（生物化学与分子生物学专业论文）过量合成核黄素重组枯草芽孢杆菌的构建.pdf

摘要 以g t p 与核黄素合成代谢去调控的突变型原核微生物作为受体菌，构建过 量合成核黄素的基因工程菌，用于核黄素的工业发酵，是核黄素工业产生的新技 术c 增加核黄素操纵子在细胞中的基因剂量，提高其编码酶的表达水平，是构建 核黄素发酵基因工程菌的基本手段。 本文以质粒p m x 4 5 为模板，p c r 扩增了枯草芽孢杆菌4 6 k b 的，硒操纵子。 该片断分别与e c o l i - b s u b t i l i s 穿梭载体p b e 2 和p h p l 3 连接，构建了重组质粒 p b e 2 r 和p h p l 3 r ；与穿梭载体p d g 3 6 4 和p d 0 1 6 6 4 连接，构建了重组质粒 p d g 3 6 4 r 和p d g l 6 6 4 r 。重组质粒分别转化d h 5 a ，进行了扩增和酶切鉴定。 以枯草芽孢杆菌d b l 0 4 染色体为模板，p c r 扩增了1 5 k b 的r e c a 片断， 与p b e 2 连接得到重组质粒p b e 2 一r e c ，转化bs u b t i l i s 2 4 筛选出r e c a + 的转化子 bs u b t i l i s2 4 r ，其核黄素合成能力为】1 0 0 m r g l 。同时筛选最s u b t i l i s2 4 与且s u b t i l i s d b l 0 4 的原生质体融合子，得到r e c a + 的融合子bs u b t i l i sr h ，能够积累4 4 0 r a g 的核黄素。 重组质粒p b e 2 r 、p h p l 3 r 、p d g 3 6 4 r 和p d g l 6 6 4 r 分别转化bs u b t i i i s2 4 r 和r h ，除p b e 2 r 得不到稳定的转化子外，其余转化得到了一系列转化子。核黄 素发酵结果表明：在选择压力下，bs u b t i l i s2 4 r p h p l 3 r 能够积累2 0 0 0 m g l 核 黄素：r h p h p l 3 r 能够积累1 8 0 0 m g l 的核黄素；但是没有选择压力，连续传递 3 0 代，其质粒丢失率分别为6 5 和3 6 。整合型重组质粒p d g 3 6 4 r 在a m y e 位点，以双交换方式整合形成的重组菌bs u b t i l i s2 4 r r i b c 卅和r s u b t i l i sr h r i b c d f l ，核黄素合成能力提高最显著，分别达到1 7 0 0 r a g | 和l1 4 0 m g l 。 用c m 对染色体上整合的r i b c a t 片断扩增，得到的b s u b t i l i sr h r i b c a t 核黄素积累浓度达到3 0 0 0 m 【g l ：b s u b t i l i s2 4 r 【r i b c a t 对c m 的扩增效果不显著， bs u b t i l i s2 4 r 【r i b c a t 3 0 核黄素积累浓度为2 2 0 0 m g 1 。 p m x 4 5 转化得到的转化子r s u b t i l i s2 4 r r i b c a t 3 0 p m x 4 5 与b s u b t i l & r h p 西一c a t 4 0 p m x 4 5 ，核黄素合成能力没有明显提高。但薅考进行原生质体融合， 筛选出的一株融合子b s u b t i l i s r h 3 3 p m x 4 5 ，其摇瓶发酵核黄素的积累浓度达到 4 2 0 0 m g l ，与bs u b t i l i s r h r i b c a t s d 相比，提高3 3 。 关键词：核黄素，枯草芽孢杆菌，基因工程，重组质粒 a b s t r a c t t h em u t a n tt h a tg t pa n dr i b o f l a v i ns y n t h e s i sm e t a b o l i z ew a sd e r e g u l a t e dw a s s e l e c t e da sh o s ts t r a i ni nt h ec o n s t r u c t i o no fe n g i n e e r i n gs t r a i n s t h i si s an e w t e c h n o l o g yt h a tt h er i b o f l a v i n p r o d u c i n ge n g i n e e r i n gs t r a i nt h a tw a sc o n s t r u c t e db y i n c r e a s i n g o ft h e c o p y o fr i b o p e r o nw a su t i l i z e d i nt h er i b o f l a v i nf e r m e n t a t i o n i n d u s t r y i nt h