（生物化学与分子生物学专业论文）牙鲆血清免疫球蛋白的分离分析.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：圣塾鑫日期：竺墨! ：! ! 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：毫垫鑫导师签名： 山东人学硕士学位论文 摘要 牙鲆已经在我国北方沿海地区形成了大规模的工厂化养殖，并 成为我国海水养殖的一大重要产业。然而疾病的频繁发生严重阻碍 了这一产业的发展，为了保证牙鲆产业稳定、健康、持续地发展， 必须了解牙鲆对外来抗原的免疫机制和免疫反应过程。 免疫球蛋白( i m m u n 0 9 1 0 b u l i n ，ig ) 是鱼类特异性体液免疫中 的重要一环，构成了一个特异性的体液防御体系。鱼类免疫球蛋白 的研究不仅对于鱼类疾病的免疫防治有重要的推动作用，而且鱼类 作为最低等的脊椎动物，其免疫球蛋白的研究在比较和发育免疫学 上也有重要价值。 在本论文中，用两种方法分离纯化牙鲆血清中的i g m ：p r o t e i n a s e p h a r o s e 亲和柱层析法；d e a e 一5 2 离予交换柱层析，s e p h a r o s e 6 b 凝胶柱层析直接提取法。将两种方法提取纯化的i g m 进行 s d s p a g e 电泳检测，比较两种方法提取的i g m 的分子量，实验结果 显示，两种方法提取的i g m 重链和轻链的分子量相同。在v d s 凝胶 成像系统分析牙鲆i g m 重链( 链) 的分子量为7 4 2 k d ，轻链( l 链) 的分子量为2 3 8 k d 。 用纯化的牙鲆血清中的i g m 作为抗原，以皮内多点注射新西兰 兔及w is t a t 大鼠制备兔抗i g m 和鼠抗i g m 免疫血清。 利用制备的多抗血清，采用酶联免疫吸附实验( e n z y m el i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 的间接法和双夹心法测定己知浓度 的i g m 在4 9 0 n m 的光吸收，比较两种方法测定牙鲆血清i g m 含量的 灵敏度和准确性。实验结果显示，间接e l i s a 法灵敏度较高，准确 性较好。 取8 组不同体重、全长范围的健康养殖牙鲆，用间接e l i s a 法 测定牙鲆血清中i g m 的含量。做出牙鲆血清中i g m 含量随其体重和 山求大学硕士学位论文 全长变化的动力学曲线。实验结果显示，牙鲆血清i g m 的含量随着 体重和全长的增加而增加。 将牙鲆用灭活的鳗弧菌m 3 ( v i b r i oa n g u i l l a r u m ) 免疫后用玻 【 、 片凝集法测定其特异性i g m 产生情况，然后用间接e l i s a 法和双夹 心e l i s a 法测定牙鲆血清中i g m 含量的变化。确立测定牙鲆血清中 各种特异性免疫球蛋白的方法。实验结果显示，用间接e l i s a 法可 以测定牙鲆血清中各种特异性免疫球蛋白。 关键词：牙鲆，i g m ，亲和柱层析，离子交换柱层析，凝胶柱层析， s d s - p a g e 多克隆抗体，间接e l i s a ，双夹心，e l i s a ，鳗弧菌 2 a b s t r a c t f l o u n d e r ( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) w h i c h h a sb e e n e x t e n s i v e l yc u l t u r e du n d e r i n t e n s i v es y s t e m si nt h en o r t hc o a s t a lr e g i o n so f c h i n a ，i sb e c o m i n ga ni m p o r t a n t i n d u s t r yo fm a r i c u l t u r e h o w e v e r , t h ef r e q u e n t l yo c c u r r e n c e so fd i s e a s e sh a v e b l o c k e di t sp r o d u c t i o ni nr e c e n ty e a r s t h e r e f o r e ，m o r ea t t e n f i o n ss h o u l db ep a i d t ot h ec u l t u r e df l o u n d e rd e f e n e er e a c t i o nm e c h a n i s m si no r d e rt om a i n t a i ni t s s t a b l e ，h e a l t h ya n ds u s t a i n a b l ed e v e l o p m e n t i m m u n o g l o b u l i nm ( i g m ) p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nf i s hh u m o r a ld e f e n c e s ， a n dc o n t r i b u t e st ot h es p e c i f i ch u m o r a li m m u n i t y t h er e s e a r c h e so ft h ef i s hi g m c a ne n h a n c et h er e s e a r c ho fi m m u n o l o g i c a l p r e v e n t i o n a n dt h e r a p i ao ff i s h d i s e a s e s a tt h es a m et i m e ，t h es t u d yo ff i s hi g mi sv a l u a b l et ot h ed e v e l o p m e n t a l a n d c o m p a r a t i v ei m m u n o l o g y i no u rr e s e a r c h ，t w om e t h o d sw e r eu s e dt oi s o l a t ei g mf r o mf l o u n d e rs e r u m ： i g mw a sp u r i f i e db yao n e s t e pp u r i f i c a t i o nm e t h o d - a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yo n p r o t e i na - s e p h a r o s e ；t h es e r u mi g m o f h e a l t h yc u l t u r e df l o u n d e rw a sp u r i f i e db y c o m b i n a t i o n so f p r e c i p i t a t i o n w i t ha m m o n i u m s u l p h a t e ，i o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h yo nd e a e 一5 2a n dg e l f i l t r a t i o n 、o n s e p h a r o s e6 b t h eh e i g h t c h a i n ( hc h a i n ) m o l e c u l ew e i g h ta n dt h el i g h tc h a i n ( lt h a i n ) m o l e c u l ew e i g h to f t h ep u r i f i e ds e r u mi g ma r e7 4 2 k da n d2 3 8 k dr e s p e c t i v e l yb ys d s - p a g ea n d v d s g e li m a g i n gs y s t e m w eg o t t h es a m er e s u l t sb yt h et w om e t h o d s t h en e wz e a l a n dr a b b i t sa n dt h ew i s t a rr a t sw e r ei m m u n o l i z e dw i t ht l i e a n t i g e n ：t h ep u r i f i e ds e r u mi g m o ff l o u n d e rb ym u l t i p l ep o i n t s 两e c t i o na n dt h e p o l y c l o n a l a n t i b o d i e sa n t i s e r u m i g mo ff l o u n d e r w e r es e p a r a t e df r o mb l o o d o b t a i n e df r o mt h er a b b i th e a r ta n dt h er a th e a r t w em e a s u r e dt h ec o n c e n t r a t i o no f t h es e r u mi g m b yi n d i r e c t - e l i s aa n dd o u b l ea n t i b o d ye l i s a t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h ei n d i r e c t e l i s ai sm o r es e n s i t i v ea n dm o r ee x a c tt h a n d o u b l ea n t i b o d ye l i s ai nm e a s u r i n