（应用化学专业论文）大豆异黄酮的UVvis光谱电化学研究及CEUVvis检测.pdf

大豆异黄酮的u v v i s 光谱电化学研究及c e 。u v v i s 检测 摘要 大豆异黄酮属于黄酮类化合物，是一种天然抗氧化剂，是具有很高营养学 价值和治疗意义的非固醇类物质，能与雌激素受体结合，具有雌激素效应，故 也称之为植物雌激素。近几年研究发现大豆异黄酮对多种疾病包括肿瘤、心血 管疾病、骨质疏松症和更年期综合症预防与治疗起着重要的作用。染料木素和 黄豆苷原均属于大豆异黄酮，其氧化机理较复杂，迄今对其电氧化还原过程的 研究报道甚少。本文以含有0 5 m o f lk c l 的b r i t t o n r o b i n s o n 缓冲溶液为底液， 采用循环伏安法、微分脉冲伏安法等测试了染料木素和黄豆苷原在石蜡一石墨 粉末电极( o w e ) 电极上的电化学行为；采用双电势阶跃计时电流方法进行现场 薄层光谱电化学测试，对两者的电氧化还原过程进行了现场的动态检测；采用 高效毛细管电泳一紫外检测方法对染料木素和黄豆苷原进行了分离检测。 本文较为系统地检测了大豆异黄酮在g w e 电极上的电化学、光谱电化学 行为以及毛细管一紫外测试，获得了一些有意义的结果。第一，两种大豆异黄酮 表现的电化学特性十分相近，可见黄酮碳环上5 - o h 对大豆异黄酮类物质的电 氧化反应的影响甚微，其主要的电氧化反应都是分子中b 环上4 o h 的l c - 1 矿 的氧化反应，并伴随着随后的化学转化；第二、自制的石蜡一石墨碳糊电极对 大豆异黄酮有强的吸附作用，能显著增强反应电流信号，从而适宜作为研究电 极；在该电极上通过吸附富集，利用主氧化反应的微分脉冲伏安峰信号，可进 行电化学微量检测，检出限均约为4 1 0 m o l l ：第三、采用现场原位动态 光谱电化学测试得到了较为丰富的动力学信息，通过计算机数据处理由光吸收 信号获得了对应于不同组分的计时电势曲线，这种重构的计时电流曲线对应于 相应组分在反应过程中的薄层溶液浓度的变化，排除了吸附组分的贡献和阶跃 引起的充放电电流，能够具体反映液相中某确定组分参与步骤的速率，并且不 限于电子传递步骤，从而可以为电极反应过程的动态分析提供更丰富的信息： 第四、将毛细管电泳方法成功地用于对两种大豆异黄酮成分的分离检测。 关键词：大豆异黄酮；染料木素；黄豆苷原；循环伏安法；微分脉冲伏安法； 双电势阶跃：光谱电化学：电化学分析 u v v i ss p e e t r o e l e c t r o e h m i s t r ya n dc e u v v i sd e t e r m i n a t i o no f s o y b e a ni s o f l a v o n e s a b s t r a c t s o y b e a ni s o f l a v o n e ( s i f ) ，o n eo ff l a v o n o i d s c o m p o u n d s ，i san a t u r a l a n t i o x i d a n t i th a sh i g hn u t r i o l o g yv a l u ea n dt r e a t m e n tm e a n i n g ，c a nc o m b i n ew i t h e rs h o w se s t r o g e ne f f e c t ，s ow ea l s oc a l li tp l a n te s t r o g e n i nt h en e a rf u t u r e m a n y s t u d y sd i s c o v e rt h a ts i fp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei np r e v e n t i n ga n dt r e a t i n go fm a n y d i s e a s e ss u c h 勰t u r n o u t , c a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e ，o s t e o p o r o s i sa n dm e n o p a u s e s y n d r o m e g e n i s t e i n ( g e ) a n dd a i d z e i n ( d a ) a r eb o t hb e l o n gt os i f , h a v ec o m p l e x e l e c t r o o x i d a t i o nm e c h a n i s m 1 i t t l e l i t e r a t u r e