突变情况下g a g 和e n v 基因都 有表达，表明p b s 的这几种突变不影响病毒蛋白表达或者病毒的包装。n a g a s h u n m u g a m 等 f 4 3 】发现转染含有在第5 个碱基后插a c g 两个碱基的突变p b s 的前病毒d n a 至c d 4 + 细胞，细 胞上清中的病毒颗粒与野生型p b s 的相比较有所下降。同时他们还发现突变的p b s 不能启 动逆转录的开始。 研究发现，h i v - 1r n a 的5 端会形成一定的空间结构。如靠近5 端有四个茎环 浙江理工大学硕士学位论文 ( s t e m 1 0 0 p ) 结构( 如图2 所示) ，这四个茎环结构都对h w - 1 包装起作用，能高效地辅助 包装出病毒颗粒。而对于u 5 区与p b s 区形成的u 5 p b s 区域结构是否对r n a 包装起作用还不 清楚。从这个目的出发研究者们对u 5 p b s 区域进行不同具体位置的突变来研究其对包装的 影响，实验结果发现确实有影响。然而，体外实验又发现s l l 、s l 2 、s l 3 、s l 4 与核壳蛋 白( n c ) 有高亲和力，而u 5 p b s 区则没有这种特性，这说明u 5 p b s 区域结构对病毒包装 的作用机制与s l l 、s l 2 、s l 3 、s l 4 空间茎环结构对病毒包装的作用机制不刚4 4 i 。而这些 突变大多集中在s 。i 、s i i 、s i i i 和s la ( 如图2 所示) 。而有研究则进一步揭示了u 5 p b s 区的u 5 p b s 发卡结构( 如图2 中的s lb ) 在病毒复制和包装中的作用。如n a n c y 等【4 5 】对 u 5 p b s 发卡结构进行稳定或非稳定突变，突变位点是转录因子a p 1 和n f a t a p 3 结合前病 毒d n a 的位置位于u 5 区下游。他们通过测定c a - p 2 4 和t a t 表达量证实，u 5 区下游序列的 突变不会影响病毒基因表达和组装。而u 5 区下游的突变严重影响了h i v - 1 的转录和复制是 因为干扰或破坏了u 5 p b s 发卡结构中u 5 区下游部分序列与p b s 部分序列形成的稳定配对 4 6 1 。至今为止，还没有任何实验证明删除u 5 p b s 发卡结构对包装信号有影响，绝大多数的 研究都建立在保持p b s 存在条件下对p b s 下游的序列和对和包装信号形成稳定二级结构的 u 5 区上游的碱基进行改动。 u 5 一p b s s l 3sl 4 蹙gq c - e g c 一u 专一c 承u 篡钟 埘j u l ，d k g _ a a c 冒i b u u 。二 图2i - i i vr n a5 ，非翻译区空间结构 f i g 2s e c o n d a r ys t r u c t u r eo fh i vr n a5 u n t r a n s l a t i o nr e g i o n 因此，在本课题中，我们对p b s 进行了三种改造包括突变p b s 前面四个碱基、缺失p b s 的1 8 个碱基和缺失u 5 p b s 发卡结构。此后，进行了慢病毒的包装和生产。同时，我们也将 分析p b s 对病毒包装信号的影响。 6 浙江理工大学硕士学位论文 2 实验材料 2 1 生化试剂 常规限制性内切酶、t 4d n a 聚合酶、t 4d n a 连接酶、碱性磷酸酶和d n a 凝胶回收 试剂盒均为m b i 公司产品，k o d - p l u s 酶和t a q 酶均购自t a k a r a 公司，d m e m ( d u l b e c c o s m o d i f i e de a g l e sm e d i u m ) 、f b s ( 胎牛血清) 均购自q i a g e n 公司，c a c l 2 、h e p s 为s i g m a 公司进口分装，其余试剂均为国产或进口分析纯。 2 2l b 培养基 每升l b 培养基含酵母提取物5 9 ，胰蛋白胨l o g ，n a c il o g ，用1 0 m o l 几n a o h 调整 p h 至7 5 ，1 5 磅高压灭菌2 0 m i n ，4 c 保存备用。在每1 0 0 毫升l b 液体培养基中加入1 5 9 琼脂即为固体l b 培养基，1 5 磅高压灭菌2 0 m i n ，4 c 保存备用。 2 3t b 培养基 将下列组分溶解在0 9 l 7 k ：蛋白胨1 2 9 ，酵母提取物2 4 9 ，甘油4 m l 。各组分溶 解后高压灭菌。冷却到6 0 ，再力i1 0 0 m l 灭菌的1 7 0 m m o l lk h 2 p 0 4 0 7 2m o l lk 2 h p 0 4 的 溶液( 2 3 1 9 的k h 2 p 0 4 和1 2 5 4 9 k 2 h p 0 4 溶在足量的水中，使终体积l o o m l 。高压灭菌或 用0 2 弘m 的滤膜过滤除菌) 。 2 4 细胞培养液 每升含谷铵酰胺0 5 8 4 9 ( 两周内用完) ，青霉素0 1 9 ( 一万个单位) ，链霉素0 1 9 ( 一 万个单位) ，n a h c 0 33 3 7 9 ，丙酮酸铵0 1 1 9 ，h e p e s5 9 6 9 ，溶于双蒸水中，用l o m o l l n a o h 调整p h 至7 6 ，0 2 p m 滤膜过滤，4 c 保存备用，血清根据需要临时添加，要求无菌。 2 5 菌株和质粒 e c o l i 菌株d h 5 a 为本组保存备用，e c o l i 菌株s t a b l e 2 、克隆质粒p g k g f p 、包装质 粒p m d 2 g 、p m d l g 、p r r e 和p r s vr e v 均为西班牙n a v a u r a 大学基因治疗研究室钱教授 ? 斯订：疆i ：j = 孕职l ：学仲电j 提供 m a t 体幢_ 柚虹日n 帆嘟 g ，量啊n i 啊唱锄 ， 脑叩时- 岫_ 岫_ h 睥皿“聊 a 啊删，虹佃h 口姗 五【工互口墨盈 日匝e 豇0 名称据咀凳鼍桌潭培井枭件及性质 h e 髓昭f r l l u m a n 衄妇弦k i d n e y 奉实验鲎保存 l f u mh l h n - v h l1 8奉蜜验宣保存 2 7 引翱设计置音成 l ；l 下序列均i h n 衄帕e l m 公元音成 克南哼；物- 0 d m e m + i o 铬 瞒+ n e a a 删1 8 浙江理工大学硕士学位论文 n 0 1 引物( 含印力i 位点) ： 5 盟a t g e c g 册g g t g g a a g t a a g g c c 堑q 堑aa aa 鱼! 坠鱼g a t t t g c c a c a c c q 皿鱼a g q 凹g c t g a a a g c g g a a a g g g a a a c c c c a t c 堑返r aa aa r 几丌g aa r ：r 】_ i t g c c 互g 鲤a a a a q 地( 了r g c t a g a g a r l l t c c 鱼皿q g c c g a a c a g g g a c c t g a a a t g c c g a i r g g t g g a a ( m 气a g g t g g l a c g a t c g t g c c t i = c 鲴阢气g g a g a a c a a c a g a c g g g t c t g a c 灯g g 娜g g a c g a a c c a c t g a a t i g c c g c a i t g c a g a g a n 气t t g l = f 蛔n t a a g t g c c i ：a g c t