（应用化学专业论文）知母药材中芒果苷的制备以及白虎汤中芒果苷的初步研究.pdf

四j f f 大学硕士学位论文知母药材中芒果苷的制备以及白虎汤中芒果苷的初步研究应用化学专业研究生刘海峰指导教师李晖本文利用分析化学、中药学、植物学等多学科交叉知识建立了从知母药材中提取制备芒果苷的方法。该方法优化了各种参数，得到了纯度较高的芒果苷提取物，经u v 、瓜以及h n m r 鉴定验证了其确为单一的芒果苷。经h p l c 检测纯度大于9 9 ，可以作为对照品使用。该提取制备方法经优化放大工艺后，可试用于小规模工艺化生产，为提取制备其他药材提取物提供了借鉴思路。本文利用高效液相色谱仪建立了知母药材中芒果苷含量测定的h p l c 方法。通过i - i p l c 方法学的研究，确定了芒果苷h p l c 测定的色谱条件：色谱柱为k r o m a s i lc 1 8 ( 2 5 0 m m 4 6 m m5 u m ) ；流动相为乙睛和0 0 5 m o l l 的磷酸二氢钾溶液( p h 3 o ) ；比例为1 2 ：8 8 ；流速为i m l m i n ；检测波长为2 5 8 n m 。该色谱条件下芒果苷在0 0 2 4 u g 1 3 2 u g 范围内线性关系良好( i - - 0 9 9 9 6 ) ，日内的精密度r s d 为o 6 8 ，回收率为9 8 9 。可见该方法准确可靠、重现性好，可作为知母中芒果苷含量测定的方法，为完善知母药材质量标准提供参考。利用建立的i - i p l c ，本文还对不同产地的知母药材中的芒果苷含量进行了测定，不同产地的知母中芒果苷的含量存在着明显的差异，这种差异应该是其生长环境不同而引起的，为进一步通过建立知母药材的指纹图来评价不同产地的知母药材质量奠定了基础。也为实际应用中选择不同产地的知母提供了参考数据。本文对知母加工炮制品的芒果苷含量进行了测定，知母中的芒果苷含量在经过炒制后会增加，初步估计炒制后芒果苷含量增加的原因可能是与芒果营结四川大学硕士学位论文果类似的物质在炒制的过程中转变为了芒果苷，当然这还需要作进一步的研究来确定。最后，本文还对古方白虎汤中的芒果苷含量进行了测定，发现使用生石膏时，芒果苷的含量要高，而使用熟石膏时芒果苷含量变化不到，这个现象如何解释还需要作进一步的研究。石膏与知母的配比不同，芒果苷的含量不同，当其配比为8 ：3 左右时芒果苷的含量最高，这与古方的配比非常接近，从这方面我们可以看到古方配比的一定合理性。本文以芒果苷为主线完成了对芒果苷的提取制备的工艺研究，并建立了芒果苷的含量测定的h p l c 方法，并将这种i - i p l c 方法应用到了与芒果苷有关的药材的产地和加工炮制方面的分析，以及复方白虎汤配比的研究中。关键词：知母；芒果苷；提取制备；i - - i p l c ；四川大学硕士学位论文p r e p a r a t i o no f m a n g i f e r i nf r o mr h i z o m aa n e m a r r h e n a ea n dt h er e s e a r c h o fm a n g i f e r i ni nb a i h us o u pm a j o ra p p l i n gc h e m i s t r yg r a d u a t el i uh a l f e n ga d v i s e rl ih u iu s i n go ft h ek n o w l e d g eo fa n a l y z ec h e m i s t r y , c h i n e s ew a d i t i o n t a lm e d i c i n e ，b o t a n ye t c ，w ee s t a b l i s h e st h em e t h o dt h a tc a ne x t r a c tm a n g i f e r i nf r o mr h m o m aa n e m a r r h e n a e t h a tm e t h o dw a se x c e l l e n tt or u me v e r yk i n do fp a r a m e t e r ，g e t t i n gah i g h e rp u t i t ym a n g i f e r i n ，w a s i n ga u t h e n t i c a t e db yu v ，i ra n dh n m r st ov e r i f yi ti sas i n g l ep u r em a n g i f e r i n a n dw a se x a m i n e db yh p l cp u r ed e g r e eo v e r9 9 ，c a nb eu s e da ss t a n d a r d e n l a r g et h et e c h n i c s ，w ec a nt r yo u tt ot u r nt h ep r o d u c t i o ni nt h es m a l ls c a l ep r o d u c t t h em e t h o dp r o v i d e saw a yo ft h i n k i n gf