（生物化学与分子生物学专业论文）真菌mirna的计算机预测及鉴定.pdf

摘要 摘要 m i e r o r n a 是近年来在动植物以及病毒中被广泛研究的一类长度为1 8 2 5 n t 的非编码小分子r n a 。许多研究表明，这些m i r n a 作为种真核生物体内的 重要的调节因子，在生物体内发挥着重要的调节作用，几乎涉及到所有的细胞 水平方面的功能。由于目前在各个物种中所鉴定的m i r n a 的数量远远不及理论 上的饱和值，所以对m i r n a 的分离鉴定依然是m i r n a 研究的一个热点。作为 一种特殊的模式生物，酿酒酵母基因组的钡序已于1 9 9 6 完成，而且科学家通过 全基因组比较分析，发现酵母基因与人类基因相似程度不低大约3 0 的己 知和人类疾病相关的基因在酵母中有同源类似物。这种相似性使得人们可以用 人类细胞e d n a 克隆在酵母中进行功能替代分析，从而为研究人类相关疾病提 供了一个更好的平台。但是，目前在m i r n a 数据库( m i r b a s e ) 中还没有真菌 m i r n a 基因的记载。真菌( 尤其是致病性真菌) 如果存在m i r n a 。将为我们提 供阐述病理的新思路。 。考虑到m i r n a 具有时空表达特异性，以及m r n a 的降解产物和其它非编码 r n a 对实验分析的干扰实验r n a 组学方法具有定的局限性。因而我们利用 成熟m i r n a 的序列保守性以及前体结构具有发夹二级结构的性质，采用计算机 r n a 组学方法在酿酒酵母基因组中首先鉴定出3 2 个m r n a 分子。 关键诃：m i c r o r n a 、m i r n a 、$ i r n a 、缸1 9 i 、s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e n a b s w a c t a b s t r a c t m i c r o r n a , a saf a m i l yo f n o n - c o d i n gs m a l lr n a1 8 2 5 n ti nl e n g t h , h a v eb e e n p r o f o u n d l ys t u d i e di nr e c e n ty e a r si np l a n t s a n i m a l sa n dv i r u s a sa ni m p o r t a n t r e g u l a t o ri ne u k a r y o t eo r g a n 衄m a n ys t u d i e sd e m o n s t r a t e dt h a tm i r n ah a v e s i g n i f i c a n tp e r f o r m a n c ei nt h ed e v e l o p m e n to fo r g a n i s q mi n v o l v i n gm a n ya s p e c t so f c e l l p h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e s 1 1 砖c h a l a c t 汀o fm i r n ai ss t i l la t t r a c t i v ea c a d e m i c r e s e a r c h sf o rt h ec a u s et h a tt h en u m b e ro fi d e n t i f i e dm i r n a si sf a xf r o ms a t u r a t i o n w i t ht h ec o m p l e t es e q u e n c i n go fs o m ef i l i l g ig e n o m e ，a n dh u m a n f u n g n sg e n o m i c p a i ra l i g n m e n t , s c i e n t i s t sd i s c o v e r t h a t f u n g u si s s i m i l a rw i t hh u m a ni ns o m e i m p o r t a n tp r o t e i n se x p r e s s i o nd u r i n gt h ec e l lp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n m e a n w h i l e ，t h e s p e c i e sd i s p l a ye x 扛嚣皿呤p h e n o t y p i cd i v e r s i t yf o rv a r i a t i o n , c o m p e t i t i o na n ds e l e c t i o n m o r ei m p o r t a n t l y ，n om i r n aw a sr e g i s t e