蛋白质组学研究进展.ppt

蛋白质组学研究进展,1,.,一、蛋白质组学的产生与发展,2,xx,人类基因组计划（HGP）,1986年，达尔贝科提出1990年，美国国会批准“HGP”，9月，中国获准加入，负责测定人类基因组序列的1%2000年6月26日，草图绘制成功2003年4月14日，人类基因组序列图绘制成功,背景,3,xx,改变花色的转基因矮牵牛花,4,xx,转入荧光素酶蛋白基因的发荧光烟草,5,xx,蓝色玫瑰一直是人类美丽的梦想基因工程正在将它变为现实,6,xx,但到2000年6月26日人类基因组草图基本绘制完成，发现人类仅有4万个基因，并且发现人和果蝇的基因区别不大，而水稻的基因比人的基因多2倍（中国科学家在Nature4月号发表）。,7,xx,8,xx,9,.,蛋白质组学,1994年，首次提出蛋白质组概念1996年，澳大利亚建立了第1个蛋白质组研究中心（APAF）2001年4月，美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（HUPO）20世纪90年代中期蛋白质组学以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象,10,xx,各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（AustraliaProteomeAnalysisFacility，APAF）美国国立癌症研究院（NCI）投资1000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。,11,xx,NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。,12,xx,Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。,13,xx,1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议,14,xx,我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会,2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。,15,xx,科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。,16,xx,2003年12月15日，国际人类蛋白质组组织负责人在北京宣布，国际人类蛋白质组计划正式启动，“人类肝脏蛋白质组计划”和“人类血浆蛋白质组计划”两大项目首先开始执行，其中“人类肝脏蛋白质组计划”由中国科学家领导执行，这是我国科学家第一次领导执行重大国际科技协作计划。,17,xx,首次由我国科学家领导的国际重大科研合作项目人类肝脏蛋白质组计划，被宣告取得阶段性新进展。几年来围绕人类肝脏蛋白质组的表达谱、修饰谱及其相互作用的连锁图等九大科研任务，我国科学家已经成功测定出6788个高可信度的中国成人肝脏蛋白质，系统构建了国际上第一张人类器官蛋白质组“蓝图”；发现了包含1000余个“蛋白质-蛋白质”相互作用的网络图；建立了2000余株蛋白质抗体。,18,xx,二、蛋白质组学的相关概念,19,xx,蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合,意指proteinsexpressedbyagenome，即“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。,（一）、蛋白质组学的概念,20,xx,对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。在空间和时间上动态变化着的整体。,蛋白质组是：,21,xx,蛋白质组学(proteomics),指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。,22,xx,主要研究内容,了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；,明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；,描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。,23,xx,Expressionproteomics(表达蛋白组学)Thestudyofglobalchangesinproteinexpression,Proteomics,Cell-mapproteomics（细胞图谱蛋白组学）Thesystematicstudyofprotein-proteininteractionsthroughtheisolationofproteincomplexes,24,xx,三、蛋白质组学研究方法概述,25,xx,蛋白质组研究更为复杂和困难：蛋白质数目大大超过基因数目。蛋白质随时间和空间而变化。,26,xx,发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。