o re x t r a c t i n ga n t h o e rm a t e r i t a l t h i sp a p e re s t a b i l i s hah p l ca s s a yf o rd e t e r m i n a t i o no fm a n g i f e r i n t h r o u g ht h er e s e a r c ho fm e t h o d o l o g y , w em a k es u r eo fc h r o m a t o g r a mc o n d i t i o n ak r o m a s i lc 1 8c o l u m n ( 2 5 0 m m 4 6 m m5 u r n ) w i t ht h em o b i l ep h a s eo fa c e t o n i t r i l e 一0 0 5 m o l lk h2 1 0 4 ( p h 3 0 ) ，t h ep r o p o r t i o ni s1 2 ：8 8 t h ev e l o c i t yo ff l o wi sl m f m i n e x a m i n a t i o nw a v e _ l e n 咖i s2 5 8m n s t h em a n g i f e r i ns h o w e dg o o dl i n e a r i t yo v e rt h er a n g e so fo 0 2 4 u g - i 3 2 u g ( r - - 0 9 9 9 6 ) t h ew i t h i n - d a yp r e c i s i o nr s dw a s0 6 8 t h er e c o v e r yw a s9 8 9 t h em e t h o dw a se a s y , r a p i d ，a c c u r a t e ，a n ds e n s i t i v e i tw i l lb eu s e di nd e t e r m i n i n gm a n g i f e r i ni nh e r b s w i t ht h em e t h o do fh p l c ，t h ep a p e rm e n s u m t e dt h em a n g i f e r i ni nr h i z o m aa n e m a r r h e n a ef r o md i f f e r e n tp l a c e t h er e s u l t ss h o w do b v i o u sd i f f e r e n c ef o rd i f f e r e n tp l a c er h i z o m aa n e m a r r h e n a e t h i sd i f f e r e n c ew a sb e c a u s eo fi t sg r o w t he n v i r o n m e n t w ee s t a b l i s h 也b a s ef o re v m u a t i n gt h ed i f f e r e n tp l a c eh e r b sb yt h em四川大学硕士学位论文f i n g e r p r i n td a g r a m t h ep a p e rd e t e r m i n e dc o n t e n t so fm a n g i f e r i ni ni 列a i z o m aa n c m a r r t x e n a eb e f o r ea n da f t e rp r o c e s s i n g t h ec o n t e n t so fm a n # f e r i ni nr h i z o m aa n e m a r r h e n a ew a sr i s e d t h i sm a yb et h es i m i l a rt om a n g i f e d nt r a n s f o r m a t i o nt om a n g i f e r i n c e r t a i n l y , m u s tm a k ef u r t h e rr e s e a r c ht oc o n f i r m f i n a l l y , t h ep a p e rd e t e r m i n e dc o n t e n t so f m a n g i f e d ni nb a i h us o u p t h ec o n t e n t so f m a n g i f e r i ni nb a i h us o u pw i t hc r u d eg y p s u mw a sr i s c d ，a n dc o m e n t so f m a n g i f e r i ni nb a i h us o u pw i t hp r o c e s s e dg y p s u mh a sn o te v i d e n c ec h a n g e w h e nt h ep r o p o r t i