（生物化学与分子生物学专业论文）滑菇多糖的制备及其生物学效应.pdf

一奎i ! 奎些奎堂 望蕉童董堕型鱼垦薹圭望堂墼鏖 堡圭耋堡笙壅 摘要 本实验首次探讨了滑菇多糖( p n p ) 的制各工艺路线，及其对荷骨髓瘤b a l b c 小 鼠的抗肿瘤作用。实验结果表明： 1 本实验条件下酶解结合水浸提联合工艺提取滑菇子实体多糖的最佳工艺路线为： 浸提比l ：l o ，纤维素酶( o 0 5 3 n 酶量，p h5 0 ，4 5 ) 酶解6 0 r a i n ，胰蛋白酶( o 0 5 加酶量，p h 8 0 ，2 5 ) 酶解4 5 m i n ，而后8 0 保温搅拌提取9 0 m i n 。结果表明，酶解后 热水浸提阶段并不是提取时间越长越好，一定时间后反而会出现负增长现象：联合工艺 对滑菇多糖的提取率较单纯的酶解或水浸提，提取效率分别提高了3 7 和6 6 ，效果显 著且易纯化，是行之有效的提取多糖的方法。卜7 2 联合工艺提取的滑菇多糖为纤维状灰褐色中性多糖，由d 甘露糖、d 葡萄糖和 d 半乳糖三种单糖组成；经s e v a g 法联合胰蛋白酶去蛋白，超速离心分级得到的滑菇多 糖，成分均一，多糖含量可达9 1 1 。 3 动物实验表明，滑菇多糖能显著提高荷瘤小鼠的存活率：能提高荷瘤或正常小 鼠的机体免疫功能。主要表现为：能有效地促进荷瘤小鼠和正常小鼠脾脏的生长和分化， 增加脾脏的重量；能提高正常小鼠血清中t n f a 的含量，而且能有效降低荷瘤小鼠血清 中的含量水平；能显著抑制荷瘤小鼠血清中i l 6 的含量，但对正常小鼠没影响：能通过 降低肿瘤组织中l d h 的活性而对肿瘤的生长起抑制作用。 关键诃：滑菇多糖分离纯化抗肿瘤免疫增强 p r e p a r a t i o n a n d b i o l o g i c a l e f f e c to f p h o l i o t an e m a k op o l y s a c c h a r i d e a b s t r a c t t h eb e s tp r o c e s sm u t eo fe x t r a c t i o no i lp h o l i o t an e m a k op o l y s a c c h a r i d e ( a n di t s a n t i t u m o ra c t i v i t yo nt u m o r i g e n i cb a l b cm o u s ew e r ef i r s t l ys t u d i e dt h r e er e s u l t ss h o w e d a sf o l | o w ： 1a nu n i t e dm e t h o d ，t h a tw a se x t r a c t i o ni nw a t e ra f t e re n z y m o l y s i s ( c e l l u l a s ea n d t r y p s i n ) ，w a su s e di nt h i ss t u d y a n dt h eb e s te x t r a c t i o nr o u t ew a ss h o w e df o l l o w i n g ：t h e p r o p o r t i o n o fd i g e s t i o n1 ：1 0 ，c e l l u l a s ee n z y m o l y s i s ( 00 5 d o s a g e ，p h5 0 ，4 5 c ) s i x t y m i n u t e s ，t r y p s i ne n z y m o l y s i s ( 0 0 5 d o s a g e ，p h8 0 ，2 5 ) f o u r t y f i v em i n u t e s ，t h e n e x t r a c t i o n k e e p i n g w a r ma n ds t i r r i n g n i n t y m i n u t e s t h es t u d yr e s u l ts h o w e dt h a tt h e e x t r a c t i v e e f f i c i e n c y w a sn o ta 5 g o o d a s p r o l o n g i n ge x t r a c t i v e t i m ei nt h es t a g eo fh o t w a t e r - e x t r a c t i o na f t e re n z y m o l y s i s t h a tw a s t h ee f f i c i e n c yw i l id e c r e a s ea f t e rs o m et i m e 订1 e e x t r a c t i v ee f f i c i e n c yo ft h i su n i t e dm e t h o dw a sb e r e rt h a nt l e p u r ee n z y m o l y s i sa n dp u r e e x t r a c t i o ni nh o