gt h ec o n c e n t r a t i o no f t h es e r u n li g m t h ei n d i r e c t e l i s aw a su s e dt om e a s u r et h ec o n c e n t r a t i o no ft h es e r u mi g m o f e i g h tg r o u p sw i t h d i f f e r e n tb o d y w e i g h t a n dd i f f e r e n tb o d yl e n g t h w em a d et h e b o d yl e n g t h - t h ec o n c e n t r a t i o no fi g m c u r v ea n dt h eb o d y w e i g h t t h ec o n c e n t r a t i o n o f i g mc u r v ei no r d e rt oe s t a b l i s ht h ec h a n g i n gc u r v e o ft h ec o n c e n t r a t i o no ft h e 3 s e r u mi g mo fw i t ht h ec h a n g eo ft h eb o d yw e i g h ta n dt h eb o d yl e n g t ho ft h e f i o u n d e nt h er e s u l t ss h o w e dn l a tt h ec o n c e n t r a t i o no ft h es e r u ml g mo ff l o u n d e r i n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo f t h e b o d yw e i g h ta n dt h eb o d yl e n g t h t h ec o n c e n t r a t i o no ft h e s p e c i f i ci g mw a sm e a s u r e db ya g g l u t i n a t i n g a n t i b o d yt i t e ra n ds d s p a g ea f t e rt h ef l o u n d e rw a si n j e c t e dw i t hk i l l e dh b r i o a n g u i l l a r u m t h e n t h ec o n c e n t r a t i o no f i g m w a sm e a s u r e d b yu s i n g i n d i r e c t - e l i s aa n dd o u b l ea n t i b o d ye l i s at oe s t a b l i s ht h em e t h o do f m e a s u r i n g t h e s p e c i f i c s e r u i l li g mo ff l o u n d e r f r o mo u rr e s u l t s ，i ti s s u g g e s t e dt h a t t h e i n d i r e c t e l i s ac a l lm e a s u r ea l lo f t h es e r u n ls p e c i f i ci g mo f f l o u n d e r k e yw o r d s ：j a p a n e s ef l o u n d e ta f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , g e lc h r o m a t o g r a p h y , s d s p a g e ，p o l y c l o n a la n t i b o d y , i n d i r e 。c te l i s a ，d o u b l ea n t i b o d y e l i s a ，h b r i oa n g u i l l a r u m 英文缩写和译名 丙烯酰胺 过硫酸铵 甲叉丙烯酰胺 牛血清白蛋白 二乙基氨基乙基 酶联免疫吸附试验 小时 辣根过氧化物酶 重链 免疫球蛋白 千道尔顿，分子量单位 轻链 分钟 吸光值 邻苯二胺 聚丙烯酰胺 磷酸盐缓冲液 多克隆抗体 辕7 分铺 十二烷基磺酸钠 单向免疫扩散 四甲基乙二胺 4 一羟甲基氨基甲烷 盯，h 鼢眦| 虿 即链。链州。即脏盆m呷宝呦蕊协 刘b引引吲h川h i k l m o o p p p r s s t t 前言 近年来随着对虾养殖业因病害等暴发性疾病而大幅度减产，且海洋中鱼 类资源的剧减人们渐渐把海水养殖的重点转移到海水鱼上来。我国海水鱼 类种质资源丰富，养殖种类繁多，在我国海水养殖业中占有非常重要的地位。 