o no fr h i z o m aa n e m a r r h e n a ea n dc r u d eg y p s u mi sd i f f e r e n t ，t h ec o n t e n t so fl 啪西f e r i ni nb a i h us o u pi sd i f f e r e n t t h ec o n t e n t so fm a n 百f e r i ni st h em o s th i g h e s t ，w h e nt h ep r o p o r t i o ni s8 ：3 t h i sp r o p o r t i o nn e a r st oa n c i e n tp r o p o r t i o n f r o mt h i sa s p e c tw ec a ns e et h a tt h ea n c i e n tp r o p o r t i o nh a ss o m er a t i o n a l i t y t h ep a p e re s t a b l i s h e sam e t h o dt h a tc a ne 震t r a c tm a n g i f e r i nf r o mg h i z o m aa n e m a r r h e n a ea n de s t a b i l i s h sah p l ca s s a yf o rd e t e r m i n a t i o no fm a n g i f e r i n a n du s et h i si - i p l cm e t h o dd c t c n n i n o dc o n t e n t so fm a n g i f e r i ni nr h i z o m aa n e m a r r h e n a e ，i n c l u d et h a td i f f e r e n tg r o w t hp l c a c eh e r b sa n dp r o c e s s e dh e r b s ，a n da p p l i e dt or e s e a r c ht h em a n g i f e r i ni nt h eb a i h us o u p k e yw o r d s ：m a n g i f e r i n ；f i n g e r p r i n t ：r h i z o m aa n e m a r r h e n a e ：e x t r a c t ：h p l ci v四川大学硕士学位论文声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及所取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下获得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。4 7研究生：塑i 盗噬指导凯垩生时四川大学硕士学位论文1 前言中药作为我国传统文化的瑰宝之一，几千年来，为中华民族的繁衍昌盛和生命健康做出了巨大的贡献，其自身也走过了数千年光辉历程。在现代医药已覆盖全球的今天，古老的中国医药学仍以其独特的优势显示出强大的生命力，“中医中药热”己经在全球兴起“。3 1 。全球“绿色植物药热”的兴起和我国加入“w t o ”，为古老的中药参与国际市场竞争带来了大好机遇，全世界已有1 2 0余个国家或地区应用中草药，世界植物药市场连续2 0 年呈活跃发展态势，发展速率一直保持在1 0 以上，预计国际植物药将从现在3 0 0 亿美元快速增长到1 0 0 0 亿美元的销售规模。全球“中药热”正在升温，已经开始显露出进入西方国家主流社会的新趋势，已被世界贸易组织1 3 0 余个成员国所接受，这无疑会大大促进我国中药材产业的发展“1 。经过长期发展，目前，中药行业已成为传统工艺和现代技术相结合，集一、二、三产业为一体的产业，也是我国具有国际比较优势的典型产业之一。随着科技在中药产业中的广泛应用，以及全球医疗体系“回归自然”和“重新重视天然药物”热潮的兴起，中药己开始得到越来越多的国家和地区的认可，国际主流医学界对于中药的评价也更趋于客观，这为我国扩大中药产品出口提供了巨大的发展空间，为我们的祖先留下来的宝贵遗产走出国门发扬光大提供了千载难逢的机会0 1 ，也就促使我们要深入研究古人留下的古方，其中的一些古方用现代的科学方法分析也有着很强的理论性。现在中国药典收载的药材的含量测定方法只是测定其中一种活性成分，来确定这种药材的优劣质量，而这却不能完全表征这种药材的所有药效。因此非常有必要对药材种的其他活性成分建立质量控制方法。现在我们出口许多药材和药材的提取物到国外，国外的科学家和企业对这些我们出口的药材和药材的提取物进行了更深入的研究，以及更深层次的加工，他们在学术和经济效益上都取的非常好的成绩。而我们国内对中药的研究许多还只停留在药典所收载的活性成分中。比如说葫芦巴，我们国内的研究大多集中在生物碱方面的研究，而日本现在大量从我国进口葫芦巴提取物，再从葫芦巴提取物中去提取5 一h r p ，进行药效方面的研究。我们有着祖先留下的丰富的中药遗产，我们应该利用现在的先进手段将其发扬光大，振兴我们的民族医药。