r a di nm i r b a s eu pt on o w a sa 他s m t ； t h e s et e r m sa b o v ep r o v i d ec o n s i d e r a b l ea c a d e r n i ca n dr e a l i s t i cm e a n i n gi ni d e n t i f y i n g m i r n a si nf u n g u s a 5f o rl i m e a n dt i s s u e - s p e c i a l i t yo fm i r n ae x p r e s s i o na n dm i s - l e a d i n go f d e g r a d a l i o no fm r n aa n do t h e rn o n - c o d i n gr n a s , t h e r ei sl i m i t a t i o nb yu s i n g e x p e r i m e n t a lr n o m i c s t h e r e f o r e w ea p p l yc o m p u t a t i o n a lr n o m i e st op r e d i c t m i r n ai ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eb a s e do i l s e q u e n c ec o n s e r v a t i o no fm a t u r e m i r n a sa n dt h e i rp r rd i s p l a y i n gh a i r p i ns t r u c t u r e ，l e a d i n gt oi d e n t i f i c a t i o no f 3 2n o v e lm i r n a s k e y w o r d $ ：m i r n a ，m i c r o r n a ，s i r n a ，f l m g i ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌盍堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：捌签字目期：加踔无月7 、日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌盍堂有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌太堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名 翘乞 签字日期：俨阵九月7 目 签字日期：妒驴年无 月7 曰 第1 章引言 1 1 概述 第1 章引言 r n a 是生物体内最重要的物质基础之一，它与d n a 和蛋白质一起构成生命 的框架。但长久以来，r n a 一度被认为仅仅是d n a 和蛋白质之间的“过渡”，它 从d n a 那儿获得自己的顺序，然后将遗传信息转化成蛋白质。然而，一系列的 研究表明，这些小分子r n a 事实上操纵着许多细胞功能，它可通过互补序列的 结合反作用于峪，从而关闭或调节基因的表达。m i c r o r n a ( m i r n a ) 是薪近 发现的一类非编码小分子r n a ，长度大约2 0 n t 。它们对真核生物的生命活动的多 方面有着重要的影响，是调节生命活动的一个重要调节分子。目前已经鉴定其 在染色体消除、染色体重组、d n a 复制及基因调控等方面存在重要的影响。从 且前所积累的实验证据可以岢定它涉及到了整个细胞水平的的功能调控【l 】。 1 2m i r n a 基因 1 2 。1m i r n a 的发现过程 m i r n a 的发现最早要追溯到上世纪九十年代。当时人们是用遗传筛选的方 法寻找线虫( c e l e g a n s ) 胚胎发育的缺损体，发现了一个控制线虫幼虫发育时序 性的非编码基因l i n - 4 ，该基因产生对小分子r n a 。其中一个长约2 2 n t ，另一 个约为6 i n t ，较长的r n a 可折叠为茎环状结构，被认为是较短r n a 的前体。 l i n - 4 可抑制f i n - 1 4 基因表达蛋白质的水平，而l i 1 4 在发育路径中起着重要的 作用。最终的研究结果表明：正是l i n 4 和l i n - 1 4 的3 啡翻译区这种直接的但不 完全的配对作用是l i n - 4 调节着l i n 1 4 的蛋白质合成的原因。即l i n - 4 所编码的小 分子r n a 与l i n - 1 4 的3 非翻译区的7 个位点不完全互补结合后，抑制了该基因 的蛋白质的翻译：而f i n - 4 突变体由于f i n - 4 不能正常的表达，因而f i n - 1 4 就会一 直处于无抑制状态，它就会一直抑制线虫从幼虫向成虫的过渡，从而出现上述 表型【m 。 