牙鲆( p a r a l ，c h t h y so l i v a c e u s ) 在分类学上属于鲽形目 ( p e u r o n e c t i f o r m e s ) 、鲆科( b o t h i d a e ) 、牙鲆属( p a r a l i c h t h y s ) ，为冷 水性底栖鱼类。主要分布于北太平洋，在中国的渤海、黄海、东海及南海均 有分布，但以渤海、黄海居多。牙鲆肉质细嫩、口昧鲜美，深受消费者的喜 爱，因此具有较高的经济价值。早在7 0 年代末8 0 年代初，日本首次研究并 获得了牙鲆人工育苗繁殖的成功，成为第一个牙鲆工厂化养殖的国家；随后 韩国成为第二个工厂化养殖的国家。我国从9 0 年代初开始引进牙鲆苗种进行 人工养殖，并建立起成熟的牙鲆育苗育种技术，推动了牙鲆生产的发展。目 前北方沿海地区已经形成了较大的工厂化养殖规模，取得了巨大的经济效益， 仅山东省的养殖总产量就超过万吨，产值超过1 0 亿元。由于人工育苗技术的 成功开发，现已开始在冬季南移广东、福建沿海进行养殖。 然而近年来，由于高密度网箱养殖的发展和海洋环境污染程度的日益恶 化，海水鱼类流行性疾病频频发生，极大阻碍了海水鱼养殖业的进一步发展。 危害海水养殖鱼类的主要生物性病原有细菌、真菌、病毒、寄生虫以及藻类 等，目前为止尚无有效的方法遏止其大规模快速流行。首先，由于其发病规 律仍未摸清，快速简便的诊断技术尚未建立，养殖海水鱼类往往在还没有诊 断出病原时，已患病严重或染病身亡。其次，致病生物多为条件致病生物， 即在环境中作为正常成员存在，条件变化或大量进入鱼体后才会引发疾病， 并形成多米诺骨牌效应，由此及彼飞速蔓延。再者，有效的预防措施和治疗 手段仍处于探索阶段，现阶段的常规药物因网箱养殖环境、患病鱼厌食等原 因很难达到有效的治疗效果，而且各种抗生素的滥用，还会危害养殖环境、 威胁养殖生物、破坏养殖水体微生态系，给今后养殖业的健康发展及人类健 康造成巨大的蹲患。 击 当奎盔主量主主垒鲨銮 目前，防止鱼类病害的发生有两种主要方法，一是保护生态，改良环境， 破坏致病菌的生活环境，从一定程度上减少鱼类病害发生的几率；二是提高 鱼类自身的免疫力，增强其抵抗病原菌侵害的能力，即应用免疫学技术防止 鱼病。要提高鱼类的免疫能力，就必须了解鱼类的免疫系统和免疫机理，因 此近年来，越来越多的科研工作者致力于鱼类免疫学的研究。通过鱼类免疫 学的研究，利用鱼类特异性免疫系统，研制和开发各种病原的疫苗己成为现 在水产疾病防治的主流。从提高鱼体自身的免疫机能入手，同时预先进行强 化免疫以使鱼体可产生高效快速的免疫反应来清除入侵病原，并充分利用鱼 体自身的免疫机制，在鱼体内建立一道安全高效的防御屏障，防患于未然， 同时因其是内源因子，不会对水质造成污染，是当今最为环保和健康的防疫 体系。 但是由于目前缺乏必要的免疫学基础知识和手段，国内对海水鱼疾病免 疫防治研究，特别是疫苗的研制方面有极大的盲目性。而国外鱼类免疫学研 究的有关工作却进行得非常活跃。对于海水鱼的免疫应答机制，很多研究帮 达到了分子生物学水平。到目前为止，国外已批准上市的鱼类疫苗有近3 0 种， 在鱼类病害的防治发挥了极其重要的作用。而这些成果的取得同他们在海水 鱼免疫应答机制方面雄厚的基础研究是分不开的。近年来，鱼类免疫学研究 除了组织、细胞水平的研究 ：王外，分子生物学技术也广泛应用在鱼类免疫学 研究上，使得人们对鱼类自体防御机制有了更深层的了解，也使得人们对养 殖鱼类疾病的免疫控制更趋向科学性和合理性。国外正是基于这些较为详细 的免疫学研究，其鱼用疫菌的保护力一般可达9 0 以上，而这正是我们现在一 直傲不到豹。 有鉴于此，我们分离纯化了牙鲆的血清免疫球蛋白，制备了大鼠抗牙鲆 血清i g m 的多克隆抗体，兔抗牙鲆血溥i g m 的多克隆抗体，确立测定牙鳃血 清中 g m 检测的方法，做出牙鲆生长过程中 g m 的变化，为今后进一步研制 各种牙鲆疫菌提供了必需的技术基础 7 一 当銮态主堡圭兰垡笙銮 综述 由主宰或执行机体免疫功能的器官、组织、细胞和或分子所组成的一个 系统称为免疫系统。免疫系统是在生物种系发育、进化过程中逐步建立和完 善的。免疫系统是由免疫器官、免疫细胞和免疫分子所组成。 在很多情况下鱼类为了避免感染鱼的免疫反应必须在一个协调韵多因 子的方式下进行。保护性免疫反应可由免疫接种激发以使必需的免疫因子都 各就各位以抵御病原的感染。要仔细考虑需要启动什么防御参数来激活抵御 病原的保护力，这是非常复杂的，所以需要深入研究宿主病原的相互关 系，从根本上认识鱼类保护性免疫应答的机制。 1 鱼类的免疫器官和组织 免疫组织是免疫细胞发生、分化、成熟、定居和繁殖以及产生免疫应答的 场所。翳、脾腺、髀是硬骨鱼类最主要的免疫器官；而枯礁潍巴组织同样 是其免疫系统的重要组成都分” 1 1 鹪腺 胸腺是鱼类豹中枢免疫嚣官，一般认为它在免疫系统发生的过程中是最 先获得成熟的淋巴细胞。1 9 7 7 年e l l i s 通过对鲑鱼韵研究，发现驹腺是最早 形成的淋巴组织，脾脏则形成较晚“。