要在药材的单一成分的提取精制工艺上有所突破，在保留中药特性的同时结合西药的研究方法进四川大学硕士学位论文行研究，为中药复方的研究打下坚实的基础。当然，药典还收载了许多的复方中药，这些复方中药成分复杂，各成分之间常具有协同作用，有时甚至具有双向调节的作用，很难确定某化合物为惟一有效成分。在药物分析工作者的共同努力下，中药含量测定的方法和应用范围一直在不断地取得进步。目前国家药典采用定性或定量测定中药材中活性成分或有效成分来评价其质量，但研究证明，中药的疗效是来自其多种“活性成分”之间的协同作用，甚至是与“非活性成分”之间的协同作用或“生克作用”。在中医理论指导下的中药，任何一种活性成分均不能全面反映中医用药所体现的整体疗效。中药成份本身的复杂性和其制备工艺的不完善，引起中药产品质量差异，如何对中药( 制剂) 质量进行控制和评价是企业、科研及管理部门关注的问题”1 。本文就想在知母药材中芒果苷这种活性成分的提取制备上进行尝试，建立知母药材中芒果苷的测定方法，从而进一步研究复方白虎汤中的芒果苷。1 1 知母药材中药知母，别名羊胡子根、蒜辫子革等，为百合科( l i l i a c e a e ) 植物a n e m a r r h e n a a s p h o d e l o i d e s 的干燥根茎。鉴于炮制过程有所不同，可分为“毛知母”、“知母肉或光知母”等嘲。味苦，性寒，归肺、胃、肾经。具有清热泻火、滋阴润燥、止渴除烦等功效，主治温热病，高热烦渴，咳嗽气喘，燥咳，便泌，骨蒸潮热，虚烦不眠，消渴淋浊等症嘲，近年试验证明有抑菌、解热、降血糖等作用1 。1 1 1 化学成分知母根茎中含有大量甾体皂苷、双苯毗酮类、木脂素类、胆碱、多糖类、有机酸类、大量粘液质及微量元素( 铁、锌、铜、锰、钻、铬、镍等) 等。其中知母中双苯吡酮类化合物主要为芒果苷( m a n g i f e r i n ) ，根茎中含量约为0 7 。叶中含异芒果苷( i s m a n g i f e r i n ) 。洪永福等从新鲜西陵知母根茎中分得新芒果苷( n e o m a n g i f e r i n ) ，即7 一o - b - d - 葡萄糖基芒果苷。“1 。1 1 2 药理作用n 1 删2四川大学硕士学位论文1 1 2 1 抗茵作用知母煎剂对葡萄球菌、伤寒杆菌痢疾杆菌、副伤寒杆菌、枯草杆菌、霍乱弧菌有较强的抑制作用。在沙氏培养基上，对某些常见的致病性皮肤癣也有抑制作用，醇浸膏及在此浸膏中经丙酮处理的结晶对普、拜二氏培养基上的h 3 7 r v 人型结核杆菌亚种有较强的抑制作用。1 1 2 2 抗炎作用知母水提物及总多糖能显著抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀和醋酸致腹腔毛细血管通透性增高，且具有剂量依赖性，而知母醇提物只能抑制醋酸致腹腔毛细血管通透性增高，对二甲苯所致耳廓肿胀无明显抑制作用。知母总多糖是其主要抗炎活性成分，知母总多糖( t a p ) 对急慢性炎症均有明显的抑制作用，促进肾上腺分泌较高水平的糖皮质激素及抑制炎症组织p g e 的合成或释放是其发挥抗炎作用的重要途径。1 1 2 3n a + k + a t p 酶抑制剂陈锐群等将提得的知母皂苷及水解产物苷元进行正常及“甲亢”小鼠肝脏切耗氧率( q 0 2 值) 的影响实验和部分提取肾( 兔) n a + k + a t p 酶抑制作用的观察，并与该酶专一抑制剂乌木苷( c u b a i n ) 进行对照”结果表明，知母皂苷及皂苷元对正常鼠肝q 0 2 值有降低趋势，但无统计意义。对注射甲状腺素诱导产生n a + 水+ a t p酶从而引起q 0 2 值增高的小鼠肝脏，知母皂苷及苷元也有降低作用，这证明知母有降低内热的功能。1 1 2 4 对心肌缺血再灌注( i r ) 损伤的保护作用知母皂苷d 能降低家兔心脏i r 弓i 起的心电图改变，抑n i r 过程中血清c k 及 i d a 含量的增高减少心肌梗死范围。其保护心肌i r 损伤作用的机制可能与其抗p a f 、抗血小板聚集和清除自由基等有关。1 1 2 5 对交感神经一p 一受体- c a m p 系统的影响知母能减少动物病理模型中过多的b 受体，降低c a m p 系统对b 受体激动剂四川大学硕士学位论文的反应性。赵树进等通过氢化可的松和甲状腺素分别使兔外周淋巴细胞和大鼠脑组织b 受体数目升高：知母皂苷( t i m ) 及其苷元( s a r ) 可使上述动物病理性升高的b 受体密度趋于正常。1 1 2 6c a m p 磷酸酯酶抑制剂从知母中分离出的木脂类化合物被证明是较强的c a m p 磷酸酯酶抑制剂，特别是其中的c i s h i n o k i r e s i n o l 在剂量l o o m g k g 时能延长环戊巴比妥引起的睡眠时间，这为知母被用作镇静剂提供了一定的依据。1 1 2 7 抗衰老、改善学习记忆作用知母对衰老早期脑m 受体密度轻度降低有明显上调作用，在大鼠或小鼠从成年转入老年时开始每天喂服一定量的知母水提物，也能使动物脑m 受体在较长期保持正常水平。知母苷元z m s 能够提高东莨菪碱拟痴呆小鼠的学习记忆能力，上调脑凇受体，提高增龄引起的脑b d n f 降低，从而对神经元起保护作用。