sa b o u tt h e i re l e c t r i c o x i d a t i o n r u d u c t i o np r o c e s sh a sb e e nr e p o r t e du n t i ln o w t h i sw o r ks t u d i e di n b r i t t o n - r o b i n s o nb u f f e rs o l u t i o n s i n v o l v i n g 0 5t o o l l - 1k c la s s u p p o r t i n g e l e c t r o l y t e ，s t u d y e dt h ee l e c t r o c h e m i s t r yb e h a v i o r so fg ea n dd ao ng r a p h i t e w a x e l e c t r o d e ( g w e ) r e s p e c t i v e l yw i t hc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n dd i f f e r e n t i a lp u l s e v o l t a m m e t r y ( d p v ) ，u s e dt h ed o u b l ep o t e n t i a lc h r o n o a b s o r p t o m e t r yt e s t e dt h ei n s i t ut h i nl a y e rs p e e t r o e l e c t r o c h e m i s t r yp r o c e s sa n dt h eh i g l lp e r f o r m a n c ec a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ( h p c e ) 一u v v i si ns e p a r a t ed e t e c t i n go ft h et o ws i f t h er e s u l t s ：f i r s t ，t h et w os i fh a v ev e r ys i m i l a re l e c t r o c h e m i s t r yc h a r a c t e r i s t i c ， i tm e a n st h a t5 - o ho ft h ef l a v o n ec a r b o c y c l i ch a sn oi n f e c t i o nn e a r l yt ot h ee l e c t r i c o x i d a n tr e a c t i o n so fs i f ，4 一o ho fb r i n go c c u r1c _ l 矿o x i d a n tr e a c t i o n sa r em a i n e l e c t r i co x i d a n tr e a c t i o n s ，a n dg ow i t hs u c c e d e n te h e m i ct r a n s l a t i o n ；s e c o n d ， h o m e m a d eg w eh a ss t r o n ga d s o r p t i o nt os i f ，c a ns t r e n 留 h e nr e a c t i o nc u r r e n t s i g n a l ，s oi t ss u i ta sw o r ke l e c t r o d e ，d p vc a nc a r r yo ne l e c t r o c h e m i s t r ym i c r o d e t e c t i o n ，t h el i m i t so fd e t e c t i o nr a n g eb o t ha r ea b o u t4x1o - 7m 0 1 l - 1 ：t h i r d i t o f f e r sm u c hd y n a m i ci n f o r m a t i o ni nu s i n gt h eu v v i ss p e c t r o e l e c t r o c h r n i s t r y , t h e n w i t h c o m p u t e rc a na c h i e v er e c o n s t r u c t e dr e s u l t sf o rc o r r e s p o n d i n gc o m p