驹旅原基在受糟后2 4 小时麓可辨别“， 随后分化为胸藏细胞和上皮细胞胸腺位于联系组织层，在鳃腔中由一单层 上皮细胞使之与外界承环境蕊开，驹骤有皮质和麓质之分，但两者之问的分 化因鱼豹种类不周菰不嗣，葡且边界也不瞬显囊募由瀑巴纲照和潍巴母缨 胞组成，在淋巴组织豹起澡中豹藏是最先获得成熟淋巴绸斑的器官“膳骧 随年龄退化的现象在鱼中不议在高等督稚动物中是必然的，丽且不同鱼种闯 存在着嫠异。硬骨氢囊纛教育进程中细胞凋亡现象一巍存在，但随年龄丽减 少“。通常来谴鱼囊羽鞠纛豹大小套髓着季节韵变化和激素韵产生而变化。 1 2 肾莸 肾驻是成鱼重要构辩巴组织，可分为头肾( p r o n e p h o s t0 1 h e a d k i d n e y ) 和中肾( i e s o n e p h r o s , m i d s tk i d n e y ) 。成鱼的头肾已失去捧疆韵功能，却 保留了造趣和内分泌豹功艟”，其形态同脊推动物的骨髓相似”周时头臀 t 当奎盔主耍圭主丝鎏苎 又是一个二级淋巴器官，在介导和加工免疫反应中起重要作用”。头肾的实 质分散在一个致密的窦状隙中，并由肾脏基质细胞支撑。基质细胞统称为网 状上皮基质细胞，包括上皮细胞、包裹着上皮细胞外腔的外膜细胞和具有吞 噬能力的网状细胞。 头肾的基质细胞是主要的造血组织，但同时也在非特异性免疫反应和清 除残屑和受损细胞中起重要作用。用放射性标记的细菌注入硬头鳟( s a l m o g a i r d n e r i ) ，可以在头肾发现超过7 0 放射活性。头肾中的巨噬细胞和上皮 细胞都参与血流中颗粒性物质的捕获“”。 头肾是硬骨鱼重要的抗体产生器官，利用溶血空斑试验和免疫酶技术已 经证实头肾和中肾都存在抗体产生细胞，而且头肾实质中黑色素巨噬细胞的 聚集可以使抗原在免疫或接种之后保留较长的时间，这可能同免疫记忆有关。 1 3 脾脏 脾脏是淋巴系统组织发生中最后一个发生的器官，在造血和免疫反应方 面都起着重要作用。脾脏可分为红髓和白髓。红髓占了脾脏的大部分“”， 是由支撑着血窦的网状细胞网络组成。血窦中充满了各类细胞，包括巨噬细 胞和淋巴细胞。白髓是低发育区，但是可以分成两个部分：黑色素巨噬细胞 聚集区和椭圆体。此外，浆细胞数布在整个白髓区。 抗体生成细胞2 2 2 9 6 出现在脾脏，1 2 2 出现在头肾，l 5 出现在中肠，i 1 出现在胸腺。脾脏中高百分比的抗体生成细胞表明该器官是主要的次级淋 巴器官，和肾的管间组织一起，是储备抗体生成细胞的场所“”。幼年蛇齿鲈 ( d i c e n t r a r c h u sl a b r a x ) 脾中，抗体产生细胞显然集中在白髓( w h i t ep u l p ) 的低发育区。在狼鲈的脾脏( 可能包括部分头肾) 中，抗体生成细胞同淋巴 细胞样细胞的定位很相似，说明了脾可能是t 细胞和b 细胞进行细胞间相互作 用的场所。此外，肾脏和脾脏都有色素细胞( p i g m e n t c o n t a i n i n gc e l l s ) ， 即黑色素巨噬细胞( m e 舢o - m a c r o p h a e e s ) 。 2 免疫细胞 免疫细胞是泛指所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞及其前身 在免疫应答过程中起核心作用的是淋巴细胞，其中接受抗原刺激后能发生特 异性免疫应答的淋巴细耱称为特异性淋巴细胞或称免疫活性细胞。 淋巴细胞是构成免疫嚣官的基本单位。淋巴细胞是体内极为复杂的不均 一的细胞群体，它包括了许多形态上相似而功能上不同的亚群。其中鱼类的b 9 一 些奎态主堡主兰垡鲨塞 细胞还可进一步分为若干亚群，它们在功能和表面标志上各不相同。因此， 淋巴细胞具有明显的异质性。各种类型的淋巴细胞在免疫应答过程中相互协 作、相互制约，共同完成对抗原性物质的识别、应答和清除，维持体内环境 的稳定。 8 细胞能分泌特异性的免疫球蛋白分子，并且细胞表面还有i g + 的分子存 在。抗i g 的单克隆抗体发展后，利用m a b 作为探针，可以成功的定位和定量 淋巴或非淋巴器官中的特异性b 一细胞。实验证明b 一细胞分泌的免疫球蛋白在 分子量“，分、子结构和抗原性方面“”有很大的区别。鲶鱼( c h a n n e lc a t f i s h ) 的i g 至少有二种不同类型的轻链分子“”和四种不同类型的重链分子“。最 近还发现类似i g o 的重链分子的存在f 2 1 。 针对b 一细胞表面的i g + 分子的单克隆抗体可以检测b 一细胞表面类似于哺 乳动物c d 。c d 。等与特异传导有关的信号分子”。b 一细胞本身还可以作为抗 体传递细胞并参与受体介导的细胞内吞作用1 2 4 。 鱼类铲细胞不仅存在于鱼类的肾脏，脾脏中，还存在于心脏，肠道和血 液等处。s c a p i g l i a t i 等全面阐述了珏- 细胞的个体发育。s e c o m b e s 等” 利用鼠抗鲤鱼免疫球蛋白的m a b 和流式细胞仪技术，证明骥i g + 的b 一细胞最 早出现予肾。而后是脾腺，脾脏等处。运用荧光激活细胞分类技术( f c s ) 和抗i g 的单克墅抗体证明i g + 的b 一细胞最早出现于头肾( 大约2 周左右) ， 而后出现于脾( 大约4 周) 和外周血液中( p b l ，大约6 - 1 i 周) ，这说明体液 免疫的完全成熟发生在二个月左右。 