第1 章引言 在相当长时间里，l i n - 4 被认为是内源性的m i r n a 分子的唯一例子。第二个 小分子r n a l e t 7 由r u v k u n 实验室发现。该m i r n a 也为2 2 n t ，同样在异时性 基因路径中发挥作用。与肋4 相似，j n 7 识别靶l i n - 4 1 m r n a 的3 q j t r 序列， 抑制蛋白l i n 4 1 的水平。l i n 4 和l e t 7 被命名为小分子时序性r n a ( s m a l l t e m p o r a lr n a ) 。l i n - 4 和l e t - 7 在所有的线虫亚种中呈现出进化上的高度保守性， 其同源物在软体动物、海鞘、小鼠和人类中也能够检测到。这种广泛存在的高 度保守性有力地说明了m i r n a 在发育过程中的重要的调节作用。这一观点已经 被线虫的各个器官所鉴定的m i r n a 功能所证实。l i n - 4 现在被认为是m i r n a 分 子的奠基性成员4 1 。 对m i r n a 指导的基因调节的研究成果集中于寻找更多的m i r n a 和它们所调 节的靶分子及其功能等方面的研究。近来的研究表明，m i r n a 的功能包括对细 胞分化的控制，细胞死亡，代谢以及造血干细胞分化等等【恪l 。 1 2 2m i r n a 基因的结构特征 目前在不同物种中发现的m i r n a 长度大多为2 2 n t ，其中2 1 2 3 n t 长度的 m i r n a 占大多数。约为8 4 。m i r n a 的一个特点是它的前体常形成分子内茎环 结构，而且含有大量的g ：u 碱基对，这个前体物经过核酸酶的加工形成成熟的 m i r n a 1 0 - 2 1 。 同线虫的l i n - 4 和l e t - 7 一样，大部分m i r n a 基因与已注释基因相距较远， 提示他们来自独立的转录单位。然而，相当多的分子来自p r e m r n a 中的内含 子。这些m i r n a 常与预期的m r n a 以同一方向排列，提示这些m i r n a 并没有 自己的启动子这种组织形式为m i r n a 与蛋白的共同表达提供了便利的机制， 同时也解释了m i r n a 与宿主m r n a 之间的保守关系【2 刎。 然而近来研究表明，大多数哺乳动物的m i r n a 位于转录单元( t u ) 内。 通过即时更新的基因组装配以及e s t 数据库，人们发现许多以前位于基因间隔 区的m i r n a 位于内含子中。有时候由于选择性剪接方式，m i r n a 位于同一个 p r e - m r n a 的外显子或者是内含子中。根据m i r n a 基因组位置，m i r n a 可以分 为下列几种：l 、位于编码蛋白质转录单元的内含子中；2 、位于非编码转录单 元的内含子中；3 、位于基因间隔区中。混合m i r n a 依据剪接模式的不同而成 为以上一种基因组织形式。一些内含子m i r n a 的位置在许多物种中是非常保守 2 第1 章引言 的f 3 咖。 另外一些m i r n a 基因在基因组中和表达模式中成簇排列，意味着它们的转 录以多顺反子形式的原初转录本进行( 图1 1 ) 。在人类基因组中大约5 0 0 , 6 的已 知m i r n a 成簇表达。而且一个簇的m i r n a 经常是彼此相关的。而一个簇中也 包含了不相关的m i r n a f l 3 蛳 图1 1m i r n a 成簇排列的基因组织形式 f i 9 1 1g e n o m i co r g a n i z a t i o no f m i r n a c l u s t e r 注：大约6 0 m i r n a s 是独立转录的，1 5 m i r n a s 成簇袁达，2 5 位于内含子中 目前有研究发现，m i r n a 基因可能也来自于进化过程中出现的假基因。在 人的m i r n a 基因中，m i r - 2 2 0 和m i r - 4 9 2 各自位于一个加工的假基因中这说 明m i r n a 在进化过程中可能出现了重复以及发生了变异，同时也表明了有一部 分m i r n a 是来自于假基因中1 1 删。几乎所有已经鉴定的m i r n a 在相近的动物 中保守，如人与小鼠，以及秀丽线虫和布氏线虫。许多m i r n a 在动物中具有更 为广泛的保守关系。例如，近三分之一的线虫m i r n a 可以很容易在人的m i r n a 中找到同源物 3 4 】。如果比较更远一点的物种，相当多的基因家族的扩大或缩小 非常明显，最令人吃惊的例子是l e t 7 家族，它在线虫中有四个相同的成员，在 人中至少有1 5 个，但在果蝇中只有一个1 7 。j 。 ， ) 拯慷) ) 、 ，厂、，r、，j、-、_、_、， ) ) 悻他) )y)o，、1、j、，(r、_、_15 # 鼍 第1 章引言 与植物m i r n a 前体相比，动物m i r n a 前体分子的长度变化较小，大多数 在7 0 8 0 n t 之间。一部分m i r n a 常以单拷贝形式存在于基因组中。