1 1 2 8 抗血小板聚集作用知母的甲醇提取物对血小板聚集有很强的抑制作用，进而从中分离出知母皂苷九一。和k n ，对由a d p 5 一h t ( 羟色胺) 和a a ( 花生四烯酸) 诱导的兔和人血小板聚集均有很强抑制作用。1 1 2 9 降血糖作用知母多糖能降低正常小鼠及由四氧嘧啶型小鼠的血糖指标。知母聚糖降血糖作用与其增加肝糖元合成、减少肝糖元分解、增加骨骼肌对葡萄糖摄取等因素有关。1 1 2 1 0 醛糖还原酶抑制剂醛糖还原酶( a r ) 在糖性白内障的发病中起着关键作用。此外，a r 还与糖尿病引起的角膜、视神经及外周神经的病变有关。赵惠仁等人研究了知母等4 0 种中药水提液对a r 的抑制作用，发现知母对a r 的抑制作用最强，其i 岛为1 9 m g l 。4四川大学硕士学位论文1 1 2 i i 减轻糖皮质激素副作用在临床长期大量服用糖皮质激素的同时，服用从知母中提取的知母皂苷口服液。发现因服用糖皮质激素所致外周血淋巴细胞上升的1 3 受体明显下降，而血浆皮质醇浓度! 细胞糖皮质激素受体及其亲和力并未受到影响。1 1 2 1 2 对心血管的影响李泽松等对知母皂苷活血化淤作用的分子机制进行了研究。制备包含8 7 个心血管疾病相关基因探针的寡核苷酸芯片。将8 0 m g l 知母皂苷作用8 h 及位作用的培养人血管内皮细胞提取总r n a ，通过逆转录分别标记c y 5 和c y 3 荧光染料，然后与芯片杂交，检测知母皂苷对血管内皮细胞中心血管疾病相关基因表达的影响。结果表明，知母皂苷作用于血管内皮细胞后，血管紧张素酶原( a g t ) 基因、肾上腺素a 。受体( a d r a i r ) 基因和内皮素转换酶一l ( e c e 一1 ) 基因的表达均有不同程度的下调。知母皂苷有调控血管内皮细胞功能的作用，可能是其治疗心血管疾病的机制之一。1 1 2 1 3 其他作用知母还具有杀软体动物，c a m p 磷酸酯酶抑制剂，促进消化道功能，抗肿瘤等药理作用。知母总皂苷能显著拮抗地塞米松对垂体一肾上腺皮质系统的抑制作用。知母中的芒果苷可治疗慢性支气管炎减轻阿霉素( d o x ) 的毒副作用，预防哮喘，抗氧化，并能通过增强胰岛素敏感性而发挥抗糖尿病作用。综上所述，知母作为常用中药，有着重要的药用价值。国内外对知母中的皂苷类成分研究较多，芒果苷作为知母的另一重要活性成分，具有明显的生理活性，对其研究有待深入。1 1 3 知母解热作用的机制“2 1知母为滋阴泻火药，有研究表明知母解热的机制可能如下：n a 十，k + _ a t p酶在机体产热中占重要地位。阴虚生内热可能是n a + ，k + 一a t p 酶活性过高的一种表现，如甲亢患者。知母中提取的知母皂苷元n a + ，k + _ a t p 酶抑制剂。陆世伦等对正常人、阴虚及阳虚患者红细胞n a + 泵活性进行了测定和比较，对知母皂苷元四川大学硕士学位论文抑制人红细胞n a + 的特性进行了研究。认为阴虚、阳虚患者的产热异常可能与n a +泵活性的改变有关。由于钠泵在肠粘膜上皮及肾曲小管中均能促进水分吸收，钠泵活性过高可引起产热增加，出现的大便千结、尿黄等与阴虚内热证相符，故陈锐群认为知母滋阴清热的机制与其抑制钠活性有关。5 一羟色胺是一种很重要的调节体温的神经递质，而单胺氧化酶( i a o ，分为m a 沪a 和m a o - b 两型) 对多种神经递质包括5 一羟色胺的代谢起着重要作用，知母作为一种性寒的中药在细胞内对上述两种酶均有抑制作用。实验证明，广泛存在于全身组织的多种p g 都有致热作用。解热药可抑制p g 合成酶( 环氧合酶，c o x ) ，减少p g 的生物合成。l e e 研究从知母根茎分离提取物对c o x i 和c o x - i i 均有抑制作用，并已找到其活性部分。陈万生等通过实验证明知母总多糖抑制前列腺素e ( p g e ) 的合成或释放，从而显著减少炎症组织中的p g e 含量。1 1 4 加工炮制对知母品质的影响“”知母为常用清热降火药。据历代文献记载，古代有多种炮制品：盐炒、酒炒、酒浸、炒等中国药典1 9 9 0 年版一部仅收载盐炒知母1 种。日前部分地区尚有酒炒、炒知母；商品则有毛知母、知母肉两种加工品。知母去皮加工使药材中芒果苷含量相对降低，新芒果苷含量升高。由于芒果苷是知母的主要活性成分之一。且李曾欣报道知母皮中皂苷含量及抑菌作用均高于毛知母和知母肉故知母不必去皮加工。清炒、酒炒、盆炒告可使药材中芒果苷、新芒果苷含量较大幅度降低，而总多糖含量变化不大。抗炎作用各炮制品皆不及生品。知母总多糖是知母抗炎作用的主要有效成分，提示我们，炮制虽不降低总多糖含量，但可能使其结构发生改变，从而导致药效降低；知母具有显著的镇静作用，炒、酒炒可使此作用增强，知母镇静作用的有效成分c i s - h i n o k i r i n o l 为一种脂溶性成分，炒使药材疏松，酒炒中带入乙醇，乙醇对脂溶性成分具“增溶”作用，盐知母的镇静作用稍差，可能是水煎液中na c1 的离子效应，导致c i s h i n o k i r i n o l 的溶出率降低。化学成分与药效学考察的结果提示我们，知母用于清热、抗炎时不必炮制。用于镇静则宜用炒知母、酒炒知母；盐知母未发现有特殊之处。传统医学认为盐制走肾，其作用尚待进一步研究。