鱼类的细胞免疫包括迟发型变态反应、淋巴细胞直接参加的细胞毒性、 移植物排斥反应、巨噬细胞游走抑制和混合淋巴细胞反应等。真骨鱼中，存 在着上述大部分免疫现象。研究鱼类皮肤同种异体移植反应时证实，鲤和鳟 的移植排斥作用是在淋巴细胞渗入后发生的，但切除胸臆的成年鳟鱼，并不 影响其移植捧斥反应。 3 免疫分予 同高等脊椎动物一样，鱼类也通过免疫系统来抵御外来病原微生物的侵 害，鱼类的免疫系统包括体液免疫系统和细胞免疫系统。鱼类的体液免疫包 括菲特异性免疫( 奎要由体滚因予参与) 和特异性免疫( 主要由抗体分子参 与) 两个部分。因为鱼类进化地位和生活环境的特殊，对鱼类体液免疫系统 的研究不仅可以认识鱼类同病原菌间的作用方式，从根本上认识鱼类保护往 免疫应答的机制，为防止鱼病提供理论依据：还可以研究脊椎动物免疫系统 i 口 一省奎态兰堡圭兰垡鎏奎 的进化规律。 3 1 非特异性免疫因子 鱼类的非特异性体液免疫的主要作用物质是血液或体液中的体液因子， 这些体液因子主要针对瘸原感染的早期阶段，是鱼类抵抗病源感染的早期阶 段，是鱼类抵抗病原感染的第一防线。存在于鱼类血液或粘液中的具有非特 异性抵抗作用的分子包括溶菌酶、抗蛋自酶( 如a 一巨球蛋白) 、转移因子、 补体、c 一反应性蛋白、几丁质酶、i 型干扰素。这些物质可以直接分解细菌( 如 溶菌酶、补体) 或真菌( 如几丁质酶) ，抑制细菌( 如转铁蛋白) 或病毒( 如 干扰素) 的复制，或作为调理素增加吞噬细胞的吞噬量( c 一反应蛋白、补体) ， 乃至中和细菌( 如a 一巨球蛋自) ( d o r s o n 等1 9 9 3 ，p i n t o 等1 9 9 3 ) 。 3 i 1 细胞溶素 抗菌肽是一类具有抗菌活性的碱性多肽，具有广谱的抗菌性能，对革兰 氏阴性菌及阳性菌均有杀灭或抑制作用，是非常重要的体内清道夫。近来从 许多鱼种体表分泌液中分离出了抗菌肤4 ”，但有关抗菌肽在抗鱼类细菌性 病原的保护力中的重要性还未进行研究。 蛋白酶在许多鱼类的体表粘液存在，具有类胰酶的活性”。虹鳟的粘液 蛋白酶可以裂解死亡的镘弧菌细胞，由此可知，蛋白酶可能在鱼类精膜免 疫防御机制中起作用。 溶菌酶可以水解组翦细胞壁肽聚糖层中的n 一乙酰胞壁酸和n 一乙酰葡萄耱 胺。溶菌酶存在于鱼的粘液、血清和组织。在自细胞中最为丰富。在鲆鲽类 中，通过组织化学的方法可以在单核细胞和中性粒细胞中发现溶菌酶( m u r r a y f l e t c h e r 。1 9 7 6 ) ，血清溶菌酶可能来自这些溶茵酶。在鲑鱼的卵巢检测到 高水平的溶菌酶( y o u s i fe ta 1 ，1 9 9 1 ) 。c r i n d e ( 1 9 8 9 ) 研究了从硬头鳟头 肾分离得到的两种溶菌酶异型( t y p e si 和i i ) 对7 株鱼类革兰氏阴性病原菌 的抗菌活力。t y p ei 具有非常强的杀菌力，可以杀死所有的菌株t 丽作为对 照的鸡蛋白溶菌酶只杀死了一株没有毒力的细菌哺乳动物的溶菌酶可以直 接作用于革兰氏阳性细菌，但对于革兰氏阴性细菌t 兢需要补体系统的协助 打断细胞外壁层，以使溶落簿可以接近内部的肽聚糖层。然而来自硬头鳟的 溶菌酶t y p ei 很明显可以直接作用于鱼革兰氏阴性病原菌t 银大麻哈鱼的卵 中的溶菌酶在7 0 0 p gm 1 1 的浓度只是大部分鲑鳟鱼卵中浓度的3 隔一可 以杀死嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌和c a r n o b a c t e r i 埘p i s c i c o l a 但对予 一省奎盔主璧主主垡垒塞 鲑鱼肾细菌( r e n i b a c t e r i u ms a l m o n i n a r u m ) 而言，即使是1 9 0 0 “gm 1 - 的浓 度作用9 0 分钟依然没有作用( y o u s i fp fa ，1 9 9 0 ) ，这也有助于解释为什 么这种菌可以在鱼卵中存活并且可以垂直传播。 3 1 2 补体 补体是机体非特异性免疫的重要部分。补体是存在于血清及组织液中的 一组具有酶原活性的蛋白质，化学组成均为糖蛋白。鱼类的补体据目前报道 大约有十一种：c 1 ，c 2 ，c 3 ，c 4 ，c 5 ，c 6 ，c 7 ，c 8 。c 9 ，因子d 和因子b 。 鱼类补体对热敏感，4 2 4 5 c 下即失活8 。鱼类补体在生物化学性质上与哺 乳动物的补体并不一致，鱼类的抗原一抗体复合物不能激活哺乳动物的补体 【3 7 ) 0 同崤乳动物类似，硬骨鱼类有补体激活的替代途径( a c p ) 和经典途径 ( c c p ) 。在鱼类血清中非抗体依赖性的a c p 的活性比哺乳动物的高出5 - 6 0 倍 ( y a n o ，1 9 9 6 ) ，因此替代途径可能对鱼类这样的交温动物更为重要，因其所 处的环境( 尤其是滠度) 可能不利于抗体产生所必需的蛋白质合成过程。而 替代途径不需要抗体即可激活补体反应，从丽能更有效的发挥这一系统的非 特异性免疫功能。