tw a t e rw i t hp r o m o t i o no f3 7 a n d6 6 r e s p e c t i v e l y t h ee f f i c i e n c yw a s n o t a b l ea n dp o l y s a c c h a r i d ee x t r a c t e db yt h i sm e t h o dw a se a s yt ob ep u r i f i e d a l lt h e s es h o w e d t h a tt h ee x t r a c t i v er o u t ew a sp r a c t i c a b l ea n de a s y 2p n pe x t r a c t e db yt h i su n i t e dm e t h o dw a sd u s t c o l o u r e da n dn e u t r a lp o l y s a c c h a r i d ea n d w e r e c o m p o s e do fd - m a n n o s e ，d - g l u c o s ea n dd g a l a c t o s e p n pw a s a h o m o g e n e o u s i n g r e d i e n ta f t e rd e p r o t e i n i z a t i o nb ys e v a g m e t h o da n dg r a d e db yu l t r a c e n t r i f u g a t i o n i t ss u g a r c o n t e n tw a su pt o9 1l 3 t h ea n i m a le x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e d 出a t ：p n pc o u l d p r o m o t et h el i v a b i l i t yo f t u m o r i g e n i cm o u s e ；c o u l da c c e l e r a t et h eg r o w t ha n dd i f f e r e n t i a t i o na n dp u to nw e i g h to f s p l e e n ；c o u l di n c r e a s et h ec o n t e n to f l n f qi nn o r m a lm o u s e s e r u ma n dd e c r e a s et h ec o n t e n t o ft u m o r i g e n i cm o u s e b yd i f f e r e n tp a t h w a y sp r o b a b l y ；a n dc o u l dd e c r e a s et h ec o n t e n to fi l - 6 i nt u m o r i g e n i cm o u s e s e r u m ，b u th a dn oe f f e c t i o no nn o r m a lm o u s ei na d d i t i o n ，p n pc o u l d i n h i b i t et h eg r o w t ho f t u m o r b yd e c r e a s et h ea c t i v i t yo f l d h i nt u m o r - o r g a n i z a t i o n i na l l ，p n pc o u l de n h a n c et h ei m m u n i t y s y s t e r m o f t u m o r i g e n t i co rn o r m a lm o u s e s k e yw o r d ：p h o l i o t an a m e k op o l y s a c c h a r i d e s e p a r a t i o n a n d d e p u t a t i o n a n t i t u m o r i m m u n o l o g i c a l l ye n h a n c i n ge f f e c t p o s t g r a d u a t e ：s o n gy u g u a n g m a j o r ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rl iq i n g z h a n g 2 奎! ! 奎些奎耋 塑童垒董墼l ! 查星壅耋望耋墼鏖 一：堡圭堂堡! 垒；生 1 前言 1 1 食药用菌多糖的国内外研究现状 1 9 3 0 年德国人首先发现担子菌有抑瘤活性，1 9 7 0 年g o r o c h i h a r a 从香菇子实体中浸 提出6 种香菇多糖，并证明其中一种具有明显的抗肿瘤作用t 定名为l e n t i n a n ( l n t ) 。 从此各国学者开始了从食用菌中寻找抗肿瘤药物的研究。