i s p a p e rt h e4 3 k b r i b o p e r o nw a sa m p l i f i e db yp c r w i t hp m x 4 5a st h e t e m p l a t e t h er i bo p e r o nw e r el i g a t e d w i t he c o l i b s u b t i l i ss h u t t l ev e c t o rp b e 2 ， p h p l 3 ，p d g 3 6 4a n dp d g l 6 6 4 t oc o n s t r u c tr e c o m b i n a n tp l a s m i dp b e 2 r ，p h p l 3 r ， p d g 3 6 4 r a n d p d g l 6 6 4 r ，r e s p e c t i v e l y 1 5 k bd n a s e g m e n t o fr e c a g e n ew e r ea m p l i f i e db yp c r w i t hbs u b t i l i s d b10 4 c h r o m o s o m ed n a t h ef r a g m e n tw a sc l o n e di n t ot h ee c o l i 一b s u b t i l i ss h u t t l ev e c t o r p b e 2r e s u l t i n g i nar e c o m b i n a n tp l a s m i dp b e - r e c ；a n dt h e nt r a n s f o r m e di ti n t o b j s u b t i l i s2 4 t h er e c 心s t r a i n sw a ss e l e c t e da n dn a m e da sb 。s u b t i l i s2 4 r 。a tt h e s a m et i m e1 h ep r o t o p l a s tf u s i o no fb s u b t i l i s2 4a n db s u b t i l i sd b l 0 4f o r m e db s u b t i l i sr hw h i c hc a ng r o wo na g a rc o n t a i n i n gm i t c t h e i rr e c ag e n ef u n c t i o nw e r e r e s t o r e ds u c c e s s f u l l y 。 t h e 口s u b t i l i s2 4 ra n dbs u b t i l i sr hw e r et r a n s f o r m e dw i t h p b e 2 r 、p h p l 3 r 、 p d g 3 6 4 ra n dp d g l 6 6 4 r ，r e s p e c t i v e l y a l lk i n d so ft r a n s f o r m a n tw e r eo b t a i n e d e x c e p t i to fp b e 2 r t h er e s u l to fr i b o f l a v i nf e r m e n t a t i o ns h o w e dt h a t 丑s u b t i t i s 2 4 r p h p 13 rw a sa b l et oa c c u m u l a t e2 0 0 0 m g lo fr i b o f l a v i n ，a n dr h p h p 13 rw a s 18 0 0 m g 1w i t hs e l e c t e dp r e s s u r e b u ti f t h e r ea r en o tw i t hs e l e c t e dp r e s s u r e ，t h er a t eo f i o s so f p l a s m i dw i l ia c h i e v e6 5 a n d3 6 ，最s u b t i t i s2 4 r r i b c a t la n d 矗s u b t i l i sr h r i b c a t w e r ec o n s t r u c t e dw i t ht h ei n t e g r a t i o ni n t oc h o r o m o s o m eb yp d g 3 6 4 r a ta m y e l o c u s t h e i rc a p a c i t yo fr i b o f l a v i ns y n t h e s i sw e r ei m p r o v e dt o17 0 0 1 1 l la n d114 0 m g 1 t h ei n t e g r a t i v er i b c a tf r a g m e n ta tc