6四川大学硕士学位论文1 2 知母药材解热研究1 2 1 知母解热研究现状知母降温退热作用的研究要集中在古方白虎汤的研究，七十年代有报道“”，知母、甘草、石膏均有退热作用，而途径各不相同。这三种药材就是古方白虎汤的组成药材。知母的降温退热作用也主要是体现在白虎汤这味中药中。有人认为石膏内服经胃酸作用，一部分变味可溶性钙盐至肠吸收入血，使血清中钙离子浓度升高，抑制体温控制中枢，从而起到体温调节。而知母对发热动物也有显著解热作用，能增强石膏的解热作用，经植化及药理初步研究表明：黄色结晶c 是清热作用的有效成分。经红外、紫外吸收光谱、薄层熔点及理化鉴定，证实该物质为芒果苷。八十年代初王氏对白虎汤各药“”1 ，各种配伍进一步做试验研究。家兔退热试验结果：石膏组平均退热0 3 。c ；知母组平均退热o 7 c ；石膏、知母组平均退热1 2 ；白虎汤组平均退热1 3 。c ；而甘草组，石膏、甘草、梗米组均无退热作用。退热维持时间：石膏较短，知母较长，两者相合达退热最佳效果。通过试验进一步证明白虎汤退热成分是石膏所含的微量物质和知母所含的黄色结晶一芒果苷。九十年代初“3 1 ”，徐氏做了：“白虎汤与单味石膏煎剂中钙离子在麻醉大鼠小肠的吸收”的实验。其结果表明：硫酸钙在白虎汤中的溶出量与单味石膏汤中的溶出量的均数无显著差异。两组捉拿嘎的血钙浓度均数比较也无显著差异。且两组所含的浓度，吸收量和一小时内的吸收速度均无明显差异。也就是说白虎汤较强的退热作用与钙离子的溶解度及其吸收量无关，而是知母中的芒果苷和石膏中的微量物质有关。1 2 2 芒果苷芒果苷( m a n g i f e r i n ) ，又名芒果素、知母宁，是从百合科植物知母中提取的天然多酚类化合物，芒果苷是芒果叶中的主要活性成分。分子式：c 。m 。0 “，分子量：4 2 2 。其化学结构如下：四川大学硕士学位论文该成分亦可从漆树科芒果树、扁桃树的叶、果实、树皮；龙胆科植物东北龙胆、川西獐芽菜；水龙骨科植物光石韦等中提取得到。现代药理和临床研究证明，芒果苷具有多方面的生理活性和药理作用。邓家刚，曾春晖“”对近3 0 年芒果叶及芒果苷在生药学、制剂学、药理学及临床应用等方面的研究成果作了综述，总结出芒果昔具有平喘止咳祛痰、免疫、抗炎、镇痛、保肝利胆、抗脂质过氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗菌等作用，以及中枢神经兴奋作用和对心血管系统的不能被心得安所阻断的增强心肌收缩力的作用。廖洪利，吴秋业等“也对芒果苷的药理作用研究现状进行了归纳，除了上述的药理作用，芒果苷还具有抗糖尿病作用、抗辐射作用。李好文，邓家刚，邓静“”对国外芒果苷研究已取得的成果、现状进行了介绍，日本的i c h i k 推论芒果苷具有抗糖尿病作用，日本的m i u r a 的研究得出芒果苷具有血脂质抑制效应，日本的y o s h i k a w a 发现芒果苷有抗肥胖的作用。此外一些学者的研究还证明了芒果苷具有降热作用m ”、抗应激作用啪1 等。1 4 本课题的研究目的、思路及意义本课题旨在综合利用分析科学、中药学、植物学、化学等多学科交叉知识，在知母药材中解热活性成分芒果苷提取制备中取得一定突破，制取纯度较高的芒果苷提取物，根据实验室条件尽可能放大工艺，为提取制备方法的小规模的工业化生产打下基础，也为制备其他药材提取物时提供借鉴思路。利用制各的芒果苷建立知母药材中芒果苷的含量检测方法，从而对古方白虎汤中的芒果苷进行初步研究，从芒果苷的角度研究白虎汤的配伍规律。8四川大学硕士学位论文2 从知母中制备芒果苷对照品的方法研究2 1 前言知母为百合科植物知母的根茎，味苦，性寒，归肺、胃、肾经【2 2 1 。具有清热泻火、滋阴润燥、止渴除烦等功效，主治温热病，高热烦渴，咳嗽气喘，燥咳，便泌，骨蒸潮热，虚烦不眠，消渴淋浊等症。知母根茎中含有大量甾体皂苷、双苯吡酮类成分。知母的甾体皂苷的甾体皂苷一直被认为是知母的主要活性成分，药典规定知母的质量检测时也是对知母所含的跋契皂苷元进行含量检测。现代药理研究发现芒果苷有助于御防腹膜巨噬细胞活性氧( r o s ) 的产生及组织的氧化损害1 ；芒果苷具有抗h s v i 和h s v i i 的活性，与其他抗病毒药物如阿昔洛韦等联用后，产生协同作用【2 4 1 ；芒果苷有保护肝脏的作用【4 】，并具有通过降低胰岛素的抵抗而产生治疗糖尿病作用【2 5 1 。药理药效研究表明，芒果苷具有抗氧化、抗细菌、抗病毒、免疫调节及抗肿瘤等多方面的生理活性和药理作用，是知母的重要活性成分之一【2 6 。鉴于芒果苷的重要生物活性，一些含知母的制剂已要求对知母制剂中的芒果苷的含量进行检测。论文报道从从知母中制备芒果苷对照品的的简单、快速、高收率的方法，这对于相关药物的质量控制，及为进一步的药效及活性研究提供样品具有重要作用。以i - i p l c 测定芒果苷的单体得率为指标，探讨了提取溶媒、提取方式、提取时间、液料比和提取次数对提取效果的影响，并运用正交试验对提取工艺进行优选；提取得到的浸膏进行一次硅胶柱层析和重结晶即分离纯化出单体；单体经波谱方法进行结构鉴定，经t l c 和h p l c 进行纯度检查和含量测定。实验表明本文建立的方法芒果苷对照品，方法简单快速，单体的纯度和回收率高。