（生物化学与分子生物学专业论文）缩氨基硫脲的合成与生物学效应研究.pdf

缩氨基硫脲的合成与生物学效应研究 摘要 酪氨酸酶( e c 1 1 4 1 8 1 ) 是一种含铜的氧化还原酶，广泛存在于微生物、 动植物以及人体内，能将酪氨酸转化成多巴醌，进而形成黑色素；过量的黑色素 形成能产生色素沉着性疾病以及能使果蔬褐变，因此，研究酪氨酸酶抑制剂具有 十分重要的意义。 本论文设计合成了7 种缩氨基硫脲类化合物，并且研究了合成抑制剂对单酚 酶和二酚酶的抑制作用机理。再以粗提的小鼠b 1 6 细胞的酪氨酸酶为研究对象， 筛选该酶的抑制剂。以小鼠b 1 6 黑色素瘤细胞为研究对象，研究了合成的缩氨基 硫脲类化合物对细胞增殖率、酪氨酸酶活性、黑色素含量以及酪氨酸酶、t r p 1 、 t r p 2 蛋白的m r n a 转录水甲的影响。研究结果和内容如下： 采用乙醇与水作为溶剂，冰醋酸作为催化剂，在加热回流的条件下成功的合 成了7 种缩氨基硫脲类化合物，并采用质谱和核磁共振对结构进行了鉴定。 选择了糠醛缩氨基硫r ( a 1 ) 、对氰基苯甲醛缩氨基硫脲( a 2 ) 、对氯苯甲醛缩 氨基硫n ( a 3 ) 、4 甲氧基肉桂醛缩氨基硫脲( ) 、2 , 4 二羟基苯甲醛缩氨基硫脲 ( a 5 ) 、3 ，4 二羟基苯甲醛缩氨基硫脲( 、3 一溴4 羟基5 甲氧基苯甲醛缩氨基硫 脲( a 7 ) 作为效应物，研究了它们对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的影响，结果表明， 所有化合物均具有较好的酪氨酸酶二酚酶抑制活性。 选择t ( a l 卜( a 7 ) 作为效应物，研究了它们对蘑菇酪氨酸酶单酚酶活力的影 响，结果表明，除了3 , 4 二羟基苯甲醛缩氨基硫脲( a 6 ) 外，所有化合物均具有不 同程度的酪氨酸酶单酚酶抑制活性，并对其对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制机理和 抑制类型进行了深入的研究。 选择了( a 1 ) 弋a 7 ) 作为效应物，研究了它们对b 1 6 细胞酪氨酸酶粗提液活力 的影响，研究表明，效应物都对蘑菇酪氨酸酶有较好的抑制效应，由于其苯环上 的取代基不同，其抑制效应也有差异。 选择y ( a l h a 7 ) 作为效应物，研究了它们对菜青虫酚氧化酶粗提液活力的影 响，研究表明，效应物都对蘑菇酪氨酸酶有良好的抑制效应，由于其苯环上的取 代基与取代位置不同，其抑制效应也有差异。 分别以化合物对氯苯甲醛缩氨基硫脲似，) 与3 溴4 一羟基一5 甲氧基苯甲醛缩 氨基硫脲( a 7 ) 作为效应物，研究了其对黑色素生成量、体内酪氨酸酶活力与细胞 1 缩氨基硫脲的合成与生物学效应研究 毒性进行了评估，结果表明，这两种化合物对b 1 6 细胞均表现出一定的效应。 进一步研究了( a 7 ) 对t 己、t i u 1 、t r p 2 在转录水平的影响，结果表明，当化 合物( a 7 ) 的浓度为4 0g m o f l 时，对酪氨酸酶、t i 冲1 与t i 冲2 的转录均下降了 4 0 左右。 关键字：缩氨基硫脲；生物学效应；酪氨酸酶；b 1 6 细胞 2 缩氮基硫脲的合成与生物学效应研究 a b s t r a e t t y r o s i n a s e ( e c 1 14 18 1 ) ，ac o p p e r - c o n t a i n i n gr e d o x i d a s ee n z y m e ，i sw i d e l y d i s t r i b u t e di nm i c r o o r g a n i s m s ，a n i m a l s ，p l a n t sa n dh u n m a nb e i n g s i ti sr e s p o n s i b l e f o rt r a n s f o r m i n go fl - t y r o s i n et od o p a q u i n i n e ，w h i c hc a np r o d u c em e l a n i ni na s e r i e ss t e p s t h ea b n o r m a lf o r m a t i o no fm e l a n i nm a yb r i n go u ts e r i o u sd i s e a s e si n h u m a n b e i n g sa n db r o w n i n gi nf r u i t sa n dv e g e t a b l e s ，s o ，i t so fg r e a ti n t e r e s tt oi n h i b i t t h ea c t i v i t yo ft y r o s i n a s e i nt h i ss t u d y , s e v e nc o m p o u n d sc o n t a i n i n gs u l f u