o s i n g s t h e s ec u w e sc o r r e s p o n dt ot h ec h a n g eo ft h i nl a y e rs o l u t i o nc o n c e n t r a t i o no f d i f f e r e n tc o m p o s i n g s ，e l i m i n a t ea d s o r b e dc o m p o n e n t s c o n t r i b u t i o na n dc h a r g e d i s c h a r g ec u r r e n tr e s u l t e db ys t e p ，c a l lr e f l e c ts p e e do fs o m ec o n f i r m e dc o m p o n e n t s w h i c hp a r t i c i p a t ei np r o c e s so fl i q u i dp h a s e ，a n dn ol i m i te l e c t r o nt r a n s f e rp r o c e s s ； f o u r t h ，w eu s eh p c es e p a r a t et h et o ws i ft r i u m p h a n t l y k e y w o r d s ：s i f ；g e n i s t e i n ；d a i d z e i n ；c v ；d p v ；d p sc h r o n o a m p e r o m e t r i c ； s p e c t r o e l e c t r o c h e m i s t r y ；e l e c t r o a n a l y s i s i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及所取得的研究成果。据我 所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得盒g 曼王些态堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示感谢。 学位论文作者签名：撇 签字日期：讪占年f 月弓日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盒理王些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权金胆王业太堂可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复印手 段保存、编入学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：亩廖0 迓，导师签名：彳匀屯订江- 签字日期：k 品年f 月弓日 签字日期：九峭年1 月，日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第一章绪论 天然抗氧化剂是一类重要的生物活性物质，由于它可以清除人体代谢过程 中产生的自由基而具有延缓机体衰老的功效，研究抗氧化剂对于保障人体健康、 抗老防衰、防止食品腐败等方面具有重大意义【lj 。常用的人工合成的抗氧化剂 如b h a 、b h t 等使用过量会致畸、致癌，因此，开发、利用安全的天然抗氧 化剂的需求迫切。 天然抗氧化剂主要有一下几种类型： ( 1 ) 酚性物质类( 包括黄酮类化合物) ：羟基酪醇、酪醇、松脂醇、乙酰 松脂醇，鞣花酸、桔酸，木质素或阿拉伯木聚糖与酚性物质的结合产物，表儿 茶素、表桔儿茶素、咖啡碱、表儿茶素桔酸，羟基肉桂酸、儿茶素，槲皮素、 杨梅素、木犀草素、芹菜素、染料木素、黄豆苷原等。 ( 2 ) 磷酸脂类：磷酸酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、( 神经) 鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、甘油磷脂等，以及不饱和脂肪 酸类。 ( 3 ) 其他类：脱镁叶绿素a 和脱镁叶绿素b ，蛋白质，肽及氨基酸，维生 素e 、维生素c 、类胡萝b 素，糖与氨基酸褐变产物，某些醌类化合物等。 1 黄酮类化合物概况 黄酮类物质是一类低分子量的在自然界广泛分布的天然多酚类物质，具有 广泛的生物活性和药理活性。从植物系统学的角度，植物体产生黄酮的能力与 植物体木质化性质密切相关，因此黄酮类化合物主要分布在维管束植物中，而 在其它较低等的植物类群中分布较少。 