一些m i r n a 的前体分子常以两个或多个拷贝存在于不同染色体或者是同一染色体不同的位 置上。某些m i r n a 来自两个或多个仅有微小差异的前体 2 - 7 。 1 3m i r n a 的生物合成 1 3 1m i r n a 生物发生的基本概况 成熟的m i r n a 是一种长约1 9 - 2 5n t 大小的单链r n a ，而编码m i r n a 的基因 则位于基因间区或基因的内含子中。m i r n a 的形成需要经历如下阶段：基因的 转录、原始转录本( p r i m r ym i r n a ，p r t - m i r n a ) 的加- r 、m i r n a 前体分子 ( m i r n ap r e c u s o r ，p r e - m i r n a ) 转运、p r e - m i r n a 的剪切及m i r n a 链的选择共5 步，最后形成具有生物学功能的成熟单链m 派n a 2 - 嘲。它可以组合进入r n k 诱 导的沉默复合体( r n a - i n d u c e ds i l e n c i n g c o m p l e x ，r i s c ) 中，进而引起靶m r n a 的 降解或翻译的抑制。而m 讧a 究竞发挥哪种作用，是由m i r n a 与靶m r _ n a 之间 的互补程度决定的【2 邺”。当二者完全匹配时，引起靶m r n a 的降解而二者不完 全匹配时，则引起靶m r n a 翻译的抑制。 在m i r n a 的生物发生过程中，m i r n a 基因的转录是由r n a 多聚酶i i ( p o li i ) 催化完成的，形成p r i - m i r n a ；然后p r i - m i r n a 在细胞核中的一种“微处理器 ( m i c r o p r o c e s s o r ) ”蛋白质复合体的作用下，产生具有特征性的大约7 0n t 大小的发 夹状p r e - m i r n a 。生成的p r e - m i r n a 在核转运受体e x p o r d n - 5 ( e x p - 5 ) 的作用下， 转运到细胞浆中。细胞浆中的p r e - m i r n a 在d i c e r 的作用下，剪切产生大约2 2 m 大小的双链m 氓n a ( 图1 2 ) 0 8 - 3 2 1 。其中只有一条单链可以选择性结合到r i s c 中 去而成为成熟l i l i r n a 。一般而言，成熟的m i r n a 多为具有5 。端小突起的那条 链。 4 第1 章引言 图1 2m i k n a 的成熟加工过程 f i 9 1 2t h em a t l f f ep r o c e s so f m i r n a 1 3 2m i r n a 加工的核内过程 m i r n a 在细胞核中经历了从m i r n a 基因到大约7 0 n t 大小的m i k n a 前体 阶段。在这个过程中，有多种不同的细胞核内蛋白质的参与，这些蛋白质相互 协调作用，保证m i r n a 在细胞核内的正常加工。 研究已经发现植物m i r n a 基因绝大部分定位于基因间隔区，动物大部分位 于基因中的非编码区域，即内含子中。这_ 磐m i g n a 的基因一般由r n ap o m 进行 转录，生成的p r i - m i r n a 长达几千个碱基，有帽子结构( c a ps t r u c t u r e ) 和p o l y a 尾， 同时具有一个或几个局部的发夹状结构，以多顺反子形式存在。最近的研究还 发现大约5 0 m i r n a 基因彼此相邻，簇集存在，带有自己独立的转录启动子。 可见，m i r n a 的基因也类似于其他的基因，在不同的发育阶段及不同的组织类 型中，处在p o l 的精确调控之下p 3 - 3 6 。目前，推测由r n a p o l i i 指导的转录可 能具有如下的优点：m i r n a 基因的转录可以被不同的p o l 调节因子所控 制，从而使得在不同的发育阶段，不同的细胞类型中表达特异的m i r n a ： m i r n a 和编码蛋白质的基因表达可能存在彼此协调的作用，尤其是二者同时位 第1 章引言 于一个转录本时更为明显阱4 7 l 。 从p r i m i r n a 至u p r e m i r n a 的加工，需要细胞核中一种叫做微处理器的复合 体的参与作用。在其作用下，p r i - m i r n a 被加工成为p r e - m i r n a ，这一过程在细 胞核中完成。细胞核中的微处理器在不同的生物体中，所包含的成分不尽相同。 在线虫、果蝇及哺乳动物体内，该复合体至少包含有两种蛋白质成分，分别为 d r o s h a 和p a s h a ( p a r t n e ro f d r o s h a ) 。在人类，p a s h a 又称为d i g e o r g e 综合征关键 区域基因8 ( d i g e o r g es y n d r o m ec r i t i c a lr e g i o ng e n e8 ，d o o r 8 ) t 3 叼。