到目前为止，已有3 0 0 多种多 糖类化合物被分离提取出来( 田庚元，1 9 9 5 ) ，且已发现有1 0 0 多种真菌具有显著的抑瘤 活性和免疫促进作用( 闵三弟，1 9 9 6 ) 。国内从8 0 年代开始对食用菌多糖的分离、纯化、 性质鉴定与药理作用进行了研究，虽起步较晚，但在研究多糖类的作用机理时，紧密与 中医药理论相结合，发展速度很快，至今已从高等担子菌中筛选出2 0 0 多种有生物活性 的多糖类物质，发现有价值的真菌多糖约3 0 种，其中化学成分和化学结构较清楚的有 15 种尤以香菇多糖研究最为透彻( 郑德霖，1 9 9 4 ) 。 国际上，食药用菌多糖被称为“生物应答效应物”( b i o l o g i c a lr e s p o n s em o d i f i e r ， b r m ) ，它是一种能够增强机体免疫功能的生物活性物质。随着生物工程、生物高分子 研究新技术、新方法在科研实验中的应用，国内外对食药用菌多糖及其复合物的研究迅 速发展。目前，食药用菌多糖己成为分子生物学、医学、食品科学等领域的研究热点之 一( 杜巍，2 0 0 1 ) 。 1 1 1 食药用茵多糖的分离和纯化 食药用菌多糖的分离、纯化和鉴定方法与其它多糖基本相同，即利用多糖溶于水或 酸、碱、盐溶液而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂的特点，从不同材料中进行提取。提 取时一般先将原材料物质脱脂及脱游离色素，然后用水( 冷或热水) 、稀酸、稀碱或稀盐 溶液进行提取，提取液经浓缩后以等体积或数倍体积的甲醇或乙醇、丙酮等沉淀析出， 所获得的粗多糖再经反复溶解和醇析得以纯化( 梁忠岩，1 9 8 3 ) 。 国内对多糖的提取原以初级的发酵法、热水浸提法、酸碱浸提法和盐析法为主，这 些方法的得率低、能耗大，存在一定的技术缺陷。如热水浸提法时间长、效率低，且长 时间的高温提取容易破坏其糖苷键，降低生物活性：酸碱法条件剧烈，提取后溶液需中 和，程序烦琐，又极易破坏多糖的立体结构及活性，且酸碱对设备的腐蚀性很大。碱法 提取的粗多糖含量虽较为可观，但提取后溶液的粘度较大，多糖不易被分离出来，纯化 率较低；盐析法虽生产成本低，但盐析所需的时间过长，仍不理想。为以产业化生产为 目的，建立省时、经济、高效、简单、易行的多糖提取方法，研究人员进行了大量的实 验研究，认为酶法结合热水浸提的联合工艺是较为理想的提取食用菌多糖的方法。涂国 云等( 1 9 9 8 ) 的研究表明，采用复合酶系( 由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶按一定比例组 成) 提取竹荪糖类物质，具有条件温和、杂质易除、提取得率高和生理活性强等优点， 能显著提高多糖和寡糖的提取率。陈哲建等( 1 9 9 6 ) 研究结果显示酶解法大大提高了对 有效成分的提取效果，总氨基酸和必需氨基酸的含量提高了2 倍以上，多糖含量提高了 墨至垄 垦重= = = = = = = ：= = = = = = = = = = = = 兰型丝里 近4 倍。张欣( 1 9 9 5 ) 、李惠珍等( 1 9 9 8 ) 的对比实验结果也证实复合酶提取食用菌多糖 具有事半功倍的功效。 此外，田光辉等( 2 0 0 0 ) 用低沸点的乙醚、甲醇对灵芝子实体回流提取，能破坏细 胞壁膜，使多糖裸露出来，再用稀碱溶液( 1 的碳酸钠水溶液) 浸提灵芝子实体多糖， 收到了较好的效果。沈萍萍等( 1 9 9 6 ) 比较了经超声波处理后的菌丝与不经处理的菌丝 的多糖得率，发现前者高于后者，说明在提取菌丝胞内多糖时，破壁处理很有必要。廖 周坤( 1 9 9 8 ) 采用超临界c 0 2 萃取( c 0 2 - - s f e ) 的方法对藏药雷灵芝中的多糖提取进 行了尝试，多糖收率达20 6 ，为传统萃取工艺( 1 2 7 ) 的1 6 2 倍。虽然仅使用c 0 2 s f e 这种方法一步完成植物药的单体分离一股不可能实现，但它有可能创造一般溶剂 达不到的萃取条件大幅度改善所欲提取成分的收率，为食药用菌多糖的提取开辟了新 路。 粗多糖中往往混杂着蛋自质、色素、低聚糖等杂质。一般用来去除蛋白质的方法有： ( 1 ) s e v a g 法( 方积年，1 9 8 4 ) ，即根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用氯 仿：戊醇( 或正丁醇) 5 ：1 或4 ：1 混合，剧烈振摇2 0 到3 0 分钟，蛋白质与氯仿一戊 醇( 或正丁醇) 生成凝胶物而分离，离心分去水层交界处的变性蛋白质。此种方法在避 免降解上有较好效果，但效率不高如能配合加入一些蛋白质水解酶，再用s e v a g 法效 果更佳。( 2 ) 三氟三氯乙烷法，即多糖溶液：三氟三氯乙烷l ：1 加入，在低温下搅拌 1 0 分钟，离心得上层水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液。 此法效率商，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量使用。( 3 ) 三氯醋酸法，在多糖溶液 中滴加3 三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊为止，在5 - i o 。