h r o m o s o m ei sa m p l i f i e db yc m t h er e s u l t s h o w st h a tbs u b t i l i sr h r i b c a t 】h a v eam o r er e m a r k a b l ee f f e c tt h a nb s u b t i l i s2 4 r r i b c a t c o n c e n t r a t i o n o fr i b o f l a v i nh a sr e a c h e d3 0 0 0 m g 1 i nb , s u b t i l i sr h 【r i b c a t 5 0 ，a n d2 2 0 0 m g li nb s u b t i l & 2 4 r r i b c 刎3 0 ，a n di n c r e a s e dt 6 3 a n d 2 9 r e s p e c t i v e l y t h eb s u b t i l i s2 4 r r i b c a t 3 d p m x 4 5a n db s u b t i l i sr h r i b c a t 4 0 p m x 4 5 ，w h i c h r e s u l tf r o mt r a n s f o r m a t i o nb yp m x 4 5 ，d on o ti n c r e a s et h ec a p a c i t yo ft h er i b o f l a v i n b i o s y n t h e s i s h o w e v e r , t h ef u s a n tb s u b t i l i s r h 3 3 p m x 4 5t h a tr e s u l tf r o mp r o t o p l a s t f u s i o no f2 4 r 【r i b c 卅3 0 p m x 4 5a n dr h 【r i b c a t 4 0 p m x 4 5i n c r e a s e sr e m a r k a b l y c a p a c i t y o ft h er i b o f l a v i nb i o s y n t h e s i s ，a n di n w i t hr i b o f l a v i nc o n c e n t r a t i o n o f 4 0 0 0 m g 1 a c c u m u l a t e3 3 i n c r e a s i n g k e yw o r d ：r i b o f l a v i n ，b a c i l l u ss u b t i l i s , g e n ee n g i n e e r i n g ，r e c o m b i n a n t 南扦大学硕士研咒生靴止( 学位) 论文 1 1 核黄素 1 前言 1 1 1 核黄紊的理化。陛质 核黄素( r i b o f l a v i n ) 属于水溶性的b 族维生素，也称为维生素b 2 。其分子式为 c l7 h 2 0 0 6 n 4 ，系统命名为7 , 8 一二甲基1 0 ( 1 - d 一核糖醇基) 异咯嗪，分子量为 3 7 6 3 6 8 ，结构式如图1 1 所示。 核黄素纯净品是黄色或橙黄色的细针状结晶， 微臭，微苦，加热到2 8 0 时分解。核黄素微溶 于水，在常温下溶解度约为7 m g 1 0 0 m l ，其水溶 液略显酸性；随着水溶剂p h 值的增加或降低，核 黄素的水溶解度增大。核黄素略溶于乙醇，不溶 于乙醚和氯仿等有机溶剂。核黄素水溶液能够发 出黄绿色荧光，在2 2 3 、2 6 6 、3 7 4 和4 4 4 n m 有吸 收峰。核黄素及溶液对光和紫外线辐射敏感，在 酸陛溶液中对热稳定，在碱性溶液中加热易分解， 核黄素分解产物为光黄素和光色素。 c h c h c h 2 0 h h o c h h o c - h 1 2 h o c h 0 图1 - 1 核黄桊的结构 1 1 2 核黄素的生化特性 核黄素分子上1 ，5 位的n 能够被加氢还原或脱氢氧化，因此核黄素具有氧化 型和还原型两种形式。核黄素在生物体内以黄素单核苷酸( f m n ) 和黄素腺嘌 呤二核苷酸( f a d ) 的形式存在，作为某些氧化还原酶( 黄素蛋白) 的辅酶，通 过核黄素在氧化型与还原型之间的相互转变，广泛参与细胞内的氧化还原反应。 以f m n 或f a d 为辅基的氧化还原酶有琥珀酸脱氢酶、脂酰辅酶a 脱氢酶、肾 l 氨基酸氧化酶、电子传递链的n a d h q 还原酶等。核黄素具有促进蛋白质、 脂肪、碳水化合物代谢，维持皮肤、粘膜和视觉正常机能的生理功能。核黄素缺 乏会导致呼吸减弱，代谢强度降低，引起口角炎、舌炎、结膜炎、皮脂溢出性皮 炎和视觉模糊等临床症状。绿色植物和多数微生物能够自身合成核黄索，而高等 动物需要从食物中摄取，在菜些情况下入或动物可能出现核黄素缺乏症。 