黄酮类化合物是色原酮或色原烷的衍生物，是在自然界中以c 6 c 3 c 6 的方 式构成的三环天然有机物( 如图1 1 ) 。根据三碳链部分的成环、氧化和取代方 式的差异，可进一步分为黄酮、黄酮醇、双氢黄酮( 醇) 、异黄酮、双黄酮、黄 豆苷原烷醇、橙酮、花青素类等。在植物体中，黄酮类化合物因其所在组织不 同，其存在状态也不同。在植物体内大部分与糖结合，一部分以游离态存在。 o 2 一苯基色原酮( 黄酮)c 6 - c 3 c e 图1 1 黄酮类化合物的碳架结构 1 1 理化特性 黄酮类化合物多数为晶体，有色，少数( 如黄酮苷类) 为无定形粉末。游 离的苷元中，除二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄豆苷原烷及黄豆苷原烷醇有旋光形 外，其余则无。苷类由于在结构中引入糖的分子，故具有旋光形，且多为左旋。 其具有较好的水溶性，因具有酚羟基团，故显一定酸性，较易溶于碱液中。 1 2 生理活性及药理、保健作用研究 ( 1 ) 抗氧化、清除氧自由基作用 自由基性质活泼，有极强的氧化反应能 力。在体内自由基和脂质过氧化作用导致细胞结构改变和功能破坏，而引起癌 症、衰老、心血管等退变性疾病【2 1 。生物类黄酮具有清除自由基的能力，其机 理在于：与自由基反应阻止自由基引发；与金属离子螯合阻止羟基自由基生成： 与脂质过氧反应阻止脂质过氧化过程p j 。 ( 2 ) 抗癌、防癌作用黄酮类化合物抗癌、防癌的作用，主要是通过其抗 自由基作用、直接抑制癌细胞生长、抗致癌因子、抑制血管生长、提高机体免 疫力而实现1 4 】。黄酮类物质能产生抗癌作用的生物活性包括对酪氨酸激酶的抑 制作用、类激素作用、抗增生效应、抗扩散效应、抗氧化作用和免疫功能等。 由于生物类黄酮的抗氧化和清除自由基能力，它能有效地阻止脂质过氧化引起 的细胞破坏p j 。 ( 3 ) 抗肿瘤作用黄酮类化合物发挥抗肿瘤活性时，均有a 环与受体的 负电荷中心结合、c 环与受体的正电荷中心结合、其它部分通过氢键与受体发 生作用的共性，因其苯环上取代基的不同而具有不同的抗肿瘤活性。黄酮类化 合物的抗肿瘤作用主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡、促进抗肿瘤细胞增殖、干预 肿瘤细胞信号传导、促进抑癌基因表达等途径来实现【6 j 。 ( 4 ) 对心血管系统的作用黄酮类化合物具有扩张血管的作用，对血管活 性物质及影响活性物质的酶也有一定的作用，使其具有降低血管的脆性与渗透 性，改善血液循环状态，净化血液，降血脂、血糖和胆固醇，抗动脉硬化和血栓 形成【7 1 。黄酮类化合物对凝血因子具有较强的抑制作用，故表现出较好的抗凝 血作用【8 】。黄酮类化合物还可降低血管内皮细胞羟脯酸代谢，使内壁的胶原或 2 - 胶原纤维含量相对减少，利于防止血小板粘附凝集和血栓形成，有利于防治动 脉粥样硬化1 2 】。 ( 5 ) 对内分泌系统的作用主要体现在降血糖作用、激素样作用和对骨组 织的作用。生物类黄酮能够促进胰岛p 细胞的恢复，降低血糖和血清胆固醇， 改善糖耐量，对抗肾上腺素的升血糖作用【7 1 ，同时它还能够抑制醛糖还原酶( 可 引起糖尿病并发症) 作用，因此可以治疗糖尿病及其并发症。许多黄酮类物质因 结构与己烯雌酚相似而具有雌性激素样作用，它与甾类激素一样具有兴奋和抑 制双重效应，此外，还可用于治疗骨病和骨质疏松等症。 除上诉一些主要功用外，生物类黄酮还具有保护神经系统 9 1 ，免疫激活， 抗菌抗病毒，保护氧化损伤的神经管畸形细胞作用 1 0 l ，抗化学性肝损伤【1 1 1 ，调 节脂质代谢【捌，抗白血病【13 1 ，吸收紫外辐射，抗过敏，活血化淤【1 4 1 等作用。黄 酮类化合物的药理作用及其广泛，且每一种药理作用都有多种机制参与，很多 学者都在致力于这方面的研究。 1 3 黄酮类天然抗氧化剂研究的现存问题和展望 近年来随着分离提取技术的发展，发现了大量新黄酮类化合物，开发了数 种含有黄酮类物质的产品，但是对其仍缺乏全面的认识，如一些吸收、代谢、 活性机理不清，无法提高其稳定性，因此应加强此方面的工作。对黄酮类化合 物本身的抗氧化性和其还原产物的毒性，以及该类化合物与摄入量、金属离子 催化之间的关系也处于激烈的讨论中i l5 1 6 1 。一些已开发出的黄酮类药物与食 品，其结构复杂，并且作用位点较多，因而对一些病症缺乏针对性和选择性， 限制了其进一步开发和利用，这也是今后研究者所要解决的重要问题。 大致来说，还有待于深入研究的方面主要包括：天然抗氧化物在食品中的 作用，进入生物体内本身及其代谢产物的生理功能；天然抗氧化剂在生物体内 的毒性或病理活性；无毒、低廉、显效的天然抗氧化物的资源筛选、有效成分 提取、分离技术、结构鉴定及功效关系研究；如何运用生物技术、食品高新技 术等，从不同层次、不同途径调控实现已知天然抗氧化物的工业化生产等【i 。 