c 放置过夜，离心除去沉淀 即得无蛋白质的多糖溶液。此法会引起某些多糖的降解。以上三种方法均不适合于糖肽， 因糖肽也会象蛋白质那样沉淀出来。对于碱稳定的糖蛋自，在硼氢化钾存在下，用稀碱 温和处理，可以把这种结合蛋白质分开。 对于植物来源的多糖，可能含有酚类化合物而颜色较深，可用弱碱性树脂d e a e 纤 维素或d u o l i t ea 7 来吸附色素，也可进行氧化脱色。一般情况下，尽量避免用活性炭处 理，因活性炭会吸附多糖，造成多糖损失。对于低聚糖小分子杂质，可通过逆向流水透 析除去，得到多糖的半精品。 纯化多糖的方法很多，主要有：( 1 ) 分步沉淀法，常用的沉淀剂有甲醇、乙醇和丙 酮：( 2 ) 季胺盐沉淀法，季胺盐常用十六烷基三甲基铵溴化物( c t a b ) 及其碱( c t a o h ) 和十六烷基吡啶( c p c ) ：( 3 ) 盐析法，常用硫酸铵、氯化钠、氯化钾等作为盐析剂：( 4 ) 拄层析，主要有纤维素柱层析、纤维素阴离子交换柱层析、亲和层析和高压液相层析几 种：( 5 ) 金属络合物法，常使用的络合剂有费林试剂、氯化铜、醋酸铅；( 6 ) 其它层析 柠，用活性炭及硅胶作载体的柱层析来分离多糖，或用硼砂型的离子交换树脂分离中性 多糖；( 7 ) 制各性区域电泳，载体通常是玻璃粉( 盛家荣，1 9 9 9 ) ；( 8 ) 超过滤法，多糖 溶液通过各种已知的超过滤膜就能达到分离的目的，该方法不但多糖回收率高，而且产 品纯度也高( 郑宗坤，2 0 0 0 ) ：( 9 ) 超速离心，一定条件下的超速离心操作，可按分子大 小将多糖样品分级分离。 1 1 2 食药用菌多糖的理化性质研究及结构分析 多糖物理化学性质的研究内容主要是多糖纯度的鉴定、糖含量的测定、相对分子量 的测定、单糖组成以及结构分析等，此外还包括多糖物理形状的描述，溶解性实验等。 多糖纯度鉴定主要有4 种方法：比旋度法、超离心法、高压电泳法和凝胶过滤法。目前 最常用的是第四种方法，具有速度快、分辨率高和重现性好等优点。 多糖样品中多糖含量的测定方法很多，一般可根据多糖性质的差异及实际需要而选 用不同的测定方法。如3 ，5 - 二硝基水杨酸( d n s ) 比色法是半定量定糖法，操作简便、 陕速，杂质干扰较少，适合于批量测定；苯酚一硫酸法简单、快速、灵敏、颜色持久，适 寅于凝胶部分收集样品中相对糖量的分析，多用于测定单糖和多糖的含量；蒽酮- 硫酸法 t j ，用于多糖、单糖含量测定等等。此外，商澎等( 2 0 0 0 ) 参考改良苯酚硫酸法，改用酶 联免疫测定仪进行比色测定，建立了快速测定多搪组成的方法。 多糖的分子量分布一般比较分散，通常所指的分子量是大小分子的平均数，即平均 分子量。常用于测定分子量的方法有渗透压法、蒸气压渗透计法、端基法、光散射法、 粘度法、高效液相色谱法、超滤法、超离心法和凝胶过滤法。其中，超离心法测定分子 量，由于设备和操作等原因，目前在多糖分子量测定中应用不多。 经完全酸水解的多糖样品经中和浓缩后可用薄层色谱分析其单糖组成，分离糖的薄 层色谱有硅胶色谱、纤维素色谱、硅藻土色谱及氧化铝色谱等多种。真菌多糖因种类不 同、提取方法不同而组成各异，但大多数是由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯 糖等几种单糖组成。 多糖的生物大分子结构比蛋白质更为复杂，这不仅因为组成多糖的单糖品种繁多 ( 目前已知的单糖有2 0 0 多种) ，而且既使只由一种单糖组成的多糖因其连接方式的不周 以及可能有支链( 蛋白质支链少) 使多糖的结构鉴定非常困难。多糖的结构鉴定方法较 多，主要分为化学分析法、物理分析法和生物分析法3 大类。一般来讲，单一的一种方 法很难确定多糖的空间结构，只有将各种方法彼此结合起来才能完成多糖结构的分析。 化学分析法包括酸水解、甲基化、过碘酸及其盐的氧化、s m i t h 降解、碱降解、酶水解 及免疫化学技术；物理分析法主要是利用红外光谱法( i r ) 、质谱法( m s ) 、气相色谱一 质谱联合法( g c - m s ) 、核磁共振( n m r ) 以及毛细管电泳( c e ) 等技术进行结构分析。 值得一提的是毛细管电泳( c e ) 是近几年发展起来的一种糖类分析方法，它以快速、高 效、高分辨率和样品用量少等优点，越来越受到糖化学家们的重视；生物学方法主要是 酶学方法，也就是利用各种特异性糖苷酶水解多糖分子得到寡糖片段，再与其它定性、 定量方法联用推测多糖结构的方法。目前较为先进的酶学方法是试剂阵列分析法 ( r a a m ) ，即用一系列特定的外切糖苷酶的混合物对多糖或寡糖进行酶解，将酶解所 得的片段分离，并通过其流体动力学体积与计算机数据库中的数据进行比较，从而大大 提高了多糖结构分析的速度和精度( 鞠海，2 0 0 0 ) 。 大量关于多糖构效关系的研究表明食药用菌多糖中的活性成分是具有分枝的b ( 】_ 3 ) _ d 葡聚糖这些活性多糖成分具有个共同的结构，即主链由b ( 1 3 ) 连接的 墨至些 ：i ! i ：= = = = = = = = 皇些；二皇 葡萄糖基组成，沿着主链随机分布着由b 一( 1 - 6 ) 连接的葡萄糖基，呈梳状结构。生物 活性的大小随多糖的精细结构和构象不同而变化。