1 1 3 核黄素的生产和应用 1 9 3 2 年核黄素被发现，1 9 3 5 年核黄素化学合成法被建立，随后开始工业化 南什凡学砸l 研究生毕业( 学位) | 立 生产，目前全世界年产销量估计约为6 0 0 0 吨。主要的国外生产企业有瑞士r o c h e 公司、德国b a s f 、美国a d m 和日本武田制药，国内生产企业主要有湖北广济 药业和天津太河制药有限公司。 1 1 31 核黄素合成的化学法 核黄素的化学合成法以葡萄糖为原料，经7 步化学反应合成d 核糖，再由 d 一核糖经4 步反应合成核黄素。以葡萄糖为原料的化学合成法因为工艺路线复 杂，生产成本高，几乎没有在工业上实际应用。而以d 核糖为原料的化学合成 法，工艺路线简单，生产成本低，成为核黄素工业生产的主要方式而持续了数十 年。d 一核糖一般经微生物发酵得到，因此这种核黄素合成方式也称为化学半合成 法。合成路线图见图1 2 。 氧化置换 葡萄糖阿拉伯糖酸钠阿拉伯糖酸钙 l q a o i - i 0 2c a c h ，h c l 转位置换酸化 核糖酸钙+ 核糖酸锌+ 核糖酸 c o 马2 ，h 2 0 z n s 0 4乙二酸，h 2 0 内酯化还原缩合，催化氢化 + 核糖酸内酯d 一核糖+ n a 一 毡齐电解挂二甲苯胺，h 2 偶台 核糖胺叫一( d 一核糖氨基) 一6 一偶氮苯基一3 ，4 二甲苯 硫酸偶氮苯 环台 磁黄素 巴比士酸，冰醋酸 图1 - 2 核黄素化学合成路线 f i g1 - 2c h e m i c a ls y n t h e s i so f r i b o f l a v i n 1 13 2 核黄素合成的真菌发酵法 在1 9 4 0 年和1 9 4 6 年，先后发现了能够天然过量合成核黄素的两株真菌： 阿舒氏假囊酵母( e r e m o t h e c i u m a s h b y i i ) 和棉囊阿舒氏菌( a s h b y a g o s s y p i i ) ，微 生物发酵法生产核黄素的技术开始开始被研究和开发。1 9 6 5 年上述菌种和发酵 工艺被应用于核黄素的工业生产，但因核黄素发酵单位较低，生产成本无法与化 学合成法竞争而很快被放弃。在随后的几年中，对这两种菌的核黄素合成代谢途 径进行了深入研究，先后筛选出了许多株核黄素高产突变型，大幅度的提高了核 南肝大学碗 研究7 e 毕业( 学位) 论文| j i 言 黄素发酵单位，使发酵法生产核黄素的优势开始显现。1 9 7 4 年m e r c k 公司将爿 g o s s y p i i 核黄素发酵工艺再次用于工业生产，核黄素的积累浓度能够达到 8 9 1 1 5 l ，发酵周期在1 0 0 2 0 0 小时。随后另一株能够天然过量合成核黄素的 真菌：解朊假丝酵母( c a n d i d af a m a t a ) 被发现，并进行了深入研究和高产菌株 的选育工作，获得的高产菌株被a d m 公司用于核黄素生产，核黄素积累浓度可 达2 0 k1 9 9 0 年b a s f 公司核黄素生产开始部分采用a g o s s y p i i 发酵，菌种发 酵水平为1 5 9 1 核黄素。1 9 9 6 年后b a s f 公司放弃化学合成法，全面采用彳 g o s s y p i i 发酵生产核黄素。 11 33 核黄素合成的基因工程菌发酵法 e a s h b y i i ，ag o s s y p i i 和cf a m a t a 等真菌核黄素合成是非生长关联型，菌 体生长需要耗费一定的时间，因此发酵周期长达6 - 7 天；虽然能够达到1 5 2 0 9 1 的核黄素生产能力，但与化学合成法相比，生产效率还是比较低。 随着分子生物学研究的深入以及基因操作技术的日益成熟，在上个世纪末 出现了基因工程菌发酵生产核黄素的新技术。到目前为止，已经成功构建的核黄 素发酵基因工程菌，主要是以枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 作为受体菌，也 有以产氨棒杆菌( c o r y n e b a c t i aa m i n o g e n s i s ) 为受体菌的报道。 基因工程菌发酵核黄素在三个方面显示出明显的优势：首先，基因工程菌 以生长速率较高的原核细胞为受体菌，核黄素的合成为生长相关型，因此可以将 核黄素发酵周期缩短到4 0 7 0 小时，大大提高生产效率；其次，在对基因表达 和代谢调控深入认识的基础上，运用分子生物学技术手段构建基因工程菌，较之 诱变选育的突变型，具有更大的潜力和更加广阔的操作空间；最后，基因工程菌 的核黄素发酵保持了真菌发酵的优势，使用可再生资源，生产过程污染少，产品 纯度高，安全性好，更适于在医药和食品方面的应用。因此，基因工程菌发酵法 生产核黄素，已经成为核黄素工业生产技术的发展方向，这一点已成为学术界和 核黄素生产企业的共识。 r o c h e 公司在2 0 0 0 年选择重组b s u b t i l i x 为核黄素发酵菌种，开始投建年产 3 0 0 0 吨的核黄素发酵生产新装置，以替代化学合成法。日本武田药业也与r o c h e 公司合作，在日本建立了基因工程菌发酵核黄素的生产装置。至此核黄素工业生 产开始进入基因工程菌发酵时代。