植物中则由 d c l l ( d i c e rl i k e1 ) 来完成这一过程。 1 3 3m i r n a 加工蛋白 b e r n s t e i n 等人认为对q 鹊e i i i 家族蛋白参与了r n a 干扰作用。d r o s h a 和d i c e r 酶均属于r n a s e i i i 家族的成员。r n a s e i i i 是双链r n a 特异性核酸内切酶其家 族共分三类( 图1 3 ) ：第一类含一个保守的r n a s e i i i 域和一个与之相邻的双链 r n a 结合区域( d s r n a - b i n d i n gd o m a i n ，d s r b d ) ：第二类包括d ro sh a 及其同源 物含相继的两个r n 蹴i 域和一个d s r b d 以及一段未知功能的氨基末端延 伸区域；第三类是d i c e r 及其同源物。 图1 3r n a s e l l l 家族结构示惹图 f i g1 3t h ed i a g r a mo f r n 蛳l l if a m i l y d r o s h a 大约1 6 0 k d a 大小，全长大约1 3 0 0 个氨基酸，是r n a 酶i ( r n a s ei i i ) 家族成员之一，包含有一个脯氨酸富集区，精氨酸丝氨酸富集区、两个m 蛆酶 结构域和c 端的一个双链r n a 结合结构域( d o u b l e s t r a n d e dr n a b i n d i n g d o m a i n d s r b d ) 。d r o s h a 在线虫、果蝇以及人类中具有保守性。d r o s h a 在果蝇 体内形成一种大约5 0 0k d a 大小的复合体，而在人类体内形成的复合体大约 6 5 0 k d a 大小。这一复合体即微处理驯3 圳。d r o s h a 的主要作用是剪切p r i m i r n a 形成具有3 。端2 n t 悬垂的p r e - m i r n a ，此为r n a s e m 作用的主要特征。生成的 第1 章引言 硼e - m i r n a 的具有3 端2n t 悬垂的末端即为成熟m i r n a 的一端，而m i r n a 另一端 是由d i c e r 在距离已知末端大约2 2 t 的位点上剪切而成的，可见，d r o s h a 的加工 决定着m i r n a 的真正序列。其加工的特异性是m i r n a 的整个生物发生过程中特 异性最高的。研究发现，p r i - m i r n a 的三维结构是底物特异性的主要决定因素。 剪切位点附近双链的茎部结构和末端的环状结构( 1 0 n t ) 也是非常关键的。而且， d r o s h a 复合体可以测量茎部的长度，一般在距离末端的环状结构约2 个螺旋转角 ( h e l i c a lt u r n x 大约2 2n t ) 的地方进行剪切。d r o s h a 的剪切位点位于每个茎环结构 两侧的茎部。且通常相互错开两个核苷酸，研究表明，d r o s l m 剪切位点的上游 - - 2 0 n t 和下游2 5n t 对d r o s h a 的剪切起到关键作用，而茎环结构内部的环或突起 的改变并不会对剪切过程产生重大影响。减少末端环的长度、破坏茎部的互补 配对以及剪切位点所在序列的缺失或突变都会显著减弱d r o s h a 对p r i - m i r n a 的 剪切效率。此外，研究还发现d r o s h a 间接地参与了前核糖体r n a 的加工【3 1 1 。 微处理器的另一个关键成分是p a s h a 。p a s h a 为d s r n a 结合蛋白，参与d m s l m 对底物的识别抑制该基因的表达可以使面m i r n a 在细胞核中的堆积增加。 d g c r 8 是第一个被鉴定出来的参与体内m i r n a 加工过程的p a s h a ，进化上具有 保守性，约1 2 0k d a 大小包含有两个d s r n a 结合结构域和一个已知的可以与脯 氨酸富集的多肽相互作用的w w 结构域，d k r8 的w w 结构域很可能是与 d r o s h a 的n 端脯氨酸富集区发生相互作用的部位。d g c r 8 是染色体的2 2 q 11 2 的预测的3 0 个基因中的一个在人类最常见的遗传综合征d i g e o f g e 综合征中 非等位性缺失。所以，有人推测d i g r 鲋综合征的发病可能与人类m i r n a 的加 工和表达过程的紊乱有关p “。 d i c e r 酶也是内切核酸酶r n a s e l l t 家族成员，已发现在c a r a b i d o p s i s ，ce l e g a n s ， s c h i z o s a c c h a r o m y c e s 即m 抛以及哺乳动物中也存在d i c e r 同类物，包含四个0 r f 框架( 图1 4 a ) ：d e x h d e a h 区解旋酶、p a z 、两个r n a , 辩i i i 催化区与双链k n a 结合区d s - r b d 。