大豆异黄酮作为一种具有特殊生理功能的天然活性物质，其独特的保健功 能和防治多种疾病的作用已普遍受到世人关注，而且其原料易得，价格低廉， 因此具有很高的开发利用价值和广阔的发展前景。通过对大豆异黄酮的开发， 不仅为大豆制品的开发提供新的途径，也为人们的健康提供新的素材。 2 大豆异黄酮研究开发应用价值 大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的次生代谢物，是多酚类混合物，主要 成份为染料木素和黄豆苷原( 图1 2 ) ，具有防癌、防骨质疏松症、改善妇女更年 期障碍、防心血管疾病等诸多生理功能。 异黄酮能对抗绝经后骨质丢失，提高骨密度( b o n em i n e r a ld e n s i t y ，b m d ) ， 大豆异黄酮在动物卵巢切除后能有效延缓骨质丢失。去卵巢大白鼠接受大豆异 黄酮饮食后，相对去卵巢空白对照组骨密度显著升高。在进步的异黄酮纯化 单体的实验中，大量的实验证实，染料木素能减少去卵巢引起的骨丢失，增加 b m d ，同时对子宫没有影响，提示异黄酮的作用机制并非与雌激素一致，可能 与前者具有更高的雌激素受体b 选择性有关【2 0 1 。在去卵巢小白鼠高钙高黄豆苷 原饮食实验中1 3 1 1 ，发现2 0 0 m g k g 黄豆苷原干预组1 2 周后，股骨的骨密度为 5 7 2 m g c m 2 ，取卵巢空白组则为5 3 8 m g e m 2 ，腰椎的骨密度无变化。该实验还发 现黄豆苷原和钙有协调作用，2 0 0 m g k g 黄豆苷原和2 5 m g 钙干预组观察到股骨和 腰椎骨密度均增加。染料木素和黄豆苷原对骨组织的作用并不完全相同，染料 木素主要作用于松质骨，而黄豆苷原均能提高松质骨和密质骨的b m d ，这可能 与不同异黄酮单体对雌激素受体亲和性以及各组织雌激素受体雅兴表大量存在 差异有关。 2 5 降血脂作用 大豆异黄酮降脂的可能作用机制有：可以促进胆酸的分泌；可以提高细胞 膜表面l d l r 的活性和数量；抑制h m g - c o a 还原酶的活性；增加血液中甲状腺 激素的浓度。李国莉【3 2 j 等人通过观察大豆异黄酮对高脂血症大白鼠血脂的影响， 结果表明与高脂组比较，添加大豆异黄酮剂量组大白鼠肝脏中的t c 、t g 、l d l - c 显著降低( p 0 0 5 ) ，l p l 活性显著增强( p 要0 5 0 匀4 0 4 5 0 4 0 01 0 02 0 03 0 04 0 0 o ( m v s ) 图2 1 0 氧化还原峰电势差值与扫速关系图 p h = 1 8 ，染料木素浓度0 0 5 r a m 在第三章，我们将由现场光谱电化学测试证实，参与氧化反应的主要是吸 附态的反应物，但也有少量溶液相中的反应物参与。 3 1 4 微分脉冲伏安( d p v ) 曲线 以g w d e 为工作电极，银一氯化银电极作为参比电极，铂电极作为对电极， 在以b r i t t o n - r o b i n s o n 缓冲溶液( 含0 5 m o l l k c i ) 为支持电解质，扫描速率为 0 1 v s ，染料木素为5 1 0 一m o l l ，p h 值为1 8 的条件下，用微分脉冲伏安法 对不同的富集电势和不同浓度染料木素溶液进行电化学测试。图2 1 1 是在不同 富集电势下测得的染料木素的d p v 曲线，从图上可以看出富集电势越正，氧化 峰峰电流越大，同时峰电势随着富集电势的正移而逐渐负移。这表明高的富集 电势显著促进了染料木素在电极表面上的吸附，并增强了其电氧化的电化学活 性。图2 1 2 和图2 1 3 分别显示了氧化峰峰电流f p 随着富集电势e f c 和其平方值 肺c 2 的变化曲线，亦说明电极过程受吸附控制1 5 引。 一l 乒 1 6 1 2 8 4 0 0 00 20 40 60 81 0 e | 图2 1 l 不同富集电势下测得的染料木素的d p v 曲线 浓度：0 0 5 m m ；p h = 1 8 ；扫速：1 0 0 m v s ：脉冲幅度：5 0m v ： 脉冲宽度：5 0m s ：脉冲周期：2 0 0 m s ：富集时间：3 0 s 富集电势从下到上分别为：0 1 ，o 2 ，0 3 ，0 4 ，o 5 ，0 6 ，o 7 v 1 2 1 0 8 i 6 4 2 0 10 20 30 40 50 60 7 c v 图2 1 2d p v 峰电流一富集电势关系图 ( 数据来自图2 1 1 ) - 2 0 一 1 2 1 0 8 6 4 2 0 o 0 10 2 0 3 0 40 5 4 c 2 v 2 图2 1 3d p v 峰电流一富集电势平方的线性关系 ( 数据来自图2 1 1 ) 图2 1 4 2 1 5 表明，在4 1 0 - 7 t o o ll - 1 4 l o - s m o ll - 1 范围内，d p v 氧化 峰电流与浓度呈线性关系，线性方程为f p ( 蚪= 0 1 1 2 + o 0 4 8 c ( 1 t m o l l ) ，线性相 关度为9 9 4 2 ，可以用于定量分析。