目前，重组b s u b t i l i s 核黄索发酵水平可以达 到1 5 2 0 1 ，发酵周期约6 0 小时左右。 11 34 核黄素的应用 人和其它高等动物不能自身合成核黄素，在肝脏和肾脏中仅有极少量的储 存，生理所需主要来源于每日的膳食。营养学研究结果显示，成人的核黄素推荐 南 大学碰士研究生毕业( 学位) 论文前言 饮食容许量为每日1 2 1 7 m g ，而动物饲料中核黄素含量应达到1 - 4 m g k g ，才 能满足需要。家禽、家畜等动物如果缺乏核黄素，将出现生长发育迟缓，营养物 的利用率降低及腹泻等症状。因此，目前8 0 以上的核黄素工业产品为低纯度产 品，主要用于饲料工业。而不到2 0 的核黄素工业产品为高纯度的产品，主要作 为临床药品、食用色素和多维饮料的营养添加剂。 1 2 枯草芽孢杆菌核黄素生物合成背景 枯草芽孢杆菌是传统的工业发酵菌种，其用于淀粉酶、蛋白酶、鸟苷、叶酸 等的工业发酵已有多年历史。枯草芽孢杆菌营养要求简单，生长速率快，不产内、 外毒素，适于作为工业发酵菌株。枯草芽孢杆菌作为革兰氏阳性细菌的典型代表， 在遗传、生理代谢等方面都已进行了深入的研究，生物学背景比较清楚。除大肠 杆菌外，枯草芽孢杆菌基因操作技术及材料最为完备。因此，枯草芽孢杆菌成为 构建过量合成核黄索基因工程菌的首选受体菌。 1 2 1 枯草芽孢杆菌核黄素生物合成途径 1 2 1 1 前体物g t p 和d h b p 的合成 葡萄糖经过磷酸戊糖途径转化为5 一磷酸核酮糖( r i b u 5 p ) ，r i b u 一5 p 异构为 5 一磷酸核糖( r i b o 5 p ) ，进入从无到有的嘌呤合成途径，经次黄嘌呤核苷酸( i m p ) 、 黄嘌呤核苷酸( x m p ) 、鸟嘌呤核苷酸( g m p ) ，生成鸟嘌呤核苷三磷酸( g t p ) 。 g t p 是核黄素合成的前体物之一，其合成途径如图】一3 所示。 同时r i b u 5 p 由羟基磷酸丁酮合成酶催化，脱去羟甲基生成l 一3 ，4 一二羟基 一2 一丁酮一4 一磷酸( d h b p ) ，d h b p 是核黄素合成的另一个前体物。 121 2 核黄素合成途径 b s u b t i l i s 与a g o s s y p i i 等真核微生物的核黄素合成途径基本相同。b s u b t i l i s 核黄素合成途径从g t p 开始，如图卜4 所示，g t p 经2 ，5 一二氨基一6 一核糖氨基 一4 ( 3 h ) 一嘧啶酮5 一磷酸( d a r p p ) 、5 一氨基一6 一核糖氨基2 ，4 ( 1 h ，3 h ) 一嘧啶二酮 一5 一磷酸( a r p p ) 、5 - 氨基一6 核糖醇氨基一2 ，4 ( 1 h ，3 h ) 一嘧啶二酮一5 一磷酸( a r p p ) 、 5 一氨基一6 一核糖醇氨基一2 ，4 ( 1 h ，3 h ) 一嘧啶二酮( a r p ) 、6 ，7 - 二甲基8 一核糖醇基 一2 ，4 一二氧四氢蝶啶( d r l ) 生成核黄素( r f ) 。有个两个双功能酶，一个非特异 性的磷酸酶和一个核黄素合成酶参与催化核黄素合成途径的各步反应。 g t p 环水解酶i i ，羟基磷酸丁酮合成酶双功能酶，分子量为2 4 0 0 0 ，其n 端 为羟基磷酸丁酮合成酶活性，c 端为g t p 环水解酶i i 活性；g t p 环水解酶i i 催 化g t p 环水解开环，脱去一个甲基形成d a r p p 羟基磷酸丁酮合成酶催化5 - 磷酸核酮糖，脱去一个羟甲基形成d h b p ；该酶最适温度4 2 。c ，最适p h 8 4 ，k m 南”火学矾士研究生毕业( 学位) 论立 值4 1 1 x m ，磷酸根对其有抑制作用，酶活性依赖m 9 2 十。 脱氨基酶还原酶，其n 端为脱氨基酶活性，c 端为还原酶活性，分子量为 4 0 0 0 0 。脱氨基酶催化d a r p p 在c 一2 位脱去氨基，形成a r p p ，酶活性需要m g ”， 最适d h 为7 3 ；还原酶进一步催化a r p p 核糖氨基还原，形成a r p p ：需要n a d p h 作辅助因子，最适p h 为7 ，5 。a r p p 在非专一性磷酸酶作用下脱去磷酸基团，形 成a r p 。 核黄素合成酶是由3 个a 亚基和6 0 个b 亚基构成的寡聚体蛋白，其中6 0 个 $ 亚基以5 3 2 对称方式排列为二十面体衣壳，3 个d 亚基处于衣壳中心。b 亚基 具有二氧四氢蝶啶合成酶活性，也称为重酶；分子量为1 4 7 0 0 ，催化d h b p 与 a r p 的缩合产生d r l 。q 亚基为核黄素合成酶活性，也称为轻酶，分子量为2 3 5 0 0 ， 催化2 分子d r l 发生歧化反应生成1 分子核黄素和1 分子a r p ，其最适p h 为 75 。 m 一一l u c “p 十m a c l t 。