,当前主要任务,27,xx,一、蛋白质组表达模式的研究方法,28,xx,研究蛋白质组的组成成分支撑技术主要有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学分析。,蛋白质组表达模式（expressionprofile）：,29,xx,（一）蛋白质组研究中的样品制备,通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。,30,xx,样品预分级的主要方法,蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等,样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。,31,xx,组织水平上的蛋白质组样品制备,临床样本都是由多种细胞或组织混合而成，如肿瘤中癌变上皮细胞总是与血管、间质细胞等混杂一起。,激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。,32,xx,33,xx,LCM具有其独特的优点和特性。a)快速简单、有效减少交叉污染。b)样品的切割与分离由激光一步完成，并可以保持被分离的样品的完整性。c)结合免疫荧光能够基于组织细胞的表型和功能特征进行分离样品组分。d)对制样的要求灵活多样，使用范围较广。通过LCM对组织切片进行切割与分离可以分离收集从形态上（普通染色），表型或功能上（荧光染色）可以辨认均一性的细胞群体，从而克服了组织不均一的特点，有效降低假阳性，提高了数据的准确性和可靠性，这在肿瘤生物学研究中具有广泛应用。,34,xx,（二）蛋白质组研究中的样品分离,双向凝胶电泳two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。,35,xx,原理,第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF),再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。,36,xx,特点,可分离10100kD分子量的蛋白质高灵敏度和高分辨率便于计算机进行图像分析处理与质谱分析匹配,37,xx,第一向IEF电泳,1975年首先由OFarrell等创立。Bjellgvist等发展并完善了固相pH梯度等电聚焦技术，Grg等成功地将之应用于双向电泳。,38,xx,固相pH梯度等电聚焦的优点,克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。稳定的可以随意精确设定的pH梯度。尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。,39,xx,样品上样选择合适的pH跨度,胶条pH范围BroadRangepH3-10NarrowRangepH3-6,pH5-8,pH7-10,andpH4-7MicroRangepH3.9-5.1,pH4.7-5.9,pH5.5-6.7,andpH6.3-8.3胶条长度7,11,17cm,18cmand24cm,40,第二向SDS-PAGE电泳,垂直板电泳水平超薄胶电泳,41,xx,42,xx,2-DE技术的缺点,极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。,43,xx,新型非凝胶技术,液相色谱法liquidchromatography，LC毛细管电泳capillaryelectrophoresis，CE,44,xx,液质联用技术（LC-MS/MS）,蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。,45,xx,根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。离子交换色谱是通过溶质在离子交换色谱固定相上具有不同的保留能力而实现样品分离的色谱技术，而反相液相色谱是基于溶质疏水性的差异而实现分离的色谱技术。通过这两种色谱模式的联用，可以实现对复杂生物样品的二维分离。,多维色谱技术（LC/LC-MS/MS）,多维蛋白质鉴定技术(multidimensionalproteinidentificationtechnology)将不同分离模式的色谱柱以串联方式合并于同一根色谱柱中进行，在同一根色谱柱的前半部分装填强阳离子色谱填料，后部分装填反相液相色谱填料，该方法可对样品量较少的蛋白质进行快速分析。,46,xx,（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定,传统方法：Edman降解法氨基酸组成分析,47,xx,蛋白质序列分析鉴定蛋白质,一些传统蛋白质分析技术如蛋白质序列分析技术（Edman降解法,1950），仍然可用于当前蛋白质组研究。其缺点是难于实现高通量，同时对低丰度蛋白质的鉴定上其灵敏度难于达到要求。,A-R-G-F-L-E-K-L(得到部分序列),491蛋白质微量序列仪,印渍转移,酶解,提取肽混合物,毛细管HPLC仪,收集肽于PVDF膜,PVDF膜,通过Edman降解对双向凝胶上的蛋白质点进行鉴定的实验路线,双向电泳分离,48,xx,新型蛋白质鉴定技术质谱（MS）法,基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。