对它的最早认识是来自对r n a 干涉过程中s i r n a s 的产生的研 究，后来表明它在m 诹n a 的成熟过程中起着同样重要作用。近来通i t x 射线晶 体衍射分析及核磁共振( n m r ) 获得了p a z 结构域的三维立体结构，表明它具有异 常的o b 折叠结构，其与核酸的亲和性较弱但持久【3 ”，研究发现，p a z 结构域 具有一条由两个亚结构域所形成的沟，可能是k n a 结合区。其中一个亚结构域 具有一个由五条多肽链组成的开放b 桶芯结构，两条螺旋位于桶的两个末端，以 及另一条链位于桶的外表面。另个亚结构域是由连有n 螺旋的b 发夹结构组成。 7 第1 章引言 而d i c e r 酶是通过p a z 结构域与p 聆- m j r n a 之间的相互作用而行使切割功能的 删( 图1 4 ) 。 图1 4a ：d i c e r 的三维立体结构图b ：d i c e r 加工位点示意图c ：d i c e r 结合r n a 双链示意图 f i g 1 4a ：t h e3 dd r a w i n go fd i c e rb ：t h ed i a g r a mo fd i c e r 口兀s ss i t ec ：t h ed i a g r a mo fd i c e r b i n dw i t hr n a 植物m i r n a 的成熟过程与动物有所不同，因为植物中没有d r o s h a 的同源类 似物。拟南芥的基因组编码4 种类d i c e r 酶( d c l i - d c l 4 ) 。其中d c l l 与m i r n a 的合成相关，d c l 2 和d c l 3 分别参与了由病毒引起的小干扰i 斟a 和内源性 s i r n a ( 反转座子s i z n a ) 的合成。d c l l 是植物m i r n a 成熟过程中类似于d i c e r 8 第l 章引言 的蛋白质，它是位于核内的。这就说明在植物中可能有其他酶( 很有可能是d c l l ) 行使了d r o s h a 的功能，对m i r n a 的转录初产物进行第一次切割，并且决定了 成熟的m i r n a 的序列。但在植物中通常很难检测到p m - m i r n a ，即使在d c l l 突 变的植物中也很少检测到。拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 作为植物中的一种模式 生物，对其m i r n a 的研究是最多的。最近，对拟南芥m i r l 6 3 的研究进一步揭 示了植物m i r n a 的成熟过程。拟南芥m 诹1 6 3 是单独转录的，由鼢擒聚合酶 催化合成，其转录初产物p r i - m i r l 6 3 需要经过核糖核酸酶样的酶切割三次才能 成为成熟的m i r n a 。 1 3 4 微处理器对p r i - m i r n a 的剪切机制 d r o s h a 对p r i - m i r n a 转录本进行特异性识别的机制尚未完全明了。研究发现 d r o s h a 对发夹状茎环结构有一定的亲和力，而且d s h a 也通过一些可以特异识别 研m h r n a 的中介因子而招募p r i - m i r n a 到其剪切位点上进行剪切。p a s h a 郎为 一种已经发现的有助于d r o s h a 进行底物特异性识别的蛋白质。h a r t 等提出了关 于p r i - m i r n a 剪切机制的“一个加工中心”的模型。该模型认为d r o s h a 与p a s h a 形 成异二聚体，对p r i m i r n a 的茎环状结构部分进行剪切。其中，d r o s h a 结合在 远离末端环的双链r n a 上，两个r n a m 结构域( r i d a 和r i i i d b ) 形成分子内 二聚体。构成一个加工中心，船工中心中的两个活性位点紧密相邻，在距离末 端环约两个螺旋转角的地方，在相反方向上剪切r n a 链上邻近的磷酸二酯键。 r i d a - - 侧的催化位点催化3 链的剪切，而i i d b 一侧的催化位点则催化5 链的 剪切。活性中心位点由对应于超耐热菌a q u i f e xa e o l i c u s 的r n a s ei h 中谷氨酸 f a 0 、天冬氨酸d 4 4 、d 1 0 7 和e 1 1 0 。而p a s h a 则结合在靠近末端环状结构的部分， 有助于蹦- m i r n a 的识别及微处理器在底物分子上的定向1 4 z 】。 1 3 5p r e - m i r n a 的细胞核输出 d r o s h 耐p r i 如i i 斟a 加工完毕之后，产生的p 他珂i i r n a 需要输出到细胞浆中， 才可以在d i c e r 作用下生成大约2 2m 大小的m i r n a 双链。这一输出过程需要 p r e - m i r n a 在核孔转运受体的作用下穿过位于核膜上的核孔复合体，而进入细胞 浆中。现在已经确定进行p r e - m i r n a 输出的主要核孔转运受体为e x p - 5 。