一哪 r i b o 5 p l p r p p l4 p r f i c a r 1 5 囤 一关键酶 i 6 - 磷酸葡萄糖脱氢酶2 6 一磷酸薷萄糖内目酶3 6 一磷酸葡萄糖酸脱氢酶 哇p r p p 转酰胺酶5 i 肝环水解酶 6 s a 肝台成酶 t 口脱氢酶 8 s a 脾裂解酶 9 g 船台成酶1 0 舯田脱氨酶11 g 肚还原酶 图l 一3 前体物g t p 和5 一磷酸核酮糖的生物合成途径 f i g l - 3 t h e b i o s y n t h e s i sp a t h w a y o f p r e c u r s o rg t p a n dr i b u 。5 p 1 2 1 3 核黄素合成代谢及相关代谢的调控 野生型b s u b t i l i s 的核黄素合成，以及前体物g t p 的合成受到严格的代谢调 控，具体的反馈抑制和反馈阻遏调控枫制如下； 1 、6 一磷酸葡萄糖脱氢酶是磷酸戊糖途径中的关键酶，催化6 一磷酸葡萄糖脱 南开大学硕士研究! 毕业( 学位) 论文 氢形成6 一磷酸葡萄糖酸进入磷酸戊糖途径，该反应为不可逆反应。6 磷酸葡萄糖 脱氢酶活陛受n a d p + n a d p h 比值的调节，n a d p h 能够竞争性的抑制6 - 磷酸葡 萄糖脱氢酶及6 磷酸葡萄糖酸脱氢酶的活性。 2 、p r p p 转酰胺酶是嘌呤合成途径的第一个酶，其活性受末端产物的累积反 馈抑制，其中a m p 、a d p 的作用较强，g m p 和a t p 对其抑制作用较弱。 3 、i m p 脱氢酶是g t p 途径分枝点后第一个酶，其活性受x m p 、g m p 、g d p 和g t p 累积反馈抑制，抑制程度依次为5 8 、5 0 、3 9 3 1 12 6 ，同时它的合 成还受到g m p 的反馈阻遏。 4 、x m p 转胺酶催化x m p 转胺生成g m p ，其合成与活性分别受g m p 的反 馈阻遏和反馈抑制。 在野生型屋s u b t i l i s 中，由于嘌呤合成途径中存在上述的反馈抑制和反馈阻 遏作用，嘌呤合成途径的代谢流因此被限制在一定的范围内，g t p 不会被过量 合成。由于磷酸戊糖途径仅受n a d p + n a d p h 比值的调节，在合成代谢旺盛的 细胞内，嘌呤合成前体物r i b o 一5 p 或r i b u 5 p 的供给将不会成为限制因素。 1g t p ； 2 2 , 5 二氯基一6 核糖氨基一4 ( 3 h ) 嘧啶酮- 5 - 磷酸； 3 5 - 氯耩6 棱糖氨基- 2 ，4 ( 1 h ，3 h ) - 嘧啶二酮一5 一磷酸 4 6 7 二甲基一8 核糖醇基一2 4 一二氧四氧蝶啶； 5 l ，4 一二羟基2 丁酮- 4 - 磷酸： 6 5 - 磷酸核酮糖； 7 核黄素；圈1 - 4 核黄素生物合成途径 f i l l - 4b i n s y n t h e s i so fr i b o f l a v i n 1 2 2 核黄素操纵子 1 2 2 1 核黄素操纵子的结构 在枯草芽孢杆菌中，催化核黄素合成代谢七步酶促反应的5 个酶，除非特异 性磷酸酶外，其余4 个酶的编码基因组成一个基因簇，位于枯草芽孢杆菌基因组 ， ：， 。p 焱， 0d 一 南”太学碗士研究生毕业( 学位) 论文前青 染色体的2 1 0 。，称为核黄素操纵子( r i bo p e r o n ) 。 r 汤操纵子大小为4 3 k b ，包括5 个o r f ，依次为r i b g 、r i b b 、r i b a 、r i b h 和与核黄素合成无关的。呸。，f 6 操纵子结构及编码的酶如图1 - 5 所示。r 而操纵 子5 端有个一级启动子r i b p l 和操纵基因r i b o ；在r i b a 之前还有一个二级启 动子r i b p 2 ，r i b p 2 与r i b b 有部分重叠 r i b p 3 。这三个启动子都被0 “因子识别 另外在。幔之前有另外一个二级启动子 转录方向相同，分别控制其下游结构基 因的转录。核黄素操纵子中含有两个不依赖于p 因子的终止子，一个位于操纵子 的末端，控制着转录的终止；另一个位于操纵子的转录起始位点和翻译起始密码 子之间，大约3 0 0 个核苷酸。 【- - - - - - - - - 一r i b o p e r o r t - _ _ _ _ - _ 。_ _ _ 一 f 43 k b ) o r f lo 啦 r i h hr h a“b b r i n gr b o o 啊移 ( 1t 4 a a )( 1 2 4 ) ( i s 4 a t ) ( 3 9 8 t ) ( 2 i 5 )( 3 6 l a t ) 【1 1 4 a 。j 二氧四氢 蝶啶合成 酶( p 亚基) g t p 环水核黄索脱氨基酶 合成酶还原酶 亚基 图1 - 5 核黄素操纵子的结构 f i g1 - 5t h e s t r u c t u r eo fr i b o f l a v i no p e r o n 核黄素操纵子编码的酶及其在核黄素合成途径中催化的反应如下：其中 ，i b a 编码g t p 环水解酶i i 羟基磷酸丁酮合成酶双功能酶，催化核黄素合成代谢 的第一步反应，是核黄素合成途径的限速酶。 g t p h t o j ；至至堡至! s i 啦h c o o h + p p i + d a r p p 尺。