检出限为4 1 0 - 7 m o l l 。 2 0 1 5 g 三1 0 o 5 0 o 0 6o 7o 80 91 0 e | 图2 1 4 不同浓度的染料木素溶液中测得的d p v 曲线 p h = 1 8 ；浓度：o 0 5 m m ；扫速1 0 0 m y s ；富集电势：0 6 v 富集时间：3 0 s ：脉冲幅度： 5 0 m v ：脉冲宽度：5 0 m s ：脉冲周期：2 0 0m s 染料木素浓度从上到下依次为：4 0 ，2 0 ，1 0 ，4 ，2 ，0 4 1 - l m o v l - 2 l 一 表2 3 不同浓度的染料木素溶液中测得的d p v 峰电流与浓度数值 2 0 1 5 1 0 0 5 0 0 01 0 2 0 3 04 0 c i t m 图2 1 5 峰电流与浓度线性关系图 ( 数据来自图2 1 4 ) 3 2 黄豆苷原的电化学测试 由于黄豆苷原与染料木素的结构十分相近，仅比染料木素在a 环5 位上少 一羟基，通过两者的电化学特性的对比，可以获得该位上羟基对电氧化反应过 程的影响。 3 2 1 黄豆苷原的c v 曲线 黄豆苷原的大范围循环伏安曲线上( 图2 1 6 ) 也有两个氧化峰a 1 、a 2 和一 个还原峰c l ，在同样的实验条件下峰电势与染料木素的很相近，其中氧化峰峰 电势比后者稍负一些，还原峰峰电势则比后者略正一些，表明分子中不存在a 环5 - o h 时，b 环上的o h 的氧化还原反应的可逆性有所提高，但影响的程度 十分有限。这表明两种大豆异黄酮的电氧化还原反应是发生在相同位置的羟基 上的，其中不包含a 环上的5 - o h 。 黄豆苷原氧化峰a 1 峰形突出、对称性好，是黄豆苷原的主氧化峰。在图 2 1 7 中可以看出c 1 是对应于a 1 的还原峰。黄豆苷原a 1 c 1 的峰峰电势差略 小于染料木素的，但仍 5 8 m v ，表明也是一对可逆程度非常低的吸附峰。同 样，主氧化峰峰电势显著高于槲皮素【5 2 】、芦丁【5 3 1 等带有b 环邻位双羟基的黄酮 化合物，可知其抗氧化能力也弱于后两者。 - 2 2 - 1 2 1 0 8 6 4 = 2 0 2 0 00 20 40 60 81 01 2 e 图2 1 6 黄豆苷原c v 图( _ 0 2 1 2 v ) ： 扫速1 0 0 m v s 浓度0 0 5 m m ；p h = 1 8 2 0 1 5 1 0 5 妻 。 5 - 1 。 1 5 0 20 4 0 60 8 1 0 e | 图2 1 7 黄豆苷原c v 图( 0 1 o 9 v ) 扫速1 0 0 m v s ：浓度0 0 5 m m ：p h = 1 8 3 2 2p h 值对c v 曲线的影响 以含0 5 m o l l k c l 的b r 缓冲溶液为支持电解质，p h 值分别为1 8 、3 3 、 5 7 、7 0 、8 0 、9 2 ，扫描速率为0 1 0 v s ，黄豆苷原浓度为5 1 0 m o l l ，测试 p h 对循环伏安曲线的影响，如图2 1 8 所示。 2 3 1 6 1 2 8 4 s 0 4 8 1 2 0 00 20 40 60 81 0 e | n 图2 1 8 不同p h 值的b - r 缓冲液中黄豆苷原的c v 图 黄豆苷原浓度：5 1 0 m o l l ；扫描速率：1 0 0 m v s ： p h 值( 从1 到6 ) ：1 8 、3 3 、5 7 、7 0 、8 0 、9 2 由图2 1 8 可见，随着缓冲液p h 值从1 8 增至9 2 ，黄豆苷原氧化还原峰 对a 1 c 1 的峰电势都向负电势方向移动，表明质子参与了氧化还原反应过程； 峰电流则随着p h 值的升高而明显降低，且在p h 3 3 时不能观察到还原峰c l 。 酸性条件对电氧化还原反应有利，适宜于作为电分析的电解液条件。 以氧化峰a l 的峰电势对p h 值作图可得到线性关系，峰电势岛。与溶液 p h 值的线性关系( 见图2 1 9 ) 为：e p ，a v = o 9 3 3 5 7 0 0 5 4 2 1 p h ，线性相关度 为9 9 8 6 7 。峰电势随p h 值变化的斜率为一5 4m v ，表明可能有等数量的质子 和电子参与反应，与黄豆苷原分子中b 环上4 _ o h 的l e 一1 h + 氧化反应基本相 符。所生成的高活性苯氧自由基中间体将迅速发生化学转化，生成较稳定的最 终产物，使峰峰电势差大大增加。