rw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d t h ei n h i b i t o r ye f f e c t sa n dm e c h a n i s mo ft h e s e s y n t h e t i c a lc o m p o u n d sh a db e e n e l u c i d a t e d t h e n ，s o m et y r o s i n a s ei n h i b i t o r sw e r es c r e e n e do u tt h r o u g hs t u d y i n gt h e i r i n h i b i t o r yc a p a c i t i e so np r e p a r e dc e l l - f r e et y r o s i n a s ef r o mb 16m e l a n o m ac e l ll i n e t h eb16c e l l v i a b i l i t y , t y r o s i n a s ea c t i v i t y , m e l a n i nc o n t e n ta n dm r n al e v e l so f t y r o s i n a s e ，t r p 一1 ，t r p - 2w e r ea s s a y e di np r e s e n c eo fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f t h i o s e m i c a r b a z o n e s ，n l ec o n t e n t sa n dr e s u l t sl i s t e da sf o l l o w s ： c h o o s ee t h a n o la n dw a t e ra ss o l v e n t ，a c e t i ca c i da sc a t a l y s t ，7t h i o s e m i c a r z o n e s c o m p o u n d sw e r es u c c e s s f u l l ys y n t h e s i z e d ，a n d t h e i rc h e m i c a ls t r u c t u r e sw e r e e l u c i d a t e db ye s i m sa n dn m r t h ei n h i b i t o r ym e c h a n i s m so ft h ea l l7s y n t h e t i c a lc o m p o u n d so nm u s h r o o m t y r o s i n a s ed i p h e n o l a s ew e r es t u d i e d ，a n dr e s u l t ss h o w e dt h a t a l lo ft h e mw e r e p o t e n t i a lt y r o s i n a s ei n h i b i t o r s f u r t h e r m o r e ，t h ei n h i b i t o r ym e c h a n i s mo ft h e s e c o m p o u n d sw a ss t u d i e d a n dc o r r e s p o n d i n gi n h i b i t i o nc o n s t a n t sw e r em e a r s u r e d t h ei n h i b i t o r ye f f e c to fa l l7s y n t h e t i c a lc o m p o u n d so nm u s h r o o mt y r o s i n a s e m o n o p h e n o l a s ew e r es t u d i e d ，r e s u l t ss h o w e dt h a ta l lo ft h e me x c e p t3 , 4 一d i h y d r o x y - b e n z a l d e h y 7 d e s e m i t h i o c a r z o n ec a nd e c r e a s et h et y r o s i n a s em o n o p h e n y l a s ea c t i v i t y t h ei n h i b i t o r ye f f e c to fs e m i t h i o c a r b o z n e so np r e p a r e dc e l l f r e et y r o s i n a s ef r o m b16m e l a n o m ac e l ll i n e a n df r o mc a r b a g eb u t t e r f l yw e r ei