,49,xx,MAIDI-TOF,ESI-MS/MS,酶解,脱盐浓缩,飞行时间质谱仪,电喷雾串联质谱仪,毛细管HPLC仪,点样板,序列标签(PST),数据库搜索,双向电泳分离,蛋白质鉴定,通过质谱对双向凝胶上的蛋白质点进行鉴定的实验路线,肽,肽质指纹（PMF）,质谱技术鉴定蛋白质路线图,50,xx,基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）电喷雾质谱（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI-MS）,主要质谱类型,51,xx,鉴定和注释蛋白质的路线,通过肽质谱指纹图（peptidemassfingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配,52,xx,仪器,MALDI-TOF质谱仪：灵敏度高（可达fmol），分析速度快，谱图简单易于解析以及受缓冲液、盐份的干扰小电喷雾质谱仪：灵敏度高,能与液相色谱、毛细管电泳等高效分离手段联用,53,xx,组织切片或印片原位质谱分析技术两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS）表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）,联合技术精确鉴定蛋白质,54,xx,（四）蛋白质组学研究的生物信息学,生物信息学是蛋白质组学研究的一个不可缺少的部分。,55,xx,1、对双向电泳结果进行图像分析，识别差异表达的蛋白质斑点；构建双向凝胶电泳图谱。2、单独或综合运用质谱分析数据、氨基酸测序结果等查询数据库以鉴定蛋白质。3、构建蛋白质组数据库。,应用,56,xx,蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础,瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库。（http:/www.expasy.ch/）目前应用最普遍的数据库是NRDB和dbEST数据库。NRDB是由NCBI创建的，是NCBI的BLAST搜索程序的默认蛋白质序列数据库。该数据库由GenPept（由GenBank编码序列自动翻译而成数据库）、PDB序列数据库、SWISS-PROT数据库、SPupdate（每周更新的SWISS-PROT数据库）、PIR（蛋白质信息资源）和GenPeptUpdate(每天更新的GenPept)数据库复合而成。因此该数据库是一个较完全的，包含最新信息的数据库。,57,xx,dbEST数据库,由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和欧洲生物信息学研究所（EBI）共同编辑，包括许多生物体的表达序列标签（EST）,肽序列标签(PST)或部分序列信息最适合查寻,58,xx,概念：把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。,（五）定量蛋白质组学研究,59,xx,低丰度蛋白质检测困难蛋白质表达量差异很小，如在50%以下时，精确定量成为瓶颈蛋白质表达的瞬时变化,蛋白质定量的难点,60,xx,1基于双向凝胶电泳的定量蛋白质组研究策略,双向凝胶电泳(2-DE)荧光差异显示双向电泳（F-2D-DIGE）结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念。两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合，进行2-DE，用来检测蛋白质在两种样品中表达情况，极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。,61,xx,2基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略,原理：对于具有相同离子化能力的蛋白质或多肽，可以通过比较质谱峰的强度（或峰面积）得到待比较蛋白质的相对量。,62,xx,同位素亲和标签技术（ICAT）,63,xx,二、蛋白质组功能模式的研究方法,64,xx,揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。,主要研究目标,65,xx,（一）蛋白质翻译后修饰的研究,翻译后修饰,糖基化,乙酰化,甲基化,羧基化,二硫键,磷酸化,66,xx,修饰肽的检测的高灵敏度方法蛋白质翻译后修饰的定量分析合适的修饰状态下处理和电离条件测定工作量巨大,研究面临的困难：,67,xx,（二）蛋白质相互作用研究技术,生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用（蛋白质复合体、多蛋白质网络）,68,xx,1989年Field和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。