除此之 外，e x p - 5 可少量地输出t r n a 和腺病毒r n a 。e x p - 5 对底物进行识别的特异性 9 第1 章引言 是由底物所具有的特征性“微小螺旋”所决定的，与序列无关。该螺旋中包含 有大于1 4 b p ( 碱基对) 的茎部和3 8 m 的3 端悬垂，而p r e - m i r n a 所具有的类似的茎 部结构和大约2n t 的3 。端悬垂使得e x p 5 对其的亲和力远远高于其他两种底物， 而且p r c - m i r n a 在细胞中的含量相当高，所以很可能p r e m i r n a 就是e x p - 5 进行 输出的主要底物。e x p 5 与r a n g t p 以及p r e m i r n a 形成异三聚体，通过核孔到达 胞浆后，r a n - g t p 转变为r a n - g d p ，释放出口陀m i r n a 。此外，还发现p r e - m i r n a 与e x p - 5 结合之后还可以稳定口凭m i r n a l 3 5 - 4 0 i 。 1 4m i r n a 的作用机制 m i r n a 能够通过两种沉默机制中的一种指导r i s c 下调目的基因的表 达：m r n a 的切割或翻译抑制。如果m r n a 与m i r _ n a 具有完美的互补性，m i r n a 就指导m r _ n a 特异性切割，或者如果两者没有足够的互补性则m i r n a 就指导 翻译抑制( 图1 5 ) 。 图i 5m i r n a 的两种作用方式 f i g1 5t w o k i n d so f e f f e c to f m i r n a 1 4 1n l i r n a 指导靶m r n a 的切割 大多数植物m i r n a 与靶序列的开放阅读框( o r f ) 完全匹配，因而在植物中， m i r n a 主要进入r n a 干涉途径以降解靶分子。植物中的r i s c 是由 a r g o n a u t e ( a g o ) 蛋白，m i r n a 或s k r n a 及相关蛋白组成。a g o 蛋白具有与 d i c e r 酶一样的p a z 结构域以及p i w i 结构域。p i w i 结构域具有与r n a h 类似的结 1 0 第1 章引言 构。据报道，m i r n a 的3 ，末端位于p a z 结构域的亲水性结构域内，而靶分子位于 p 玛，i 结构域中，两者识别互补之后，r n a 酶水解作用于靶分子中与m i r n a 的第 1 1 或第1 2 碱基所对应的残基的磷酸键，随后降解靶分子的5 端序列。因而当 m i r n a 指导切割时，切点的位置是由相关的m i r n a 的残基所决定，即从配对区 的中部向m r n a 的57 方向切割。在植物中，两者完全匹配在大多数情况下是引起 切割，但是有时并非如此，m i r - 1 7 2 与m i r - 1 7 2 样基因与靶分子完全匹配却产生 翻译抑制。研究人员发现，经过切割之后，靶分子上与m i r n a 匹配位点相邻的 序列会产生内源性的s 很n a ，以增强沉默效应。m i r n a 切割之后，删a 仍然 是完整的，而且能够引导其他的m r n a 的识别和切割 3 1 - 4 e l 。 1 4 2m i r n a 指导翻译抑制 通常动物m i r n a 与靶m r n a 的3 ，u t r 部分序列反向互补结合。与r n a i 不同 的是靶面淑a 的稳定性不受影响，而其翻译起始后的表达受到影响。这种新的 调控机制首次在线虫的 i n - 1 4 m r n a 得到证实，l i n 1 4 m k n a 受l i n - 4m i r n a 的调 控。m i r n a 可能抑制翻译的延伸或终止，或降解核糖体新合成的新生肽链。然 而简单地影响翻译延伸是不可能的，因为未受到抑制的多核糖体的形态与由 m i r n a 抑制的靶m r n a 的多核糖体的形态是相同的。当l i n - 1 4 蛋白水平下降时， 难以区分处于线虫幼虫第一阶段和幼虫后期阶段的l i n - 1 4i z f l l n a 的多核耱体外 型。具体的调控机制目前还不是很清楚，有待于科学家进一步研究。多数m i r n a 是以m i r n p 形式与靶m r n a 结合并使之抑制。最近研究人员发现，处于不稳定状 态的m r n a 的y u t r 中的富含a u 元件( a r e s ) 能够指导m r n a 的降解。参与 m i r n a 加工和功能行使的蛋白，即d i c c r - i ，a g o l 和a 9 0 2 是a 肿瘤坏死因子m r n a 快速降解所必需的，该m r n a 含有a r e s 元件。人的m i r - 1 6 具有与a r e s 互补的 u a a a u a 删序列，它使得具有a r e s 的r n a 易于降解p7 - 4 0 i 。 1 4 3 靶分子的识别 线虫f i n - 1 4 的3 u t r 具有与l i n 4m i r n a 的5 区域互补的核心区域，这说明多 细胞动物m i r n a 5 端互补的重要性。