n v e s t i g a t e d ，r e s u l t ss h o w e d 3 缩氨摹硫脲的合成与乍物学效应研究 t h a tt h e s ec o m p o u n d sc a ni n h i b i tt h et y r o s i n a s ea c t i v i t yi nd i f f e r e n te x t e n t i nt h ee n d ，t h ei n h i b i t i o no fm e l a n i n g e n e s i sb yc o m p o u n da 3a n da 7w e r e i n v e s t i g a t e d ，w h i c hp r o v i d e af o u n d a t i o no ft h e s e c o m p o u n d s u s a g e a s s k i n - w h i t e n i n ga g e n t s k e yw o r d s ：t h i o s e m i c a r b a z o n e ，b i o a c t i v i t y , t y r o s i n a s e ，b16m e l a n o m ac e l ll i n e 4 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体己经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为( 凉纷 ) 课题 ( 组) 的研究成果，获得( 验室的资助，在( 匆誓 ) 课题( 组) 经费或实 ) 实验室完成。( 请在以上括号内 填写课题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以 不作特别声明。) 声明人( 签名) ：乃a 嘲c t - a - 酗 谢年占只 ze t 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 () 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“ 或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ：夕当看稻 诉月日 缩氨基硫脲的合成与生物学效应研究 1 前言 1 1 缩氨基硫脲类化合物 1 1 1 缩氨基硫脲类化合物研究概况 缩氨基硫脲类化合物是由氨基硫脲与相应的醛或酮缩合形成的一类席夫碱 类化合物1 1 1 ，其结构式如下图所示： h 飞n n n h 2 s 图i 缩氨基硫脲类化合物的结构式 f i g ic h e m i c a ls t r u c t u r eo f t h i o s e m i c a r b a z o n e 缩氨基硫脲类物质具有广泛生物活性 2 - 4 ，在医药和农药界备受关注。当它 带上不同的取代基团，它可具有抗菌性，抗真菌，抗病毒，抗肿瘤，抗寄生虫等 生物活性。许多芳香醛( 酮) 和杂环醛( 酮) 缩氨基硫脲均具有很好的抗菌和抗 癌活性，并且它们的抗菌和抗癌作用广，还可以通过在芳杂环醛( 酮) 的环上引 入不同的取代基使它们的抗菌和抗癌活性得到改善。因此，取代苯甲醛缩氨基硫 脲类化合物已引起广大药学和化学工作者研究的兴趣。 1 1 2 缩氨基硫脲类化合物的应用 目前，缩氨基硫脲类化合物在医药学与分析化学领域有着广泛的应用。在医 药学领域，人们主要关注此类化合物的抗菌与抗肿瘤活性等领域。 1 9 9 8 年，毕思玮等用联苯乙酮与氨基硫脲合成了联苯乙酮缩氨基硫脲，该 化合物具有一定的杀菌活性【5 】。2 0 0 5 年，李锦州等报道了呋喃甲酰基吡唑啉酮缩 氨基硫脲对金黄葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、白菜软腐病菌、菜豆荤疫菌等 具有一定的抗菌活性1 6 1 。2 0 0 6 年，j o s e p hm 等合成了2 吡啶苯甲酰缩n 4 苯基 氨基硫脲及其铜配合物，经测试它们的杀菌活性，取得了较好的效果【7 1 。李清寒 等将杂环吗啉、哌嗪或n 单取代哌嗪引入到个芳香醛( 酮) 缩氨基硫脲化合物， 其中吗啉类化合物有较强的抑菌活性，哌嗪类化合物有较强的抗癌作用【引。2 0 0 7 年，另有报道偶氮芳基水杨醛缩氨基硫脲衍生物在不同的浓度下对植物的生长调 节表现出一定的规律性【9 】。 5 缩氨皋硫脲的合成与， i 物学效应研究 r i c h a r d s o n 综述【l o 】了铁离子螯合剂在肿瘤化学治疗中的应用，指出缩氨基硫 脲类化合物是极好的核苷二磷酸还原酶( i 水) 抑制剂，通过对r r 的抑制，从 而影响d n a 的合成与修复，从而具有抗肿瘤活性。z h a n gz j 1 1 】等报道了3 氨基 2 吡啶醛缩氨摹硫脲( 3 a p ) 在脑缺血治疗中的应用，并推断了其作用机理， 认为3 一a p 通过减少钙离子与活性氧簇( r o s ) 的积累而具备神经保护作用。 