芒果苷结构式9四川大学硕士学位论文2 2 实验部分2 2 1 仪器与试剂a g i l e n t l l 0 0 高效液相色谱仪( 配备d a d 二极管阵列检测器) ( 美国安捷伦科技) ；k r o m a s i lc 一1 8 ( 5 u m ，4 6x2 5 0 m m )天津天和；r - 2 0 1 旋转蒸发器( 上海申生科技有限公司) ；熔点用x r c 一1 显微熔点测定仪( 四川大学科仪厂) 测定，温度未校正；核磁共振谱用v a r i a ni n o v a - 4 0 0 核磁共振仪( 美国v a r i a n 公司)测试。h p l c 分析所用乙睛为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。层析硅胶( 2 0 0 3 0 0 目) 为青岛海洋化工厂产品。知母药材购自成都市医药公司，经成都中医药大学严铸云副教授鉴定，符合中国药典2 0 0 5 年版一部的规定。2 2 2 含量测定方法准确称取2 0 9 知母药材( 粗粉) ，按实验提取方法制得提取液，离心过滤后减压浓缩、干燥得干浸膏。测定芒果苷的含量，称量干浸膏质量，按下式计算芒果苷单体得率和出膏率。芒果苷单体得率= ( 芒果苷的质量原药材质量) x1 0 0 出膏率= ( 干膏质量原药材质量) x1 0 0 采用h p l c 法测定芒果苷单体的含量。h p l c 条件见本论文第三章的相关部分。2 2 3 提取工艺的单因素实验2 2 3 1 提取溶煤的选择：四份知母分别加入6 倍量丙酮、9 5 乙醇、5 0 乙醇和水后，回流l 小时；2 2 3 2 提取方式的选择：四份知母加入5 0 乙醇，分别采用超声1 小时、冷浸4 8 小时，渗漉1 2 小时，回流l 小时进行提取；2 2 3 3 液料比的选择：知母分别加入3 ，5 ，7 ，9 ，1 1 倍的5 0 乙醇回流1 小时；1 0四川大学硕士学位论文2 2 3 4 提取时间的选择：知母加入6 倍量5 0 乙醇分别回流0 5 、1 、2 、3 、5 小时；2 2 3 5 提取次数的选择：知母分别加入6 倍量5 0 9 6 乙醇回流1 小时提取1 、2 、3 、4 、5 次。2 2 4 提取工艺的正交实验设计在单因素实验的基础上，用l 。( 3 ) 正交实验( 表i ) 对提取时间、液料比和提取次数进行试验，考察其对单体提取效果的影响，由此进行条件优化。表2 1 正交实验因素水平表! ! ! ：；：! ! ! ! 虫! ：1 2 曼照! ! ! ! ! ! 堂g ! 型婴曼i 型水平abcd提取时间hl12234液料比( v w )6 ：i8 ：11 0 ：1提取次数空白1232 3 结果和讨论2 3 i 提取工艺的单因素实验结果2 3 1 i 不同溶媒对提取效果的影响表2 2 不同溶媒的提取效果t a b 2 2e f l e e t so f d i f f e r e n ts o l v e n t s0 1 1e x t r a c t i o n不同溶媒对芒果苷得率和出膏率的影响很大。从芒果苷的得率分析：丙1 1四川大学硕士学位论文酮和水提取得效果较乙醇差，这是因为芒果苷既有脂溶性结构苷元，又有水溶性结构糖残基，使芒果苷的既有水溶性又有脂溶性，但总体上在乙醇中溶解性要更好些。从实验室及生产安全考虑，9 5 乙醇的醇浓度高，回流时乙醇挥发性高对于设备和环境的耐腐蚀、防火防爆德的要求远高于5 0 乙醇。故该实验选择5 0 乙醇作为提取溶剂。2 3 1 2 不同提取方式对提取效果的影响表2 3 不同提取方式的提取效果t a b 2 | 3e f l e e t so f d i f f e r e n tm e t h o do ne x t r a c t i o n总的分析表明：超声提取方式和回流方式效果显著好于渗漉和冷浸方式，不仅总单体得率高，而且提取时间短。与冷浸相比，超声能将能量传递到药材内部，加速溶剂对芒果苷的溶解。回流方式时溶酶分子热运动增加，能渗透到药材内部，在药材和溶媒间进行传质加速成分从药材中溶出。超声提取与回流提取得效果无显著差异，但考虑到大型超声设备费用昂贵，而回流设备简单常用，并且由于芒果苷的化学结构对热较稳定，不会因受热而受到较大破坏。故选用回流方式提取。2 3 1 3 液料比对提取效果的影响四川大学硕士学位论文图2 1 不同科液比的提取效果f i g 2 1e f f e c t so f s o l v e n t m a t e r i a lr a t i oo ne x t r a c t i o n适当的液料比不仅能使原料中的成分物质得到充分提取，而且可减少溶剂的浪费和节省提取成本。液料比对总单体提取率的影响见图2 。可以看出，随着液料比的增大，总单体的提取率呈上升趋势，但当料液比达到7 ：l ( v w ) 后提取率上升的幅度不明显，表明当料液比达到7 ：l ( v w ) 后溶剂用量趋于饱和，因而继续增大料液比对总单体的提取效果影响不明显，所以增加提取溶剂的用量只会造成溶剂浪费和增加溶剂回收成本。因此，初步确定正交试验的料液比在6 ：卜l o ：1 之间。2 3 1 4 提取时间对提取效果的影响四川大学硕士学位论文图2 2 不同提取时间的提取效果f i g 2 2e f f e c t so f t i m eo ne x t r a c t i o n从图2 可以看出，随着提取时间增加，总单体得率逐渐增加，但是时间超过3 小时后，检测发现总单体得率增加不明显。