这可从以下事实得到支持：( 1 ) 几种无脊椎动 物的m i r n a 的2 8 残基与靶m r n ay u t r 是完全互补的。( 2 ) 在第一个确认 的无脊椎动物的m l r n a 与靶分子的互补位点之间，m r n a 与m i r n a 2 8 残基配 第1 章引言 对的部分在其它种类的同源信息中是完全保守的。一个邻近的至少六个碱基对 的螺旋几乎总是出现在这个区域。( 3 ) m i r n a 的2 8 残基在同源的后生动物 m i r n a 中是保守的。( 4 ) 预测哺乳动物m i r n a 的靶分子时，要求跨越m i r n a 2 8 残基的七聚体具有完全的碱基配对，比要求m i r n a 的其它任何一个七聚体的配 对更有效率如果不考虑互补位点其它区域的互补程度，与核心区域的错配就 可抑制起始时对靶分子的识别，因而阻止了切割或翻译抑制。如果同时允许 l n i r n a 的其余部分有足够的配对，将产生切割作用。然而仅由一些侧翼配对来 补充核心配对，再与r i s c 共同作用，足以介导翻译抑制 2 3 - 3 8 j 1 4 4 快速脱腺苷酸化 w u 等人以m i r - 1 2 5 b 和l e t 7 两种代表性的m i r n a 为研究对象以启动子荧 光素酶或b 球蛋白为报告系统发现它们能够促进r n r n a 聚腺苷酸尾e ( p o l y at a i l ) 的去除。研究人员用3 组蛋白茎环结构取代聚腺苷酸尾巴，结果发现不但可以 消除m i r - 1 2 5 b 对m r n a 含量的影响，还可以降低对蛋白质合成的作用。由此可 知，m i r n a 通过降低翻译效率和聚腺苷酸化m r n a 的浓度来抑制基因表达远比 阻遏翻译强而全面。而且，不像翻译阻遏那样导致m r n a 的解体是不可逆圳”4 2 j 。 1 5m i r n a 的生物学功能 m i r n a 是通过与靶m r n a 的3 帆碱基配对的方式来执行对靶m r n a 的 转录翻译抑制的功能。l i n - 2 4 和l e t - 2 7 在线虫发育中起着时序调控的作用。这两 个基因或它们的靶基因发生突变会造成线虫发育的形态突变。 1 5 1m i r n a 在动物中的作用 在动物中，m i r n a 与靶m r n a 进行不完全配对以执行转录后翻译抑制的作 用但是如果动物m i r n a 与靶序列完全互补，则进入r n a 干扰路径指导靶序列 降解。近来，在筛选果蝇生长缺陷突变株的过程中发现t b a n t a m 基因座。该基 因座编码了果蝇幼虫抑制程序性死亡和促进细胞增殖的m i r n a 。b a n t a mm i r n a 大量表达并抑制h i dm r n a 的翻译。h i d 是程序性死亡的主要激活因子。b a n t a m 类似于线虫的m i r 8 0 8 2 ，这表日j l m i r 8 0 家族能控制线虫的细胞死亡和增殖田m j 。 第1 章引言 动物中的m i r n a 还能影响细胞分化。m i r 2 3 与h e s l 基因具有较完美的互补性 ( 大约7 7 ) 。h e s l 是一种基本的螺旋环螺旋结构。它只在未分化细胞中表达。 将人工合成的m i r 2 3 加到未分化的n t 2 神经细胞中，可以发现细胞内的h e s l 水平 大幅下降。但是将人工合成的m i r 2 3 突变体加入到未分化n t 2 细胞中，h e s l 水 平保持不变，且其含量与将野生型m i r 2 3 加入到己分化的n t 2 细胞中是一样 的。这表明m i r 2 3 在翻译水平上抑$ 1 h e s l 基因的表达，影响细胞分化【帕j 。最近 k u a n ga l 等人发现，在小鼠胚胎干细胞( e s ) 中编码d i c e r 酶的基因d i c e r l 缺失后， e s 细胞失去了分化功能，同时染色体着丝粒区域的重复序列的沉默效应以及小 片段d s r n a 的表达量显著降低。这说明n l i i 矾a 参与了e s 细胞的分化，着丝粒 区域异染色质的形成。研究表明，小鼠m i r 2 3 7 5 的表达会抑制葡萄糖诱导的胰 岛素分泌，但是并不改变葡萄糖代谢或细胞内c a 2 + 信号强度。通过r n a i 将 m i r - 3 7 5 的靶分子m 唧1 沉默，发现产生的效应与m i r 3 7 5 的作用效果一致【4 7 一i s l 。 有研究以人的一种结缔组织细胞脂肪细胞( a c u p o e y t e ) 为实验对象，从8 6 个候 选m i r n a 分子中筛选出了对箕分化有促进作用的m i r - 1 4 3 分子，同时运用生物信 息学方法预测了m i r - 1 4 3 的作用靶点，并结合w e s t e r n 印迹技术，检测了它的预测 靶点e r k 5 b m k l 蛋白( 一种参与细胞增殖和分化的蛋白) 的表达情况，发现细胞 分化后该蛋白的表达呈上调趋势，但是鉴于m i r n a 的调节有可能是多位点进行 的，因此还不能确定