1 2 酪氨酸酶 1 2 1 酪氨酸酶的概述 酪氨酸酶( e c 1 1 4 1 8 1 ，t y r o s i n a s e ) x 称为多酚氧化酶、酚氧化酶等，是多 亚基的含铜的氧化还原酶，是生物体合成黑色素的关键酶和限速酶，通过其活性 的调节可以控制黑色素生成量，从而对生物体内黑色素水平及相关代谢途径产生 影响。酪氨酸酶在生物体中具有重要的生理功能，除了形成动物皮肤中的保护性 黑色素【1 2 , 1 3 外，它还与昆虫的伤口愈合与发育【1 4 】，果蔬的褐变有密切关系【1 5 。1 7 】。 因此多年来，酪氨酸酶一直受到国内外的关注，其研究涉及生物、医学、农学、 化学、药学等多个学科和领域。 1 2 2 酪氨酸酶的结构 酪氨酸酶的活性中心由两个含铜离子位点构成【1 6 】。在催化过程中，双核铜 离子位点以三种形态存在，分别是氧化态( e o 驯) 、还原态( e m d ) 、脱氧态( e d e o x y ) ( 见图i i ) 【1 7 】。研究表明，酪氨酸酶的双核铜离子活性中心与在血蓝蛋白中发 现的活性中心非常相似【1 8 】。由x 射线吸收光谱( x a n e s ) 分析，酪氨酸酶和血 蓝蛋白含铜活性中心主要的构象变化基本相同，铜离子位点的几何构型是可变 的。由血蓝蛋白氧化态结晶学【3 3 】和e x a f s t 3 4 j 的研究c u - c u 键长约为3 5 a 。这 与由酪氨酸酶的晶体结构得到的结论相近，c u c u 键长为3 4 a 【2 1 1 。每个二价铜 离子构型为正四棱锥状正四棱锥状，受到两个强的赤道面配位原子的调控和一个 相对较弱的轴向n h i 。配基的调控，形成5 个配位键。其电子构象为3 d 9 1 9 】。即 与蛋白上的组氨酸残基上的氮原子形成3 个配位键，外源氧分子作为过氧化物与 铜离子形成两个配位键占据了铜离子的两个赤道面位置，并可作为两个铜离子之 间的桥连配体。氧活键占据了铜离子的两个赤道面位置，并可作为两个铜离子之 间的桥连配体。氧活性中心铜离子的结合模型为研2 ：r 2 ，所以e o , , y 活性中心可 以写成c u ( i ) 0 2 c u t l ) ，但通常更适合用过氧化态c u ( i i ) 0 2 c u ( i i ) 表示【2 0 l 。过氧 6 abr 图i i 酪氨酸酶活性中，t j 9 3 氧一铜离子态( a ) 、铜离子态( b ) 、亚铜离子志( c 礴犁 f i gi im o d e lo f t h ea c t i v es i t eo f t y r o s i n a s e 化物的屯子结构对于e 的生物功能很重要。由于受强的a + 受体作用，过氧化 物带有较少的负电荷，而电子受体与过氧化物的a + 轨道上的电子作用，大大 的削弱了氧氧键，使之容易断裂。 还原态酪氨酸酶与氧一铜离子态相似，都含有两个叫角形的反磁铜离子，小 h 的是，桥连配体是氢氧化物。每个亚铜离子电子构蒙为3 d ”1 1 9 ，分别与两个 吲哚上的氯原予形成两个键长为19 a 的配位键，与第三个吲哚卜的氮原子形成 键长为27 a 的配位键，环绕c u c u 轴形成近似c 3 v 的对称结构1 2 ”。由酪氨酸酶 还原态结晶学的研究，酪氨酸酶存在两种铜离子形态e 。i 型和e 雠t l l 型，i 型 和儿型的c u c u 键长分别为3 9 和33 h i ”】。当加入过氧化物酶从e 【l 】。变为e 删； 当缺少过氧化物时，酶由e o 。，变为e m e t 纯化后得到的酶是f 1 3 _ 8 5 的e 腓t 和! 1 5 的e 。，组成的混合物。 脱氧态酪氨酸酶含有一个2 价铜离子和一个1 价铜离子i 。2 价铜离子含有 未配对的电子，由电子顺磁共振分析，未配对的电子占据一个如柚轨道。根据 两个铜离子之间电r 离域的电子顺磁共振和可见光谱特征，证明在两个铜离子之 间同样有桥连配体的存在。通过对亚铜离子态血蓝蛋白的研究表明：e 。一的活 性叶 心由两个一价铜离子组成【”i 。由酪氨酸酶亚制离子态结晶学的研究，c u - c u 键k 约为41 a ，铜离子的几何构型与铜离子态的铜离子构型相似m i 。 2 0 0 6 年，m a t o b a 等存大肠杆菌表达酪氨酸酶和o r f 3 7 8 蛋白，得到了第- 个酪氨酸酶晶体1 。与儿茶酚氧化酶类似，酩氨酸酶也是由7 个t 1 螺旋和一些b 一折 叠组成，4 + a 螺旋位于蛋白的核心( a 2 、a 3 、a 6 、a 7 ) ，酶活| 生中心则位于q 螺旋巾。活性中一l c u a 分别与h i s mh i s 5 4 $ 口h i s 形成配f t 键，c u b 分别与h i s 】咿 络磐豪县褡 缩氪摹磕腮的台成与十物学效应研究 h i s l 9 4 和h i s 2 1 6 形成配位键。除j h i s 5 4 ，铜离子的h i s 配体均来自于螺旋2 、a 6 和7 ，并且h i s s 。没有与硫原子形成类似于儿茶酚氧化酶活性中心的硫醚键，所以 h i s s 一易变动，而导致c u a 比c u b 易于变动。