一5p壁墼工塑盒盛堕明一十hcoohtbu 1 ：1 1 一) ，_ 删十 d a r p p + h 2 0 _ 嫂煎- a r p p + n i t 3 南歼大学硕l 研究生毕业( 学位) 论文 a r p p n a d p h + h + 垂塑，“p p + n a d p + a r p p 薹塾堡堕 4 r p p i a r p + d h b p 三墨婴鱼鉴堕鱼盛堕，d r l + j d f 2 璐三堕重童盒堕堕彳护+ 足f 1 2 22 核黄素操纵子的表达调控 r i b c 与核黄素操纵子的表达调控有关。r i b c 位于b s u b t i l i s 染色体的1 4 7 ”， 其编码的产物是核黄素激酶和黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶，催化核黄素磷酸化形 成f m n 及f a d 。r i b c 缺陷突变株不能产生r i b c ，只能在补加f m n 的培养基上 生氏。当f m n 限量补加时，发现核黄素被过量合成；当f m n 过量补加时，核 黄素不能被过量合成。另一个突变株r i b c 8 2 0 ，其核黄素激酶和黄素腺嘌呤二核 营酸合成酶活性显著减少，只能在细胞内产生低水平的f m n 和f a d 。该突变株 也能够过量合成核黄素，但是如果外源补加f m n ，则核黄素不能被过量合成。 此现象表明，f m n 或f a d 很可能是b s u b t i l i s 核黄素操纵子表达调控的效应物， 起着辅阻遏物的作用，而末端产物核黄素本身并没有辅阻遏物的作用。r i b c 8 2 0 能够使核黄素操纵子的表达去调控，可能的原因是其有效地防止了f m n 或f a d 在细胞内的积累。也有研究认为r i b c 基因编码产物还可能起着核黄素操纵子阻 遏蛋白的功能，或者是构成阻遏蛋白的一部分，对核黄素操纵子的表达起反式调 节作用。 核黄素操纵予的前导序列的3 末端存在一个不依赖于p 因子的终止子，这预 示着核黄素操纵子的转录或翻译过程可能存在着弱化调节机制。r i b o 对转录起 顺式调节作用，r i b o 的突变同r i b c 突变的效应相同，使核黄素操纵子成为组成 型表达。可见核黄素操纵子的表达调控，是存在于r i b o 的顺式作用元件，与未 知的反式作用因子，以及效应物f m n 或f a d 共同作用的结果。 r i b r 的突变可以阻止r i b c 突变株过量合成核黄素。r i b r 位于枯草杆菌染色 体的2 3 6 。，其n 端序列和r i b c 的c 一端序列大约有5 0 的同源性，推测它的编码 产物r i b r 可能是一种和核黄素激酶类似的蛋白；但是，在正常条件下它并不表 达，因为研究表明在b a c i l l u ss u b t i l i s 营养细胞中，r i b c 是唯一的核黄素激酶f a d 合成酶。r i b r 的突变可能使其在营养细胞内表达，r i b r 的出现弥补了r i b c 的缺 陷，使f m n 、f a d 的浓度上升，进而阻遏了核黄素操纵子的表达，使核黄素不 能过量合成。r i b r 也可能具有阻遏蛋白的功能，这种可能性有待进一步的研究 证实。 r i b a 所催化的反应是核黄素生物合成途径中的第一步反应，是整个途径的 限速步骤，因此r i b a 基因的表达量，对核黄素台成代谢速率有一定影响。 南”土学硕士研觉生毕业( 学位) 论文前言 1 3 过量合成核黄素重组菌的构建策略 与a g o s s y p i i 或c 向m d 以等能够天然过量合成核黄素的真菌不同，野生型 bs u b t i l 坫受代谢调控机制的制约，核黄素合成量仅以满足生理需要为限，生长过 程中没有过量的核黄素被分泌到细胞外。核黄素过量合成的直接限制因素是核黄 素操纵子表达的反馈阻遏机制。核黄素过量合成的间接限制因素是核黄素生物合 成前提物g t p 合成代谢的末端产物的反馈抑制或阻遏机制，这种代谢调控机制 限制了g t p 在细胞内的过量合成和积累，使核黄素过量合成因缺乏前体物而受 到限制。因此，解除g t p 合成途径与核黄素合成途径的反馈调控机制，同时增 加核黄素操纵子的基因剂量，是构建能够过量合成核黄素的b s u b t i l i s 基因工程 菌的基本策略。 1 3 1 核黄素合成反馈抑制的解除 玫瑰黄素( r o s e f l a v i n ) 是核黄素的结构类似物，能够抑制b s u b t i l i s 生长。 r o s 抗性菌株是核黄素能够过量合成的突变株。玫瑰黄素抗性菌株可以分为两 类：r i b o 突变型和r i b c 突变型。前者因为核黄素操纵子的操纵基因发生了突变， 使得操纵基因不再受到反式调节因子的阻遏，从而使结构基因能够组成型表达， 导致核黄素的过量合成。后者是由于r i b c 的突变，使其编码的核黄素激酶黄素 腺嘌呤二核营酸合成酶的活性下降，使得核黄素操纵子表达调控的辅阻遏物f a d 和f m n 的浓度处于低水平，其辅阻遏作用不能有效发挥，使核黄素操纵子能够 组成型表达，造成核黄素的积累。 