在碱性条件下几乎无还原峰，可能是由于随 后的化学转化，高p h 更有利于这个化学转化，使电氧化产物都变成了更稳定 的最终产物，不能被还原。 与染料木素相比，黄豆苷原的分子结构只是在a 环上少了一个5 羟基，由 于具有较高电活性的羟基是b 环上的4 羟基，所以同样地，主氧化峰a 1 的反 应机理也应与染料木素的反应相同，黄豆苷原的抗氧化能力也比槲皮素、芦丁 的要弱。 吣叵 蔓2 1 9 氧化峰a j 的峰电势与p h 值的线性关系 3 2 3 尹学速率对c v 曲线的影响 样黑嚣篙翥酝器凝徽麓 e | 、 0 2 2 0 乏2 蝴 lz 导的染料木素的c v 曲线 柄 浓度o 0 5 r a m ；p h ：i 8 ； 一1 扫速从硎上依溉2 5 ，l o ，2 0 ，5 2 0 0 4 0 0 m v s 怒辫鞫鞲 性质。a 1 c 1 峰电势差随扫速增大而略有增加，表明高扫速下反应的不可逆性 有所加强。 3 5 3 0 2 5 2 0 姜1 5 a 1 0 5 0 05 1 01 52 0 v 1 尼( m v s ) 1 彪 图2 2 1 氧化峰a 1 峰电流与扫描速率平方根v 1 挖的关系 3 5 3 0 2 5 2 0 1 5 1 0 5 0 01 0 0 2 0 03 0 04 0 0 1 ，m vs 图2 2 2 氧化峰a l 峰电流与扫速的线性关系 当扫描速度达到1 0 0m v s 以上时，背景电流变大而不利于峰电流的测定。 为兼顾峰形和分析灵敏度，获得最佳信噪比，以下的电分析实验选取扫速为1 0 0 m v s ，峰形较好，且比较稳定。 3 2 4 微分脉冲伏安( d p v ) 曲线 以银一氯化银电极作为参比电极，铂电极作为对电极，g w d e 为工作电极， 在以b r i t t o n - r o b i n s o n 缓冲溶液( 含0 5 m o l l k c l ) 为支持电解质，扫描速率为 0 1 0 0 v s ，p h 值为1 8 的条件下，用微分脉冲伏安法对不同浓度的黄豆苷原溶 液进行电化学测试。 1 0 0 8 0 6 耋 0 4 0 2 0 60 70 8o 91 0 e | 、4 图2 2 3 不同浓度黄豆苷原的d p v 图 扫速1 0 0 m v s ；浓度0 0 5 m m ：p h 值为：1 8 ；脉冲幅度：5 0m v ； 脉冲宽度：5 0m s ：脉冲周期：2 0 0m s t 富集电势：0 6 v , 富集时间t3 0 s 浓度；从上到下分别为o 2 、0 4 、1 、2 、4 、1 0 、2 0 、4 0 1 1 m o l l 在4 x1 0 - 7 - 4 1 0 - 5 m o l l 的浓度范围内，在0 8 3 v 左右黄豆苷原有一个较为 明显的氧化峰( 见图2 2 3 ) ，随着浓度的降低，峰电流逐渐减小( 具体数值见表 2 6 ) 。峰电流与黄豆苷原的浓度在4 1 0 7 - 4 1 0 _ m o l l _ 1 范围内呈一定的线性 关系( 图2 2 4 ) ，线性方程式为：昂，。4 t a = 0 1 1 7 5 7 + 0 0 1 6c ( g m o l l - 1 ) ，线性相 关度9 9 9 4 。最低检出限为4 1 0 m o l l - 1 。 表2 4 峰电流与浓度数值 l x m o l l - 1 0 40 1241 02 04 0 i p 叠p 久 o 1 1 3 60 1 2 7 20 1 4 9 80 1 9 1 2 o 2 8 1 30 4 4 7 3o 7 5 1 2 0 8 0 7 0 6 0 。5 墨 0 4 h _ 0 3 0 2 0 1 o1 02 03 04 0 c i j t m o il 。 图2 2 4 峰电流与浓度的线性关系图 4 本章小结 ( 1 ) 染料木素和黄豆苷原在石蜡一石墨电极的电氧化反应均为吸附控制， 表明该电极对两者有很强的吸附作用，这种吸附富集作用使得在该电极上获得 的伏安峰信号强于文献中报导的其它电极上的信号，表明该碳糊电极适宜作为 染料木素和黄豆苷原的研究电极。 ( 2 ) 酸性介质明显有利于两种大豆异黄酮的电化学反应，并且伏安曲线上 表现出的两步氧化反应和一步还原反应中都有质子的参与。 ( 3 ) 大豆异黄酮分子中a 环5 位上有无o h ，对电氧化还原反应的影响很 小，染料木素和黄豆苷原的电化学反应机理可能是类同的。它们的第一步氧化 反应发生在b 环4 o h 上，可逆向进行，但电化学可逆性很低。 ( 4 ) 运用微分脉冲伏安法检测染料木素和黄豆苷原，具有较好的灵敏度和 稳定性，可用于两者的微量检测，检测限均约为4 x1 0 m o l l 。 第三章大豆异黄酮在石蜡一石墨粉末电极上的光谱电化学行 为 1引言 常规的电化学研究方法是以电信号为激励和检测手段，得到的是电化学体 系的各种微观信息的总和，难以直观、准确地反映出电极溶液界面反应过程中 物种形态、浓度的变化，这对正确解释和表述电化学反应机理带来很大的局限。 