酶双铜活性中心位于由疏水氨基酸残 基组成的口袋的底部。 图儿荼酚氧化酶和酪氪酸酶的晶体结构 代表儿茶酚氧化酶：6 - 红色 代表酪氨酸酶扯蓝色代表o r f 3 7 8 f i g mo v e r a l ls u u c t l l r eo fc a t e c h o o x i d a s 咖) a n dw o s i n a s ec o m p l e x e d w i t ho r f 3 7 8 ( b 1 1 2 3 酪氨酸酶的催化机制 酪氨酸酶具有双重催化活性，它催化两种不同的反应：羟基化单酚生成二酚 ( 单酚酶活性) 和氧化二酚生成醌( 酚酶活性) ，两个反应都需要氧分子的参 与口3 1 。 根据酪氨酸酶催化双酚和单酚的反应机制，陈清西教授 2 4 2 5 1 曾提出其反应动 力学模型( 图i v ) 。如图i v 所示，氧化态的酶( e 州) 具有单酚酶活力和二酚酶活 力。羟基化单酚，产生e | n d 。此时酶既可以氧化双酚生成醌，由e 州转变为e a e o 。； 又或者释放双酚，e 州结合单酚生成e i | l m 。如果形成的醌很不稳定，当多巴配 存在的时候，双酚可以在反应体系中重复使用，参与一系列的循环反应。这个反 应机制，包括了e 嘣向e 0 x v 的转变和迟滞时间的产生，迟滞时间是酪氨酸酶酶 活性的特征 2 6 - 2 8 l 。研究发现，双酚浓度与反应体系中最终产物的形成有关鲫。 因为迟滞时间的存在，先形成一种假稳态中间产物，随着双酚浓度的增大，酶转 缩氨慕硫脲的合成与生物学效应研究 变为最终稳定状态。 e 。矿m 寺e o x y i i 蚴炉 q e m e t - d 皇e m 。t ；堂兰ke 眦t m k 7 d k - 8 图酪氨酸酶的反应机制 f i g i v r e a c t i o nm e c h a n i s mo f t y r o s i n a s e 1 2 4 酪氨酸酶与黑色素形成 黑色素的合成是一个复杂的酶催化和非酶催化过程，其过程可大体分为两个 阶段： 第一阶段是由酪氨酸酶催化酪氨酸被羟化反应形成l 一3 ，4 二羟基丙氨酸 ( l 多巴) ( 单酚酶活性) ，并进一步将l 多巴氧化生成多巴醌( - - 酚酶活性) 。这两步 反应都是由酪氨酸酶催化的，酪氨酸酶在这里显示了独特的双重催化功能。 第二阶段从多 辊( d o p a q u i n o n ) 为原料从两个不同途径分别生成真黑素 和褪黑素的过程。对于真黑素生成，多巴醌经多聚化反应等一系列反应生成无色 多巴色素，极不稳定的无色多巴色素被另一分子多巴醌氧化为多巴色素，多巴色素 经异构、脱羧生成5 ，6 - - - 羟基吲哚( d h i ) ，5 ，6 - - - 羟基吲哚( d h i ) 由酪氨酸酶催化 氧化为真黑色素的前体吲哚5 ，6 醌( i n d q u ) ；对于褪黑素生成，多巴醌 ( d o p a q u m o n ) 与半胱氨酸( c y s ) 反应生成产生5 - c y s 一多巴及5 - c y s - 多巴醌，然后 成环、脱羧变成苯肼噻嗪的衍生物，最后形成褪黑素【2 3 1 。 9 缩氨基硫脲的合成与生物学效应研究 p 勺亭舻芋p 智 b 呐i 膳l i d 。p 曩 一艇一 戈赫 孓一 图v 黑色素的生成途径【2 3 1 f i g u r ev p r o g r e s so ff o r m a t i o no f m e l a n i n 在黑色素的生物合成过程中，酪氨酸酶( t y r ) 、酪氨酸酶相关蛋白i ( t r p 1 ) 、 酪氨酸酶相关蛋白2 ( t r p 2 ) 扮演着重要的角色。这三个蛋白均是与膜结合的糖蛋 白，核苷酸序列有7 0 - - 一8 0 的相似性，氨基酸序列则有3 0 - 4 0 的相似性，都 具有m b o x 结构，在结构上将这三个蛋白归为同一个蛋白家族酪氨酸酶蛋 白家族【8 。1 2 1 。t r p 1 ，具有d h i c a 氧化酶活性，可催化d h i c a 形成吲哚醌羧 酸。t r p 2 ( d c t ) 具多巴色素自体异构酶( d t ) 活性，可催化多巴色素生成性 质稳定的d h i c a ，并决定着中间产物d h i c a 和d h i 的比例，由于d h i 在体内 比d h i c a 有较高的细胞毒性，而d t 能使d h i c a 迅速掺入生物合成的黑色素 内，对减少这些中间产物的细胞毒性有着重要意义。 1 2 4 酪氨酸酶活力的研究方法 酪氨酸酶具有单酚酶与二酚酶活力，其活力的测定有着不同的测定方法。现 1 0 f 胁广孙 群r j 呻 五 犯 i 一 姒 茁一 缩氨基硫脲的合成与生物学效应研究 阶段酪氨酸酶活力的测定主要为光谱法，通过选择合适的底物，使其在酪氨酸酶 的催化下，生成相应的稳定的醌类化合物，监测其产物的特征吸收波长的变化， 从而计算酶的活力。 根据生成产物的不同类型，底物可以分为以下4 类： 第一类底物可以生成稳定地邻醌产物，4 叔丁基邻苯二酚( t b c ) 是这类底 物的代表【2 9 1 ，这类底物可以准确的测得产物生成量与反应初始速度，然而这种 底物仅适用于二酚酶活力的测定。 