革兰氏嬲性缨菌组胞壁的瑟多糖可以直接激活 c p ，并引致 细菌细胞的溶解。在被激活的补体作用于细胞壁的过程中，有两种成分对吞 噬细胞的聚集起着重要作用从补体复合物释放后的c s a 对中性粒细胞和巨 噬细胞是一种薰要的魑化因子 补体成份的发展有类似系统进化的特点”。在无颁类中，如盲鳗，七鳃 鳗，补体的主要成份只有替代途径中豹c 3 成分。撼一些软骨鱼中，不存在经 典途径。朴体成份中只含有替代途径中的若干成分，而在硬骨鱼类中，经 典和替代途径的存在为许多实验证实，但硬骨鱼类的补体成分少于哺乳动 物的补体成分( 螗乳黧的替体成分有3 0 多种) 。 补体系统是许多防翻机翻的中心环节，具有裂解滔性、致炎活性、趋化 活性和调理活性，并由纯同苷特异性的吞噬反应建立了联系。生理状态下。 血清中补体大多以秃活性的冀前体形式存在当它幻被某些物质激活后，即 可发生连镇的酶促魔盛獭爨霸备种氅蜘掌活性，如潦蓠杀尊t 细怠毒、调 理吞噬、免疫粘精、串翮稿磐癞獯和炙痰夯震萼作甩。 硬臂鱼类豹朴体在非特异性体滚免疫中发挥重要作用：它能于抗体或细 胞外毒素结合，促进洛菌( s a k a i ，1 9 8 4 a ) 健迸白系白缉囊吞曦“”1 ；促进 炎症反应和淋巴细胞豹趋化作用。 3 1 3 生长抑制物 转铁蛋白是由单一多肽链组成的糖蛋白。铁是大多数病原菌侵染的种 必需元素，但在脊椎动物组织液中存在非常少因为它厕血液中与铁有高亲合 力的转铁蛋白结合着，只有病原具有非常高亲和力的铁吸收系统才可以得到 大量的铁以体内生长1 4 4 ) o 病原菌有几种方式可从寄主体内得到铁包括从转铁 蛋白但是转铁蛋白具有高度遗传多态性，而且一些细菌性病原从转铁蛋白 获得铁的能力可能会受到某些宿主转铁蛋白基因型的限制。 蛋白酶抑制物在鱼类血浆中大量存在，主要是d 1 一抗蛋白酶和2 臣球 蛋白( a 2 m ) 。许多细菌可以产生蛋白质毒素以便消化宿主组织蛋白作为氨基 酸的一种来源。由杀鲑气单胞蔺( , 4 e r o m o n s ss a l m o n i c i d a ) 产生的一种重要 的蛋白酶对虹鳟的a 1 一抗蛋白酶有抗性，但可被a 2 m 抑制( e l l i s 。1 9 8 7 ) 。在 两种不同的鲑鳟种类中( 虹鳟和溪鳟) a 2 m 活性的不同被证实同它们对杀鲑气 单胞菌感染的抗性相关 4 s l7 说明a 2 m 可能在抗疖疮病的防御中扮演重要角色。 凝集素是蛋白质，可以结合某些糖类“。在许多鱼类的卵、粘膜和血清 中都发现有凝集素。大鳞大麻哈鱼( o n c o r h y m c h u st s c h a w y t s c h a ) 卵中凝集 素抑制鳗弧菌( h b r i oa n g u i l l a r u m ) 、耶尔森氏菌属( y e r s i m ar u c k e r i ) 、 嗜水气单胞菌( 爿h y d r o p h i l a ) 和迟钝爱德华氏菌( e d w a r d s i e l l at a r d a ) 的生长( v o s se ta 1 ，1 9 7 8 ) 。银大麻哈鱼( nk i s u t c h ) 鱼卵凝集素可以凝 集杀鲑气单胞菌( a s a l m o n i c l d a ) ( y o u s i d e ta 1 ，1 9 9 4 a ) 。香鱼 ( 脚e o o g o s s u sa l j 憾j i s ) 的皮肤粘液对鳗弧菌( ma n g u i l l a r u m ) 的l p s 具有很高的亲和力( i t a l ie ta 1 ，1 9 9 3 ) 。从日本鳗鲡( a n g u i l l aj a p o n i c u s ) 和大西洋鲑的血清中可分离得到一种甘露糖联的凝集索“”。鱼类血清中凝集 素的防御功能还不甚明了，但哺乳动物血清中的甘露糖联蛋白 ( i i l a n n a n b i n d i n gp r o t e i n 。粕p ) 可以作为细菌被吞噬作用的调理索( k u h l a m e ta ，1 9 8 9 ) ，而且同补体系统的激活有关( o h t ae ta l ，1 9 9 0 ) 。 3 1 4c - - 反应性蛋白( c r e a c t i o np r o t e i n ，c r p ) c 一反应性蛋白是鱼类血清中的正常成份，它能使多种真菌、细菌和寄生 虫中的含有糖类、磷酸酯的分子发生沉淀“。降低病原毒性，促进吞噬作用a s r i m a l 等m 证明c r p 分子可以同磷酸胆碱反应的蛋白，而后者广泛存在予细 菌、真菌和寄生虫的表层结构中。c r p 之所以得名是因为它可以同肺炎链球菌 ( s t r e p t 口c o c u s p n e u a 阳n i a e ) 的细胞壁成分c 一多糖反应并凝集。这种结合是 -一省盔盔主塑主芏垡鎏塞 c + 依赖的c r p 在许多动物中包括无脊椎动物都存在。它可以激活补体并由 此激活裂解和吞噬活性。脊椎动物的正常血清中c r p 的含量很低，出现炎症 反应时其浓度迅速升高a 因此，在哺乳动物中c r p 是一种急性期蛋自。