而光谱电化学是把光谱技术和电化学方法结合起来，在一个电解池内同时进行 测量的一种方法，使研究的对象从稳态的电化学界面结构和表面吸附扩展、深 入到表面吸附和反应的动态过程【5 5 1 。 现场光谱电化学方法研究电极溶液界面电化学和电极表面吸附态物种的效 果很好，其中红外光谱、拉曼光谱和紫外一可见光谱方法用途最为广泛，本实验 选用的是紫外一可见光谱法。常规的光谱电化学实验设施大都比较复杂，每一种 光谱方法一般都要设计特殊的电解池和光路耦合装置，并且常常要对光谱仪的 光路和检测系统进行一定的改装。长光程电解池的光学灵敏度比短光程的更高， 已有各种长光程光谱电化学池出现【5 6 删，本实验室前期工作已设计了一种结构 简单、使用方便、实用性强的长光程薄层电化学池，实际测量效果良好。 2 实验部分 2 1 实验仪器与试剂 u v - v i s 2 5 5 0 紫外可见分光光度计( 日本岛津) ，1 c m 光程的石英比色皿。其 它仪器及试剂同上一章。 ， 实验所用的各种溶液配制也同上一章。 2 2 实验装置 图3 1 光谱电化学分析系统实验示意图 2 3 长光程薄层光谱电化学池 本实验采用的是本实验室自行设计的一种长光程薄层光谱电化学池，结构 示意图见图3 2 【6 。 ( 1 ) 将实验中使用的比色皿直接作为电化学池的池体，这样就无需改装 u v - v i s 分光光度计的样品槽。 ( 2 ) 采用平行入射法，让入射光与电极表面平行擦过，可以得到电极反应 过程中薄层液相中反应物与产物的浓度变化。在本实验中，将电极表面竖直插 进比色皿，而比色皿中已有一块根据分光光度计的光路粘好的挡板，通过电极 板上下两端一定厚度的垫片与挡板形成一定的狭缝，此狭缝即为电解液薄层， 薄层厚度等于垫片的厚度( 0 2 r a m ) 。 ( 3 ) 在电极表面相对的挡板上钻出一圈小孔，挡板的另一侧装满溶液并放 置辅助电极，可减少体系的阻抗。小孔的直径尽量减小可消除外部溶液对薄层 池内溶液的影响，小孔的位置分布均匀使支持电解质离子通过d , - 孑l 形成比较均 匀的电流。参比电极放置在工作电极的背面，这样可使参比电极尽可能靠近工 作电极而远离辅助电极。 ( 4 ) 实验采用的使三电极系统，三电极的导线可以方便地从系统中引出。 7 a 9 围 bc 图3 2 长光程薄层光谱电化学池结构简图 a 自制电解池纽装b 研究电极c 挡板 1 研究电极2 挡板3 比色皿池4a g a g c l k c i 。t 参比电极5 铂网辅助电极6 薄 层垫片7 薄层8 导电铜箔9 石蜡一石墨粉末膏体1 0 参比与研究电极的通槽1 1 电流 通道孔 研究电极的制作：定制一5 0 m m ( 长) 1 0 r a m ( 宽) 2 0 r a m ( 厚) 的条形聚乙 烯板，各表面打磨光滑。将高度10 r a m 至2 0 r a m 挖空( e l 为分光光度计光束高度 范围) ，同时左右各留约1 5 m r n 宽余量以保证电极板不会断裂。将此余量处理 成如图所示的斜坡状使得电极的表面积为8 m m 9 6 r n m 同时侧面不会参加反 应。同时中空部分反面的上下两端也处理成一定的斜坡以保证将要填在其中的 电极材料不会脱落。定制另外一块聚乙烯板，处理成如图所示形状，贴上铜箔， 再将整个板与上述电极板粘在一起，形成工作电极的模板。将石墨粉与石蜡按 5 ：2 ( w w ) 混和均匀，于融化状态采用涂布法填入聚乙烯板凹槽内，表面用金相 砂纸打磨到镜面( 此时电极表面与板面持平) ，制成面积为8 m m 9 6 r a m 的石蜡 一石墨粉末电极( g w e ) 。 参比电极的制作：取长约4 5 m m 银丝，在市售8 4 消毒液中浸泡约2 小时。 裁取一根长约3 5 m m 的0 1 m m 玻璃管，底部用滤纸塞紧。注入饱和k c i 溶液。 将浸泡后的银丝冲洗干净后插入玻璃管中，上端用5 0 2 胶水封好，银丝露出部 分打磨光亮，这样就制作成了a g a g c l 参比电极。保存在饱和k c i 溶液溶液中 备用。 电化学池的组装：在研究电极如图3 2 所示处( 4 ) 挖出一条槽子，用来安放 自制参比电极。同时在电极的侧面小心挖出一条小槽，使参比电极和研究电极 在加入溶液后保持连通状态。在电极表面的上下两端聚乙烯板上贴上厚度 0 2 r a m 的盖玻片。将电极插入比色皿中后，装入溶液，通过左右活动赶走薄层 池中的气泡。用插销固定住电极。在与研究电极相对的溶液池中插入铂网辅助 电极，在插槽中插入参比电极，完成该长光程薄层光谱电化学池的组装。 后面通过铁氰化钾溶液来检测薄层池的性能，证明其有良好的薄层性质。结果 表明在厚度为0 2 m m 的薄层池中反应所表现出来的特征接近与理论上