第二类底物可以生成稳定的耦联产物，这类产物通常生成不稳定的邻醌产 物，但是可以再经一步反应生成稳定的产物。3 。4 二羟基扁桃酸( d o m a ) 、 l d o p a 、多巴胺与3 , 4 二羟基苯丙氨酸甲酯等均为此类底物【3 0 。3 3 1 。动力学分析 表明，此类底物测得的表观速度y 与真实的酶活力直接相关。此类底物不仅可 以通过监测其稳定产物的产物来求得二酚酶活力，也可以监测单酚酶活力。 第三类底物可以生成稳定的亲核加成产物，这类底物通常不稳定的邻醌产 物，这种邻醌产物容易与亲核试剂反应，定量的生成显色产物，这类底物包括脯 氨酸【3 4 】与m b t h 3 5 。4 1 1 。动力学研究表明，以脯氨酸与m b t h 为底物生成显色产 物的量与初始反应速度有着线型关系，其斜率等于0 2 ，这类底物也可以用以监 测单酚酶与二酚酶活力。 第四类底物可以生成不稳定的邻醌产物，该产物仅能通过抗坏血酸还原来定 量，通过光谱法或显色法直接或间接监测还原邻醌所消耗的抗坏血酸【4 2 埘1 的量， 从而求得酶活力，该法也仅适用于二酚酶活力的测定。 目前，广泛采用的方法是分别以l 酪氨酸与l d o p a 作为单酚酶和二酚酶 的底物，监测产物波长4 7 5n m 处的光吸收变化，从而获得酪氨酸酶的信息。 1 3 酪氨酸酶抑制剂研究进展 1 3 1 酪氨酸酶抑制剂的研究概述 近年来对酪氨酸酶尤其是酪氨酸酶抑制剂的关注度总体上呈上升趋势。目前 已有一些抑制剂得到临床应用，作为化妆品添加剂，保护皮肤、去除黑斑；作为 杀虫剂，防治田间害虫；作为保鲜剂，防止食品、果蔬褐化。 鉴于酪氨酸酶抑制剂的广泛应用，国内外很多学者致力于寻找具有特异的、 高效的酪氨酸酶抑制剂，研究抑制作用机理、抑制动力学、以及抑制剂的应用。 缩氨暴硫脲的合成与生物学效应研究 酪氨酸酶抑制剂的筛选主要有以下3 个渠道：( 1 ) 从天然植物组织中分离提取； ( 2 ) 从商品化合物中筛选；( 3 ) 有机合成出新的化合物。 1 3 2 苯甲醛与苯甲酸类化合物对酪氨酸酶的抑制作用 o h 图苯甲醛类化合物母核结构 f i g v it h eg e n e r m i n gs t r u c t u r eo fb e n z a l d e h y d e 已报道的苯甲醛类化合物如苯甲醛h 5 1 、烷基苯甲醛1 4 6 1 、烷氧基苯甲醛【4 74 9 】、 卤代苯甲醛【5 0 1 、羟基苯甲酣5 、烷基水杨醛、烷氧基水杨醛【5 2 。5 5 】等均具有较强 的抑制作用，其母核结构如图v 所示结果表明，当醛基化合物的对位引入推电子 基团，可以促进化合物对酪氨酸酶的抑制强度增强，并且随着推电子基团推电子 能力的增强，其抑制强度增大。例如，对甲氧基水杨醛和对异丙基水杨醛对酪氨 酸酶的抑制强度分别是水杨醛的3 4 倍和2 3 7 倍。 苯甲酸类化合物是另一类研究较多的化合物，已见报道的具有酪氨酸酶抑制 活性的苯甲酸类化合物包括：烷基苯甲酸、烷氧基苯甲酸【5 5 巧9 j 、卤代苯甲酸酸 【6 0 ，6 n 、羟基苯甲酸、烷氧基水杨酸、烷基水杨酸【6 2 , 6 3 , 】、肉桂酸及其衍生物6 4 硐 等，其母核结构如图所示。研究结果表明：在羧基的对位引入烷基可以增强对 酪氨酸酶的抑制活性，羧基对位的烷基长度从1 个碳增长到8 个碳，其抑制强度 提高了5 倍；苯环上引入卤素原子，其抑制活性会增强，如4 一氟苯甲酸、4 氯苯 甲酸、4 溴苯甲酸对酪氨酸酶的i c 5 0 分别为0 2 6 、o 2 0 、o 1 8m m o l l 4 0 1 ，较 苯甲酸的i c 5 提高了4 5 倍，并且可以看到，随着吸电子能力的减弱，其抑制活 性逐渐增强。 1 2 缩氨基硫脲的合成与生物学效应研究 h h o h h 图苯甲酸类化合物母核结构 f i g v l it h eg e n e r a t i n gs t r u c t u r eo f b e n z o a t e 1 3 3 多羟基化合物对酪氨酸酶的抑制作用 大量实验结果表明，含有间苯二酚结构的化合物大多是酪氨酸酶的抑制剂， 对位的取代基团有利于提高该类化合物的酪氨酸酶抑制活性【6 7 。7 0 】。 1 ，2 二苯乙烯( s t i l b e n e ，芪，结构式见图4 ) 化合物广泛的存在于植物体内， 具有重要的生物活性，因此含有这类结构的抑制剂的研究引起了广泛的关注 7 1 - 7 7 。大绿柄桑木c h l o r o p h o r ae x c e l s a 的心材中分离得到带氯菌素7 羽、从葡萄等 植物中提取出的白藜芦醇( r e s v e r a t r 0 1 ) 7 9 】，以及从桑m o r u sa l b a 中提取出的氧化 白藜芦醇( o x y r e s v e r a t r 0 1 ) 8 0 】，均是很强的酪氨酸酶抑制剂，它们的i c 5 0 值分别 为1 3 、5 4 6 和1 5p m o l l 。在1 。2 二苯乙烯衍生物的2 个苯环上取代基团的性质、 位置以及数目均会影响化合物对酪氨酸酶的抑制强度。