1 3 2g t p 合成代谢的去调控 诱变筛选嘌呤结构类似物的抗性突变株，如8 - 氮鸟嘌呤( 8 一a g ) 、8 - 氮腺嘌呤 ( 8 - a a ) 、6 - 巯基鸟嘌呤( 6 一s g ) 、德夸菌素、甲硫氨酸亚砜和磺胺类药物等抗性突 变株，可以去除嘌呤合成途径的反馈抑制或反馈阻遏，使g t p 的合成也变为组 成型。同时也可阱选育转酮酶缺陷或活性低的突变株，切断或减弱流向芳香族氨 基酸的代谢流。还可以减弱或切断i m p 到a m p 、g m p 到i m p 、阻及组氨酸合 成的代谢流。 1 3 3 核黄素操纵子的克隆 在2 0 世纪7 0 年代至8 0 年代中期，大量的研究结果表明在原核微生物中存 在着基因扩增的现象，当某一具有抗性选择标记的基因( 如抗生素抗性基因) 在 其两侧存在同向重复序列时，在选择性压力下便会发生基因扩增现象，这就为重 组基因片断在染色体上的扩增，以获得拷贝数的增加，提供了一种很好的方法。 南， 大学硕上研究生毕业( 学位) 论立 前言 在构建核黄素过量合成基因工程菌的过程中，这种方法被普遍采用，用来扩增核 黄素操纵子在染色体上的拷贝数。 s t e p a n o v 等构建了产核黄素工程菌bs u b t i l i s 3 0 4 l p m x 4 5 ，该菌携带含有核黄 素操纵子的游离型质粒p m x 4 5 ，同时具有8 一氮鸟嘌呤和玫瑰黄素抗性标记，发 酵4 04 8 小时后可产核黄素1 6 9 l ，在优化的发酵条件下，发酵产核黄素可达 4 5 9 1 。 p e r k i n s 等通过对bs u b t i l t s1 6 8 进行诱变改造，筛选出了b s u b t i l i sr b 5 0 ， 作为构建过量合成核黄素工程菌的受体菌：通过在b s u b t i l i sr b 5 0 染色体上不同 位点整合核黄素操纵子片断，并利用基因扩增原理进行了扩增，而构建了一系列 基因工程菌。在此基础上，进一步对核黄素操纵子上的启动子进行了改造，用噬 菌体s p o i 的强启动子p 1 5 替换了核黄素操纵子上的两个天然启动子r i b p i 和 r i b p 2 。其最优菌株为b s u b t i l i sr b 5 0 ： p r f 6 9 1 6 0 ，发酵4 8 小时，可产核黄素 l3 - 1 4 9 1 ，5 6 小时后达到1 5 9 l 。 h o h m a l l n 等也利用基因扩增的原理构建了工程菌b s u b t i l i sv b 2 x l l ，该菌 在其染色体的3 - 4 个位点上整合有多个核黄素操纵子。在此基础上，他们又构建 了菌株b s u b t i t i sv b 2 x l 3 ，借助p b s l 转导使一个覆于中等强度启动子v e g i 控制 下的r i b a 基因插入至受体菌染色体的s a c b 位点上，单独增加了r i b a 基因的表 达量，使核黄素的合成能力提高了约2 5 。此外，其对r i b b 、r i b h 、r i b g 基因 也分别进行了单独扩增，结果表明对提高核黄索的合成能力没有效果，反而会不 同程度得影响菌体的生长。 k o i z u m i 等以c o r y n e b a c t i aa m i n o g e n s i s 为出发菌株构建了工程菌 k y l 3 6 2 8 p f m 5 0 ，该菌携带含有核黄素操纵子的质粒p f m 5 0 ，发酵7 2 小时后产 核黄素1 7 9 1 。将质粒中的r i b p l 更换为强启动子p 5 4 6 片段后，构建了质粒 p f m 6 7 。菌株k y l 3 6 2 8 r l f m 6 7 在同样的发酵条件下可产核黄索5 9 1 。在此基础 上，又构建了质粒p f m 7 1 和p f m 7 6 ，进一步提高r i b a 基因的表达水平，结果菌 株k y l 3 6 2 8 p f m 7 l 和k y l 3 6 2 8 f ，f m 7 6 的g t p 环水解酶i i 的活性依次提高了 3 6 和7 4 倍，发酵7 2 小时分别产核黄素7 5 9 l 和1 5 ，3 9 1 。 除本实验室外，目前国内还未见有利用基因工程技术构建过量合成核黄素 基因工程菌的研究报道。国内传统上采用e a s h b y 发酵生产核黄素，因此有关 核黄素发酵的研究主要集中于e a s h b y i i 。其方法手段多限于诱变筛选，最近报道 张星元等诱变筛选出的一株ea s h b y i it 3 0 ，在优化的发酵工艺下，核黄素产量可 达8 9 l 以上。 1 4 本研究的目的和意义 运用分子生物学理论及基因工程菌技术，国际上已先后开发出一系列核黄 南州凡学碳上研究生毕业( 学位) 论支前言 素发酵基因工程菌，其中的一些己被核黄素工业生产成功地应用。基因工程菌发 酵所表现出的发酵周期短，发酵单位高，产品纯度好，使用可再生资源等优势， 已被大家所公认，并成为一种可替代原有技术的核黄素工业生产新技术。不仅如 此，分子生物学理论和基因工程菌技术的不断进步，显示出这技术在核黄素生 产领域的应用，还有较