此外，多糖分子量的大小及侧链基团 的性质也是影响其生物活性的重要因素。一些研究结果表明，只有分子量大于9 1 0 4 的分子才能形成高度有序结构( 三股螺旋) ，这对于免疫调节活性至关重要( 王淼，1 9 9 7 ) 。 1 1 3 食药用菌多糖的生物学活性 近代，人们对真菌多糖类药物能阻止癌细胞生长颇为重视，从药理和临床、处方剂 量、剂型、生物利用度、稳定性等方面开展了深入研究。经国内外大量实践研究表明， 菌类多糖的抑瘤机理是通过提高机体免疫的抗病能力、抑制癌细胞的生长和扩大，而菲 亩接杀伤杀死癌细胞。目前己在国内外临床上应用的主要有3 种多糖：香菇多糖、云芝 多糖及裂褶多糖。特别是香菇多糖，具有组分单一、质量稳定、疗效好、毒副作用小等 特点，应用很为广泛。 香菇多糖( l n t ) 抗肿瘤作用需要t 细胞的参与，对于不同肿瘤、不同动物的t 细 胞反应不尽相同。s u z u k i ( 1 9 9 4 ) 等研究表明，l n t 可使f b l 3 b d f l 鼠或与白细胞介 襄2 ( i l 2 ) 联用使d b a l 2 m c c s 鼠的肿瘤退化，并延长存活期；与1 l 2 联用对m b l 一2 ，b 6 鼠的抗癌作用是通过c d s + 细胞毒性t 淋巴细胞介导的。t a l l i 等( 1 9 9 3 ) 检测肿瘤患者 外周血中i l 2 和或香菇多糖刺激后淋巴因子活化的杀伤细胞( l a k ) 的活性，结果显 示i l 2 和香菇多糖联台应用后l a k 抗自发性肿瘤和k 5 6 2 细胞的活性较i l 2 单独组强。 此外，l n t 能增加小鼠脾脏的重量，脾滤泡生长中心扩大而出现大量浆细胞，说明其促 进b 细胞增生并转化为浆细胞，抗体生成增加，起到体液免疫增强作用。同时l n t 可 拮抗化疗药物对脾细胞的抑制。如在环磷酰胺化疗前给予香菇多糖7 天，脾细胞总数和 自然杀伤细胞( n k ) 、l a k 细胞活性均较环磷酰胺单独治疗组高( y a n 2z b ，1 9 9 4 ) 。 灵芝多糖( g l p ) 系灵芝的主要有效成分。以往实验( 林志彬，1 9 9 1 ，1 9 9 2 ) 证实 g i p 具有免疫增强和抗肿瘤作用，它能增强小鼠腹腔巨噬细胞( m m ) 的吞噬功能和脾 细胞d n a 多聚酶a 的活性，促进小鼠混合淋巴细胞培养反应，并能促进腹腔m 中和脾 细胞分泌细胞因子等。陈书明等( 1 9 9 7 ) 给小鼠口服灵芝多糖后发现，g l p 能显著提高 小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬能力，增强体液免疫和细胞免疫功能，并能提高红细胞中超氧 化物歧化酶( s o d ) 的活性。但齐藤等( 1 9 9 1 ) 却观察到口服给药对移植肉瘤1 8 0 几乎 没有抗肿瘤活性。为进一步研究灵芝多糖的作用机理，李春明等( 2 0 0 0 ) 观察了灵芝多 糖( g l p 7 ) 在体外对小鼠腹腔巨噬细胞蛋白激酶c ( p k c ) 活性的影响，结果表明g l p 7 4 0m 叽) 能引起p k c 活性明显升高，3 0 m i n 达峰值，2 h 恢复到基础水平；另外，g l p ， 能浓度依赖性诱发自细胞介素1 ( i l 1 ) 和肿瘤坏死因子o ( t n f n ) m r n a 的表达， 说明g l p 7 免疫增强和抗肿瘤作用的基础与其在转录水平诱发i l 1 和t n f qm r n a 的 表达有关。王庆彪等( 1 9 9 8 ) 发现i l - 2 和i l 3m r n a 表达水平随着g l p ，浓度的升高而 相应提高，提示灵芝多糖的免疫增强作用与其在转录水平上促进i l 、2 和i l 一3m r n a 的 表达也育关。 银耳俗称白木耳，是一种高等真菌。近1 0 年来，国内外对银耳的主要成分银 耳多糖( t p ) 研究较多，认为t p 能全面提高机体免疫能力，表现在能增强单核巨噬细 胞系统的功能，增强体液免疫功能和细胞免疫功能，还可增加免疫器官的重量( 杨世海， 1 9 9 3 ：郑仕中，1 9 9 3 ) 。马莉等( 1 9 9 2 ) 对其免疫增强机制进行了进一步研究，结果提示 t p 能促进正常小鼠和老年小鼠脾细胞i l 2 的产生，可显著减轻氢化可的松或环孢素a 删小鼠脾细胞i l 2 产生的抑制。崔金莺等( 1 9 9 5 ) 研究发现t p 可促进c o n a ( 刀豆素a ) 促诱导的小鼠脾细胞培养上清液中i l 2 的活性，证明t p 可使t h 细胞活化并分泌i l - 2 。 郑仕中等( 1 9 9 2 ，1 9 9 3 ，1 9 9 4 ) 就银耳孢子多糖( t s p ) 和银耳制剂( t f b ) 对荷瘤小 鼠和受照射荷瘤小鼠免疫功能的影响进行了一系列的研究，结果表明，t s p 和t f b 可明 显提高荷瘤小鼠免疫功能，对照射荷瘤小鼠免疫功能具有明显的保护作用。表现在用药 后脾重、脾有核细胞数明显增加，胸腺细胞自发增殖率增高，增强直接杀伤肿瘤细胞的 n k 细胞活性，并促进脾细胞产生i l 2 。 