因此初步确定正交试验的提取时间范围为1 3 小时。2 3 1 5 提取次数对提取效果的影响图2 3 不同提取次数的提取效果f i g 2 3e f f e c to f t i m eo ne x t r a c t i o n从图3 可以看出，随着提取次数增加，单体得率也增加，当次数超过3 次以后，发现单体得率增加趋于平缓，从提取效率和成本考虑，初步确定正交实验的提取次数为卜3 次。2 4 提取工艺的正交实验结果根据单因素实验结果，采用5 0 乙醇回流提取，以芒果苷得率为指标，进行正交实验，结果见表4 。1 4四川大学硕士学位论文表24 正交实验结果! ! ! ：! ：! 壁竺塑! ! ! 些! g ! 型! ! 坠实验号因素芒果苷得率abcd表2 5 方差分析表! ! ! ：! 丛! 磐墅墨型! 慰也! 唑望方差离差自由度均方f 值p 值来源平方和直观分析表明，提取次数( c ) 对提取效果的影响最大，提取时间( a ) 和液料比( b ) 影响较小。表5 的方差分析表明，提取次数( c ) 对提取效果有显著四川大学硕士学位论文性影响( p 9 9 )乙睛a c e t o n i t r i l e ( 色谱纯)磷酸氢二铵( 分析纯)磷酸二氢钠( 分析纯)磷酸二氢钾( 分析纯)磷酸p h o s p h o r i ca c i d ( 分析纯)乐百氏纯净水实验仪器a g i l e n t l l 0 0 高效液相色谱仪k r o m a s i lc 一1 8 ( 51 - tm ，4 6x2 5 0 m m )水系样品过滤器( 1 3 m ) 0 4 5 1 1 md z f - 6 0 2 l 型真空干燥箱电子万用炉p h s 一4 f 酸度计美国天地f i s h e r 公司成都科龙化工试剂厂成都化学试剂厂成都化学试剂厂成都科龙化工试剂厂乐百氏公司美国安捷伦科技天津天和天津津腾上海精宏实验设备有限公司北京市光明医疗仪器厂成都市方舟科技开发公司3 2 2 知母药材中芒果苷i - i p l c 测定方法的建立3 2 2 1 色谱条件的确定要分离得好，有两条途径：一是谱带窄，即柱效高；再就是谱带间距离大。反相液框色谱提高分离度有三种方法可供选择：( 1 ) 提高色谱柱的塔板数；( 2 )改变有机相比例，以改变谱峰间距；( 3 ) 更换流动相溶剂以改变谱峰间距。所以要选择一种合适的流动相溶剂和溶剂比例。实验参照资料，选用乙氰和一种缓冲液的混合液作为混合流动相。在缓冲不好或离子浓度过低的分离中，会出现保留值重现性差和峰拖尾，增加缓冲浓度( 与样品大小相匹配) 能大大改善此情况。所以缓冲液的浓度以及p h 也要进行优化。色谱条件控制不好也会导致保留值与分离度发生变化，流动相变化能使色谱图变形，无论是一日之间还是每日之间。流速的改变能引起所有谱峰的保留时间突然改变，以及各次分析之间的不规则波动。所以实验过程中要保证一定四川大学硕士学位论文的流速和色谱柱温。但柱温对分离影响较小，故将柱温定为常用的3 5 c ，流速定为1 0m l r a i n - 1 ，而不再对流速和柱温进行实验确定。本实验初步将色谱条件的检测波长确定为：色谱柱：k r o m a s i lc - 1 8 ( 5 i i m ，4 6x2 5 0 m m ) ；流动相：乙睛一0 0 5 m o l k h z p 0 4 ( 缓冲液以磷酸调p h 至3 5 0 ) ( 5 ：9 5 ) ；柱温：3 5 c ；流速：1 0m l m i n 一；检测波长为3 1 7 n m 与2 5 7 n m ；每次进样量：2 0u1 。3 2 2 1 1 优化选择紫外检测波长用芒果苷溶液作紫外扫描，扫描结果如表3 1 所示：表3 1 芒果苷紫外扫描结果t a b l e3 ，1t h e r e s u l to f u rs c a n o f m a n g i f e r i n从扫描结果可知，芒果苷在2 2 5 n m 处有最大吸收，在2 5 8 n m 处仅次于2 2 5 n m处较大吸收，3 1 7 n m 处也有一较大吸收峰。但2 2 5 n m 处杂质成分的吸收也比较强，3 1 7 n m 处吸光度远小于2 5 8 n m 。按照预先初步确定的色谱调节进行h p l c 测定，采集2 2 5 n m 、2 5 8 n m 、3 1 7 n m 下的色谱图，经比较发现，在2 2 5 n m 和3 1 7 n m波长下的色谱图与3 1 3 n m 下采集的色谱图没有本质上的区别，但是2 5 8 n m 波长条件下的色谱的芒果苷峰的峰型尖锐对称，且信噪比要高一些，噪音水平比较低，基线较平稳，因此综合考虑选择2 5 8 n m 作为色谱条件的检测波长。四川大学硕士学位论文图3 i2 2 5 n m 波长下芒果苷船i j c 图f i g 3 1c h r o m a t o g r a mo f m a n g i f e r i n 缸2 2 5 n m图3 22 5 8 n m 波长下芒果苷h p l c 图f i g 3 2c h r o m a t o g r a mo f m a n g i f e r i na t2 5 8 n m图3 33 1 7 n m 波长下芒果苷i l p l c 图f i g 3 3c h r o m