另 方面，在许多种鱼的正常血清中，c r p 的浓度非常商( 大约5 0 0 1 x gm 1 1 ) ，受 到高温的突然利激或炎症物质刺激时，其浓度可提高2 0 倍。c r p 在鲆鲽 ( w h i t ee ta 1 ，1 9 8 3 ) 和斑点叉尾纲( _ f c t a u _ r u sp u n c t a t u s ) 血清中的水 平，冬天要比夏天的低。这可能同斑点叉尾鲴在冬季对水霉感染的敏盛性升 高有关( s z a l a ie ta 1 ，1 9 9 4 ) 。c r p 亦在鱼的体表粘液和卵巢中存在( y a n o ， i 9 9 6 ) 。 从它的广泛分布及其高的血清浓度来看，c r p 有望在防御机制中扮演重要 角色。在虹鳟( o n c o r h y n c h u sm y k i s s ) c r p 可以激活补体并增强对鳗弧菌的 吞噬能力( n a k a n i s h ie ta 1 ，1 9 9 1 ) ，而且c r p 的水平在人工感染病原菌后 提高了3 倍( m u r a ie ta 1 。1 9 9 0 ) 。 3 1 5 天然溶血素( n a t u r eh a e m o y s i n ) 天然溶血素是一种小分子量的蛋白质，能溶解异源红细胞，有广泛的抗 原识别能力。天然溶血素存在于多秘鱼类的天然血清中( i n g r a m ，1 9 8 0 ；) 在 冷、热条件下都可能失活“”。t h g r a m ( 1 9 8 7 ) 认为，天然成分的溶血素和异 源红细胞诱导的溶血素有相似的分子量，二者无法完全分离；s a k a i ( 1 9 8 1 b ) 分析了多数鱼类血清的溶血紊后，发现随着进化程度的增加，血清中的溶血 素的含量与补体的含量呈负相关关系，很可能说骧不依艘抗体的溶血素和依 赖抗体的“溶血素”( 即补体) 之间有着类似的性质和进化上的相关性。 3 i 6 干扰素一i ( i n t e r f e r o n 1 ) 、 血清中的i 一型干扰素是鱼类主要的抗病毒感染因子，主要是由巨噬细 胞分泌”，可以被l p s 、病毒和革兰氏阴性细菌等诱导，干扰素在血清中的 含量极少，因此主要的分析方法多采用基因技术。t a m a i 等“”溯定比日鱼的 干扰素序列发现其与哺乳动物的干扰素极不相似。利用p c r 和同源克隆 的方法克隆干扰素一i 型分子，同样证明鱼类的i f _ i 缺乏哺乳动物特有的 i c e 切割位点。 3 2 鱼类的特异性体液免疫 鱼类经抗原( 病毒、细菌、寄生虫，蛋白质及其它商分子物质) 感染刺激 些奎盔堂堡主堂堡笙苎 后，会产生特异性的体液免疫反应。抗体构成了一个特异性的体液防御体系， 可以抑制细菌对非吞噬细胞的寄主细胞进行的粘附和入侵，以及中和细菌毒 素等t 同时可以作为种调理素，通过激活补体系统的经典途径裂解细胞、 激发炎症反应和吞噬细胞流，以及进一步增强吞噬活力。特异性细胞免疫是t 淋巴细胞同它们特异性抗原结合后，释放的细胞因子可显著地增强巨噬细胞 的杀菌活力。鱼类分泌特异性的抗体直接来中和抗原并激活补体级连反应杀 伤靶细鼹。在特异性体液免疫中最重要的是体液中的免疫球蛋白分子( i g ) 。 3 2 1 鱼类免疫球蛋白的系统演化 鱼的种类成多样化，演化地位十分复杂。有关鱼类免疫球蛋白的演化， c o a b e l ( 1 9 7 5 ) 和s n i e s z k o ( 1 9 7 0 ) 都曾对此做过阐述。鱼类的免疫反应能 力( 产生抗体的量、类别和多样性，以及免疫记忆) 也是随淋巴样系统在组 织结构上的进步而逐渐发展和完善起来的。 在圆口纲中，丑婆鱼( e t a t r e t v ss t o u t i 力成体有淋巴细胞，但没有聚集 成团的淋巴样组织( t h e o n e s 和h i l d m a n n1 9 7 0 ) 。对异体移植物呈现免疫排斥 现象。而八日鳗( p e t r o m y z o nm a r j n u s ) 具有原始的淋巴样系统，结构很简单。 幼鱼鳃区有分散的淋巴细胞团，可能相当于原始的胸腺，前肠折陷处有原始 的脾脏( g o o d 等，1 9 6 6 ) 。 在板鳃亚纲( e a s a m b r a n c h ) 中，发现有两种不同沉降类型的抗体分子： 7 s 和1 9 s 。它们的电泳性质和分子结构类似哺乳动物的i g m “1 。f i d l e r 等”7 1 从个体发育的观点上发现1 9 s 抗体只存在于n u r s h a r k 的幼体阶段，而7 s 抗体 则在成鱼中占很大的比饲。利用不同种类鲨鱼的1 9 基因的可变区和恒定区， 也可以分析裟鱼抗体分子的演化和进化过程 在软质目( c h o n d r o s t e a n ) 中，p o l l a r a 等“”分折匙嘴鲟血清( p a d d l e f i s h ) 的免疫球蛋白。发现完整i g 的分子量为8 7 0 k o ，用胍或尿素可分解成h 链 ( 7 5 3 k d ) 和l 链( 2 3 5 k d ) ，t t 链和l 链的氨基酸顺序相似，k 链的组装