当只有一个羟基取代基 时，该羟基芪没有抑制酪氨酸酶的活性；当结构中有两个羟基时，对酪氨酸酶的 抑制活性显著增强。带有羟基取代基的化合物比带有甲氧基的芪类化合物抑制酪 氨酸酶的活性更强，芪类化合物的反式异构体比它的顺式异构体对酪氨酸酶的抑 制活性更强，反3 ，3 ，4 三羟基芪对酪氨酸酶的半抑制率为8 7 7 t m o l l ，反3 ，4 ，3 ， 4 四羟基芪对酪氨酸酶的半抑制率为2 9 1p m o l l ，而且化合物结构中烯烃结构的 存在对于提高化合物抑制酪氨酸酶活性是必要的【7 3 1 ，在反3 ，5 ，2 ，4 7 四羟基芪的 4 位用疏水碳链取代后，其对酪氨酸酶的抑制活性增强。 缩氨基硫脲的合成与生物学效应研究 a b 图二苯乙烯( a ) 和查耳酮( b ) 化合物的母核化学结构式 f i g g e n e r a t i n gs t r u c t u r e so fs t i l b e n e ( a ) a n d e h a l c o n e s ( b ) 查耳酮类化合物( 母核结构式见图) 也具有抑制酪氨酸酶的活性8 1 弼】。对 该类物质的构效关系研究表明，当查耳酮不含羟基或a 环上的羟基取代基团不 超过2 个时，化合物没有抑制酪氨酸酶的活性。而当化合物b 苯环上引入羟基 时，可以大大增强其抑制活性。如果化合物中同时存在儿茶酚和问苯二酚结构时， 其抑制活性大大加强 8 1 , 8 2 。2 ，4 ，2 ，4 ，一四羟基查耳酮对酪氨酸酶的半抑制率为5 p m o l l ，2 ，4 ，6 ，2 ，4 五羟基查耳酮对酪氨酸酶的半抑制率为1l 上m o l l ，而2 ，4 ， 2 ，4 四羟基6 甲氧基查耳酮对酪氨酸酶的半抑制率为3 1 m o f l ，可见关于羟基 数目以及位置、是否甲氧基化与抑制活性之间的关系，查耳酮类化合物也有着与 芪类化合物相似的性质。 黄酮类化合物是一种含有多羟基的具有重要生物活性的广泛的存在于植物 中的化合物，结构如图所示。在植物中的黄酮类化合物大体上可以分为“黄酮 类 和“黄烷酮类”化合物，研究表明黄酮类化合物也是酪氨酸酶的有效抑制剂， 栎精对酪氨酸酶的半抑制率为5 0i t m o l l ，高良姜精对酪氨酸酶的半抑制率为1 0 1 i - t m o l l ，5 , 7 二羟基黄酮和栎精一3 芸香糖甙对酪氨酸酶没有抑制作用，结果表明 3 位羟基对于化合物对酪氨酸酶的抑制活性是至关重要的【8 3 ，8 5 1 ，曲酸( k o j i c a c i d ) ，抗坏血酸( a s c o r b i ca c i d ) ( 结构见图) 等都具此结构，并且这些化合 物对酪氨酸酶都有很强的抑制活性，曲酸对酪氨酸酶的半抑制率为2 0l x m o l l ， 它对酪氨酸酶的抑制类型为混合型抑制，其抑制常数墨和硒s 分别为1 3 0 和1 0 0 0 r t m o l l 【s 4 1 。 1 4 缩氨基硫脲的合成与生物学效应研究 r 5 o a - r 3 = r 5 = r 7 = r 3 ，- r 4 = o h ；l v = h r b ：r 3 2 r 5 2 r 7 2 0 h ；r 3 k 心k 心 2 h c ：r 3 = r 7 = r 3 k 凡ko h ；r 5 - l v = h d ：r 3 = r 7 = r 4 7 = o h ；r 5 = r 3 k & = h e ：r 3 = r 5 = r 7 = r 4 k ，_ o h ；l b = h f ：i b = r 7 = r 3 = r 4 = o h ；r 3 = r e = h g ：r 5 2r 7 = 凡k o h ；r 3 = r 3 k 心 = h h ：r 5 = r 7 = o h ；r 3 = r 3 ，_ r 4 = = h i ：r 5 = r 7 = r 3 ，- r 4 ，_ o h ；，_ h ；r 3 = o x 图黄酮类化合物结构式：a ：栎精；b ：高良姜精c ：非瑟酮d ：3 ，7 ，4 7 三羟基黄酮 e ：桑色素毛地黄黄酮g ：芹菜素h ：5 , 7 - 二羟基黄酮i ：栎精- 3 一芸香糖甙 f i g u r e s t r u c t u r e so ff l a v o n o i d s ： a ：q u e r c e t i n ；b ：g a l a n g i n ； c ：f i s e t i n ； d ：3 ，7 ，4 一t r i h y d r o x y f l a v o n e ；e ：m o r i n ；l u t e o l i n ；g ：a p i g e n i n ；h ：c h r y s i n ；i ： q u e r c e t i n 一3 - r u t i n o s i d e 1 3 4 天然活性产物对酪氨酸酶的抑制作用 从天然产物提取活性产物作为酪氨酸酶抑制剂成为另一研究的热点畔，6 5 】， 从柑橘中提取的鞣酸【8 5 1 、从苹果中纯化的苹果多酚【8 6 】、茶叶中的多酚类物质【8 7 1 ， 红景天中的提取物【8 引，银杏外种皮提取物【8 9 1 ，芦荟中的芦荟素【9 0 1 等具有酪氨酸酶 的抑制活性；鞣酸对酪氨酸酶的半抑制率为6 5l a m o l l 其抑制机理为可逆的竞争 性的抑制，抑制常数局为3 6 3i - t m o l l ，桑黄素酪氨酸酶的半抑制率为1 0 2m m o l l ，其抑制机理为可逆的竞争性的抑制，抑制常数娲为o 5 5m m o l l ，芦荟提取 物对酪氨酸酶的半抑制率分别为：6 5 9m g m l 和2 7 3m e , m l 对酪氨酸酶的抑 制作用均表现为可逆抑制，抑制类型均为混合型。 