,1酵母双杂交系统（yeasttwo-hybridsystem）,69,xx,转录激活因子GAL4的特点,DNA结合结构域(DNAbindingdomain,简称为DB):N端含NLS和与酵母GAL1基因启动子上游激活序列(UASG)结合的结构域转录激活结构域(activationdomain,简称为AD):C端含GAL1转录激活结构域,70,xx,功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性,71,xx,72,xx,主要特点和优势,使蛋白质表现型和基因型相联系筛选cDNA文库真实反应体内蛋白质间相互作用情况不需分离靶蛋白敏感性高,73,xx,缺点,1.假阳性结果2.假阴性结果3.限于核内表达的蛋白质的相互作用4.不能检测依靠翻译后修饰的相互作用,74,xx,2基于质谱的蛋白质相互作用研究方法,靶蛋白制备蛋白质复合体的纯化蛋白质复合体的质谱鉴定,基本步骤：,75,xx,（1）亲和层析耦联质谱技术,基本原理：将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含相互作用蛋白质的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶蛋白的结合蛋白。,76,xx,先决条件,得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋白作为诱饵（bait）获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用的蛋白质,77,xx,（2）免疫共沉淀耦联质谱技术,原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。,78,xx,研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白,抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应的肽序列标签搜索数据库,79,xx,特点,生理条件下蛋白质之间的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用,80,xx,局限性,A.灵敏性不高B.假阳性C.受免疫球蛋白的干扰较大,81,xx,基本原理：将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析。,3、蛋白质芯片（proteinchips，proteinarray）技术,82,xx,四、蛋白质组学在肿瘤研究中的应用,83,xx,（一）研究肿瘤发病机理、寻找用于肿瘤诊断和治疗的生物标志物运用蛋白质组研究技术，通过比较肿瘤组织（细胞）和正常组织（细胞）或肿瘤发展不同阶段组织中，蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异，可以发现与癌变相关的特异性蛋白质，这些肿瘤相关的特异蛋白质不仅可为认识和研究肿瘤发病机理提供线索，而且可作为肿瘤诊断和治疗的生物标志物。如Celis等对膀胱鳞状细胞癌(SCC)和移形细胞癌（TCC）的蛋白质组进行了比较研究，在膀胱癌病人的尿液中找到4种与膀胱癌相关的蛋白质：其中银屑素是SCC的生物标志，可用于SCC的早期诊断、鉴别诊断和病情监控。,84,xx,。,（二）发现肿瘤药物作用的靶点药物多是通过特异地作用于体内的靶蛋白质而重新调整病人的生理功能达到治疗目的。新的药物靶蛋白在药学研究中有重要作用。基因组研究提示，控制人类疾病的潜在药物靶蛋白，粗略估计大约有5000-10000个。然而在过去的100年发现的药物靶蛋白只有500-1000个。因此后基因组时代的一个紧迫任务是发现这些药物靶蛋白，为开发治疗人类疾病的新药提供依据。用蛋白质组研究技术，通过比较肿瘤组织（细胞）和正常组织（细胞）或肿瘤发展不同阶段组织中，蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异，可以发现肿瘤特异性蛋白质，这些蛋白质不仅可作为肿瘤诊断的标志物，而且可作为抗肿瘤药物作用靶点，用于治疗肿瘤药物的设计和开发。,85,xx,（三）肿瘤药物作用机理研究目前，一些抗肿瘤药物在体内的作用机理并不清楚。应用蛋白质组研究技术，分析药物处理过的细胞/组织或体液表达的蛋白质组，比较治疗前后的蛋白质组的差异、鉴定其中发现相应变化的蛋白质，可揭示药物的作用机理。如比较抗肝癌化合物OGT719和5-FU处理过的肿瘤细胞株的蛋白质表达谱，发现二者处理过的细胞蛋白质表达谱发生了类似的变化，这提示OGT719与已知的5-FU的作用机制类似，其中核糖体RNA结合蛋白（嘧啶合成过程中的一种重要蛋白）变化显著，可能是二者作用的靶点。,86,xx,（四）抗肿瘤新药筛选目前，组合化学技术的成熟可以源源不断地大量提供用于药物开发的新化合物。但是，由于筛选技术的相对落后，使得先导化合物的发现和优化，仍是制约新药研发的最大瓶颈。而应用蛋白质组研究技术进行新药筛选具有明显优势。具体地说，通过分析比较化合物处理前后模型细胞或组织的蛋白质表达谱，不仅可快速获得该化合物的有效性和毒性方面有价值信息，而且可将化合物作用的靶蛋白构建成分子药理学模型、用于大量新化合物的筛选和评价其药物效能。,87,xx,如一种新的抗癌药oltipraze，可用于治疗和预防黄曲霉毒素诱导的肝癌。通过蛋白质组的研究发现它可调控肝脏中许多蛋白质的表达，其中黄曲霉毒素B1醛还原酶（AFAR）的含量增加了7倍，该酶与黄曲霉毒素的解毒有关。因此，AFAR作为蛋白质标记物（分子药理学模型）已用于筛选和评价oltipraze其它类似物的抗肿瘤效果。,88,x