此外，茯苓异多糖对肉瘤i 8 0 的抑制率可达9 68 ；裂褶菌多糖在剂量为 1 2 5 5 m 鐾，k g 时，对肉瘤3 7 的抑制率为8 7 ，剂量为o 7 m g k g 时对y o s h i d a 实体瘤抑 制率为7 4 ：针裂蹄多糖抑制小鼠肉瘤1 8 0 ，抑瘤率为5 2 ( 沈萍萍，1 9 9 1 ) ；冬虫夏草 多糖成分能增强单核巨噬细胞功能，提高血清l g g 水平，促进淋巴母细胞转化，对小鼠 芟氏腹水瘤具有明显的抑制作用，但也有报道说该多糖对小鼠接种肉瘤1 8 0 的生长抑制 较弱( 李连德，2 0 0 0 ) ：腹腔注射黑木耳多糖可增加小鼠脾重量，使脾指数显著增加，还 可增加巨噬细胞的吞噬百分数和吞噬指数及e 玫瑰花结形成率，表明黑木耳多糖具有促 进淋巴细胞转化的功能( 郭春沅，2 0 0 0 ) 。 影响多糖生物活性的因素很多，立体构型是多糖生物活性的决定因素。据y o s h i a k i s o l l e 等( 1 9 8 5 ) 研究，用不同方法提取得到的灵芝子实体多糖的抗肿瘤活性与多糖的分 枝度有一定关系。用热水、冷碱和热碱提取的灵芝多糖对肉瘤s - 1 8 0 的抑制率分别为 9 7s 、5 96 和1 0 9 。用热水提取的灵芝水溶性多糖具有显著的抗肿瘤活性，与其具 有非常高的分枝度有关。除此之外，多糖的分子量、取代基、溶解度、粘度，甚至给药 刺最、给药途径、作用时间等也能影响其生物活性。一般中等分子量多糖的活性大于高 分子量及低分子量的多糖( 田庚元，1 9 9 9 ) 。经大量实验证实，多糖的侧链基团与其生物 活性密切相关。对于具有螺旋结构的多糖来说，一方面侧链可以使螺旋结构更加稳定， 另方面分布于螺旋结构周围的亲水基对维持多糖的生物活性极其重要。通过磺酰化、 硫酸化、磷酸化或甲基化等化学修饰方法可以提高多糖的水溶性，有利于增强其活性。 采用酸碱水解、酶解及超声波破碎等方法降低多糖分子量，也可以提高其水溶性，降低 分子粘度，获得临床上可以应用的分子片段。而且，多糖的活性也与给药剂量有关；剂 量太小达不到刺激免疫作用，太大则引起免疫麻痹。所以各种多糖均有一个最适剂量范 围。如香菇多糖的最适剂量是1 - 2 m g k g ，过量的香菇多糖不但不会增加作用反而会减少 作用( 袁静，1 9 9 9 ) 。同一来源的多糖也可能由于给药途径的不同而发挥不同效应的生物 活h ，大多数1 3 葡聚糖经腹腔、静脉或瘤内给药发挥作用，而口服给药效果各异。如口 服姬松菇子实体多糖具有显著的抑瘤效应( 黄年来，1 9 9 4 ) ，而口服灵芝提取物几乎没有 抗肿瘤活性( 齐藤，1 9 9 1 ) 。当然，这与肿瘤生长程度有关，如y a m a g u c h i ( 1 9 9 0 ) 研究 篓皇i ：= 一= = 坠鱼= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 兰兰兰兰 结果发现，给药组小鼠在接种1 1 0 4 淋巴瘤细胞，口服冬虫夏草多糖5 0 m l g ，k g 可使肿瘤 缩小，宿主生存期延长；援种i 1 0 5 淋巴瘤细胞的小鼠，在相同剂量时口服效果则较差。 从香菇多糖对肉瘤1 8 0 抑瘤作用的动物实验中观察到香菇多糖对瘤细胞的作用不像一般 化疗药物那样给药5 天左右即有作用，而是一般要给药2 周才能逐步发挥作用( l a p i s k ， 1 9 8 9 ) 。此外，多糖对不同种属动物、不同瘤株的抗肿瘤作用也各不相同。总之，多糖类 药物只有选择适当的肿瘤模型，在最适剂量和最佳给药时间才会表现出明显活性a 综上所述，目前食药用菌多糖的研究，大多偏重于提取、分离、精制、化学组成和 免疫药理、生化药理、抗肿瘤药理等研究。尽管已有商品化产品，但积累的临床资料仍 鼬央乏，大部分仍处于实验阶段。食药用菌多糖的研究方兴未艾，作用机制越来越清晰， 相信高效低毒的多糖能为肿瘤及其它疾病的治疗带来新的希望。i i i v 1 2 肿瘤的免疫治疗 肿瘤的免疫治疗法是指人为地增强机体本来就有的防御功能，以抑制或杀伤肿瘤细 胞。具体包括：1 外源给予免疫刺激剂，以增强和恢复机体抗肿瘤效应细胞及细胞因子 的功能；2 直接给予免疫效应细胞以增强机体的防御能力；3 通过各种手段，增强肿 瘤细胞对机体抗肿瘤效应的敏感性；4 抑制肿瘤细胞转化及促进恶性细胞分化；5 增 强患者对肿瘤治疗所致损伤的耐受性，恢复因放疗或化疗导致的免疫抑制( 高美华， 1 9 9 9 ) 。 尽管肿瘤的免疫治疗已有1 0 0 多年的历史，但只是在近2 0 年才有了快速发展，尤 其是细胞工程及基因工程等技术的发展，给肿瘤免疫治疗研究带来了转机。过去肿瘤免 疫冶疗的主要进展为免疫抑制剂的使用，这使变态反应性疾病的治疗和对器官移植排斥 反j 壹的控制向前迈进了一大步。今后免疫治疗的重大课题之一是如何将这种治疗应用于 恶眭肿瘤的防治。为此，研究的重点似应由免疫抑制转到免疫增强方面。寻找适宜的免 疫佐剂，强化细胞免疫而不强化体液免疫，即成为当前肿瘤免疫治疗研究的重点之一( 南 京i 丢学院，1 9 8 2 ) 。 1 2 1 肿瘤免疫治疗的一般原则 ( 1 ) 该肿瘤必须有较强的抗原性。动物实验证明，并非所有诱发的肿瘤都有免疫原 陡。人类肿瘤大致亦如此。只有那些有较强免疫原性的肿瘤，免疫疗法可望收到较好的 效果。已经证明，在人类肿瘤中，如恶性黑色素瘤、白血病、神经母细胞瘤等可引起机 体的免疫反应。 ( 2 ) 只有当体内的肿瘤细胞数量减少到一定水平时，免疫治疗才能产生较明显的 效果。这就必须分别采用手术切除、放疗、化疗的手段，首先消除绝大部分肿瘤，再用 免疫疗法根除小量的残存瘤细胞。免疫治疗只应作为恶性肿瘤综合治疗中的一种辅助手 段，单独使用往往无效甚至有害。 ( 3 ) 机体必须具备免疫反应性。对反应低下的病人实行免疫治疗，尤其是主动免 疫治疗，将是无效的。造成免疫反应低下可能有各种原因，其中最主要的是肿瘤本身。 至些奎些奎耋塑垄童堡墼型鱼垒基圭塑堂垫皇 望圭堂堡婆壅 很多研究证明，恶性肿瘤( 尤其是中、晚期) 病人的免疫反应性显著低下。 ( 4 ) 采用各种手段进行综合治疗。 1 2 2 肿瘤免疫治疗的方法 肿瘤生物治疗的种类及方法较多，而免疫治疗是其核心，主要包括特异性主动免疫 治疗、免疫导向治疗、细胞因子治疗、免疫细胞的过继治疗、基因治疗和中草药治疗等 l j 大类。 i2 2i肿瘤特异性主动免疫治疗 应用疫苗( 由处理过的自体肿瘤、培养的肿瘤细胞或异体肿瘤制成) 或基因工程疫 苗进行免疫接种，可激发或增强患者的特异性抗肿瘤免疫应答，阻止肿瘤生长、扩散和 复发。这称为肿瘤特异性主动免疫治疗( s p e c i f i c a c t i v ei m m t m o t h e r a p y ，s a i t ) ( 龚非力， 2 0 0 0 ) 。 l 二22 基于抗体的靶向治疗 肿瘤导向治疗是利用有一定特异性的载体，把药物或其它杀伤肿瘤细胞的活性物质 选择性地运送到肿瘤部位以提高疗效的种治疗途径与方法( 韩锐，1 9 9 7 ) 。肿瘤特异性 或相关抗原、独特型决定簇、某些细胞因子受体、肿瘤多药耐药分子、激素及某些癌基 因产物等，均可怍为肿瘤特异性或相关靶分子。针对这些靶分子的抗体是药物、毒素、 放射性核素、酶或其它效应分子的良好载体，可用于疾病的导向治疗( 龚非力，2 0 0 0 ) 。 抗瘤抗体介导的靶向疗法，主要包括抗体药物偶合物导向治疗：特异性单克隆抗 体( m c a b ) 与多种抗瘤化学药物交联。免疫毒素( i r n m u n o t o x i n ) 导向治疗：m c a b 与毒素交联而成的偶联物称为免疫毒素，可发挥特异性杀伤肿瘤细胞效应。抗体核素 偶联物导向治疗：其原理与免疫毒素相似，但发挥杀瘤作用的是核素。双功能抗体导 向治疗：双功能抗体具有两个不同特异性的f a b 段，可分别结合瘤细胞- 效应细胞或瘤细 胞一效应分子，使效应细胞或效应分子靶向性集中于肿瘤灶。抗体超抗原偶联物或其 融合蛋白导向治疗：以单抗作为导向分子，借助超抗原具有强的激活t 细胞能力，主要 通过产生大量细胞因子而发挥强有力的杀瘤作用。抗体导向酶解前药治疗：所谓前药 是指该药原型并无治疗活性或活性较低，须在体内经过代谢，转化为活性型才显示药效。 将m c a b 与特定的前药活化酶交联，借助抗体将酶带到靶部位；同时给予经化学修饰的 前体药，后者在靶部位被活化为具有细胞毒性的药物。该疗法可增强药物的选择性杀伤 作用，而降低全身毒性，被称为抗体导向酶解前药治疗。以血管为靶的抗体导向治疗： 恶性肿瘤的发生、发展和转移与肿瘤的新生血管形成密切相关。通过抑制与新生血管形 成有关的分子( 如血管生成素) ，或阻断促血管内皮细胞生长的分子( 如成纤维细胞生长 因子、血管内皮细胞生成因子等) ，均可抑制某些肿瘤的生长和转移。放射免疫导向手 术治疗：这是由放射免疫显像衍生而来的疗法，术中以手握式y 探测仪检测放射性以判 断肿瘤浸润及转移范围，从而指导手术清除肿瘤灶。在手术视野中用放射计数探头代替 9 外用y 射线照相机检出含核素的病灶，其优点是：术中可发现某些目测或触诊不能确定 的转移或隐性癌灶，有利于准确而彻底地切除之；有利于术中即时判断肿瘤发展的临床 明，以便决定手术方案。 12 23 细胞因子治疗 多种细胞因子具有直接或间接的杀瘤效应。因此，肿瘤的细胞因子疗法成为生物治 疗的主要方案之一。 外源性细胞因子治疗：将具有抗瘤活性的细胞因子通过一定途径直接注入荷瘤机 体，可取得一定的抗瘤效果。目前临床上己应用i l 2 、c s f ( 集落刺激因子) 、1 f n ( 干 扰素) 和t n f q 等治疗肿瘤。 细胞因子导向治疗：细胞因子与毒素、放射性核素或化疗药物偶联后制成“生物 导弹”，可定向聚集于表达有响应细胞因子受体的肿瘤细胞，从而发挥有效的杀瘤作用。 近年来，将i l 一2 、i l 4 、i l 6 、f g f ( 成纤维细胞生长因子) 等细胞因子的基因与假单胞 外毒素基因在体外重组，所获得的融合蛋白产物可杀伤表达细胞因子受体的肿瘤细胞。 细胞因子基因治疗：将细胞因子基因直接导入肿瘤细胞中，使肿瘤细胞自行分泌 细胞因子，以发挥杀瘤效应。目前己将i l 2 、i l - 4 、i l ，6 、i l 一7 、i f n y 、t n f 一、g m c s f ( 粒单系集落刺激因子) 、g c s f ( 粒系集落刺激因子) 等基因转移至肿瘤细胞中，表达 细胞因子的肿瘤细胞可促使机体的抗瘤免疫效应，其机制为：增强肿瘤抗原的免疫原性： 诱导肿瘤细胞表达某些粘附分子或主要组织相容性复合体( m h c ) 分子，促进肿瘤特异 性效应细胞的识别和激活。另外，亦可在体外将细胞因子基因导入免疫效应细胞，过继 输注后可增强机体的抗瘤免疫效应。 