除了小分子有机化合物，部分提取的多肽与蛋白也有较好的酪氨酸酶抑制作 用。据报道，从蜂蜜和文蛤中，分别提取到分子量为6 0 0d a 和3 1 4 7d a 的多肽， 它们均具有抑制酪氨酸酶活性的作用p 1 ，9 2 1 。s u g u m a r a n 和n e l l a i a p p a n t l 6 5 】也从彪 s e x t a 幼虫的表皮中提取到一种分子量约为3 8 0k d 的热敏感蛋白质，也具有抑制 1 5 缩氨基硫脲的合成与生物学效应研究 酪氨酸酶的活性。另有报道，丝蛋白和一种来源于鸡蛋中的溶菌酶均是有效的酪 氨酸酶抑制剂【9 3 ，9 4 1 。g o e t g h e b e u r & k e r m a s h a 9 5 1 则从a n i g e r 中提取到一种金属 硫蛋白，也具有抑制酪氨酸酶的活性，该蛋白可选择性的与重金属如z n 2 + ，c u 2 + ， c d 2 + 或h 9 2 + 等结合。在人的皮肤中也存在酪氨酸酶抑制剂，分子量为6 6k d t 9 6 1 。 研究结果表明，这类抑制剂主要是通过与酪氨酸酶结合形成稳定的复合物而抑制 酪氨酸酶的催化活性。 1 3 5 杂环化合物对酪氨酸酶的抑制作用 近年来，越来越多的母核结构作为酪氨酸酶抑制剂，a 类化合物中r 位的 基团苯基比甲基的抑制活性强，对酪氨酸酶的抑制作用最强的r 2 位为1 苯基丙 烯，其对酪氨酸酶的半抑制率1 2 3p m o l l 【9 7 1 ，b 类化合物i 毪和r 如果同时为 烷基时，其抑制活性大为降低，当r 1 为甲基，r 2 和r 3 均为氢原子的时候抑制 活性最强，其对酪氨酸酶的半抑制率为3 3 3 2p , m o l l 9 s 】，c 类化合物随着r 2 碳 链的增长，抑制活性增强，随着r 1 吸电能力的增强，抑制活性增强【5 9 1 。d 类化 合物当r 为4 溴苄基时对酪氨酸酶的抑制活性最强，其对酪氨酸酶的半抑制率 为9 7m n o l l 9 9 1 。 r a 几惑 掣 s i h c b 0 h l n 夕o n d 图x 杂环类化合物结构式 f i g u r exs t r u c t u r e so fh e t e r o a t o m i cr i n gc o m p o u n d s 1 3 6 含硫化合物对酪氨酸酶的抑制作用 巯基化合物是酪氨酸酶独特的抑制剂，例如半胱氨酸【1 删、l 半胱氨酸二羧 酸盐1 0 1 1 、半胱氨酰色氨酸等半胱氨酸衍生物1 0 2 】以及卡托普利( c a p t o p r i l ) 1 0 3 l 、 1 6 缩氨幕硫脲的合成与生物学效应研究 甲巯咪唑( t h i a m a z o l e ) 0 0 4 1 等化合物都是酪氨酸酶的有效抑制剂。由于巯基化合 物巯基基团的活泼性，使其具有很强的生物活性，因此对该类化合物的抑制机理 的研究较多1 0 5 1 。在这些巯基化合物中的巯基具有较强的还原能力和化学反应活 性，可与酪氨酸酶的活性中心络合或是与酪氨酸酶的催化产物结合形成无色化合 物，所以巯基化合物对酪氨酸酶具有很强的抑制活性。 _ x ，篡铲严, x n h i 。 _。 isiu(iina丛ea h i s s j 图苯基硫脲与酪氨酸酶( e m 眈) 复合体活性中心的结构 f i g x it h es t r u c t u r eo fp h e n y lt h i o u r e ab i n g i n gt ot h ea c t i v es i t eo f t y r o s i n a s e ( e m 0 研究发现，硫脲类化合物也对酪氨酸酶有着不同程度的抑制作用。苯基硫脲 与酪氨酸酶还原态形式的酶结合( 图i x ) 1 7 】，其抑制作用主要是通过苯基硫脲 上的硫取代e m n 活性中心两个铜离子之间的氢氧化物桥联配体，从而与底物竞争 的与酶活性中心结合，形成酪氨酸酶的竞争型抑制剂。 1 3 6 酪氨酸酶抑制剂的应用 酪氨酸酶抑制剂在医学上具有重要的应用价值，这是因为酪氨酸酶作为黑色 素合成的关键酶，其异常过量表达不仅会导致人体的色素沉着性疾病，影响美观； 同时有研究表明，一些异常的黑色素生成与脑部神经、肠道疾病有密切关系，对 黑色素疾病的关注和及早治疗，可有效预防疾病的发生。 酪氨酸酶抑制剂最广泛和实际的应用方式，还是在于化妆品行业美白剂的研 发。在现代，随着人民生活水平的不断提高，化妆品工业成为国民经济的重要组 成部分。当前化妆品市场上的美白产品几乎绝大多数