2 2 4 过继性细胞免疫治疗 肿瘤的过继性细胞免疫治疗是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接 杀伤肿瘤或激发机体抗瘤免疫效应，从而达到治疗肿瘤的目的。自1 9 8 5 年r o s e n b e r g 等 采用i l 2 激活的淋巴细胞，即l a k 细胞的表达免疫治疗以来，相继对l a k ( 淋巴因子 活化的杀伤细胞) 、c t l ( 细胞毒性t 淋巴细胞) 、t i l ( 肿瘤浸润淋巴细胞) 、n k ( 自 然杀伤细胞) 和m 巾( 巨噬细胞) 的实验和临床治疗进行了深入研究( 孙靖中，1 9 9 8 ： 龚非力，2 0 0 0 ) ，目前治疗肿瘤的免疫活性细胞有：淋巴因子活化的杀伤细胞( l a k ) ， 转输l a k 细胞是目前国内临床上应用最为广泛的肿瘤过继免疫疗法。其与手术、化疗 或放疗联合应用，或作为上述疗法后的辅助疗法，有助于清除术后残留的瘤细胞，并改 善晚期肿瘤患者生存质量。肿瘤浸润淋巴细胞( t i l ) ，t i l 是由肿瘤灶分离出的浸润 的淋巴细胞，经体外扩增培养后转输给同一肿瘤患者，可显示比l a k 细胞更强的杀瘤 效应。其它细胞过继免疫治疗方法，转输n k 细胞、mm 和c t l 也取得一定抗瘤效应， 尤其是c d 3 + n k 细胞具有比l a k 细胞和t i l 更强的体外扩增能力和体内外抗瘤效应。 导入细胞因子基因的细胞过继免疫治疗，多种细胞因子( 如i l 2 、t n f 、i f n 、c s f 等) 可显著抑制肿瘤生长，但全身大剂量应用这些细胞因子常产生严重的毒副作用，从 一奎i ! 奎些奎耋 堡壅垒堡笪型鱼垦苎圭望兰垫蜜一= ：= ：垦垒塑塑i ；墨- 而影响其疗效。人们尝试将细胞因子基因导入效应细胞中表达，然后进行过继治疗，有 可能使效应细胞聚集在肿瘤灶局部并高水平表达导入的细胞因子，直接或间接发挥杀瘤 效应，从而减轻细胞因子的全身毒性反应。 1225 基因治疗 基因治疗主要是将外源性的基因导入人体，最终达到直接或间接( 通过增强机体免 疫功能) 抑制或杀伤肿瘤细胞的治疗方法。恶性肿瘤的基因治疗虽然起步较晚，但进展 非常迅速，其治疗方法主要包括以下几种：细胞因子基因治疗，其原理是将细胞因子 基因导入体内使之充分发挥免疫调节作用，通过直接抑* f i l l 十瘤细胞生长或间接激活抗肿 瘤免疫功能等机制达到抗肿瘤目的。目前已涉及基因治疗的细胞因子包括白细胞介素、 千扰素、肿瘤坏死因子等几乎所有系列的细胞因子。增加肿瘤细胞免疫原性的基因治 疗，将m h c 或某些细胞表面辅助分子基因( 如b 7 ) 转入肿瘤细胞，可使其免疫原性增 强，从而有效地激活肿瘤特异性免疫应答以杀伤肿瘤细胞。“自杀”基因治疗，即向 肿瘤细胞内导入药物敏感基因。抑癌基因及癌基因反义物基因治疗，将抑癌基因p 5 3 、 r b 等导入肿瘤细胞后可显著抑制肿瘤生长：将某些癌基因( 如r a s ) 的反义寡核苷酸导 八肿瘤细胞，反义r n a 可与癌基因的靶序列结合，封闭癌基因活化，从而特异地抑制 肿瘤细胞的增殖。造血干细胞基因治疗，除可介导具有促造血功能的细胞因子( 如c s f ) 基因治疗外，还可将多耐药基因m d r 转导入该类细胞，以保护其免受放、化疗损伤， 增加放、化疗强度，并加速造血功能重建。随着目的基因的不断开发、基因表达载体的 不断改进、基因转染及细胞移植技术的不断优化，恶性肿瘤基因治疗这种全新的疗法将 取得更大突破。 2 2 6 中草药治疗 许多中草药，如人参、黄芪、女贞子等具有增强机体免疫力和抗肿瘤的效应，己得 到实验研究的证实，并在临床应用中取得了疗效。在天然植物和药材中寻找和发现新的 生物反应调节因子，己越来越受到世界许多国家的重视，尤其是美国和日本。大量研究 表明，中草药免疫调节剂对机体的作用，主要通过以下几种途径：激活巨噬细胞和t ， b 淋巴细胞；激活网状内皮系统和补体；诱生多种细胞因子。如陈毓强( 1 9 9 7 ) 报 道的微藻多糖、马雷多糖、草钟乳多糖和蛇头草多糖对肿瘤和肝癌均有明显的抑制作用。 防风多糖j b o 一6 通过改善荷瘤小鼠胸腺、脾t 细胞及b 细胞增殖，改善荷瘤小鼠腹腔巨 噬细胞的吞噬作用和细胞毒作用及n k 细胞的活性而发挥抗瘤作用，对s 1 8 0 肉瘤的抑 瘤率可达6 9 1 ( 张丽，1 9 9 7 ) 。对牛膝多耱药效学的研究表明，牛膝多糖能升高血清溶 血泰和脾脏内抗体形成细胞数，提高血清免疫球蛋白i g g ( 免疫球蛋白g ) 水平和n o 的产生及n o s ( 一氧化氮合成酶) 的活性，能激活巨噬细胞，促进t n f 和i l - 2 的生成， 促进淋巴细胞增殖，增强n k 细胞和c t l 细胞的活性。临床实验结果表明，牛膝多糖在 体内具有c s f 样作用，对治疗肿瘤患者因化疗和放疗引起的白细胞下降的有效率可达 9 7 ，并同时可恢复免疫系统的损伤( 向道斌，1 9 9 4 ；李宗锴，1 9 9 7 ) 。此研究也表明， 塞垂娄 塾i 一：一：= = = = 兰篁! 皇 中草药免疫调节剂在体内的作用不仅只与免疫系统的作用有关，而且与神经内分泌系统 的作用也密切相关。有的中草药多糖是通过其它机制而发挥抗癌作用的，如地黄多糖就 是通过对抗癌基因p 5 3 表达的影响而发挥抗肿瘤作用的(