（生物化学与分子生物学专业论文）水溶性红曲黄色素的分离纯化与结构鉴定.pdf

i i l lll ii ll l ll li lli iu l y 17 4 815 4 p u r i f i c a t i o na n ds t r u c t u r ei d e n t l f i c a t i o no f w a t e r s o l u b l em o n a s c u sy e l l o wp i g m e n t s d i s c i p l i n e ： s c i e n c e s u b j e c t ： s p e c i a l t y ： b i o l o g y b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y r e s e a r c hf i e l d ：e x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fn a t u r a ip r o d u c t s p o s t g r a d u a t e ：l ij i a n s u p e r v i s o r ： s u b m i t t e dd a t e ： c o l l e g eo fl i f es c i e n c e g a n c h u n j i a p r i l ，2 0 1 0 f u j i a na g r i c u l t u r ea n df o r e s t r yu n i v e r s i t y f u z h o u ，f u j i a n ，p r c h i n a ，3 5 0 0 0 2 a p r i l ，2 0 1 0 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位c 论文储亲笔虢名气乳吼孙7 h 口 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在五年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 指导教师 毒。| 赴 矿 日期：如t 。，b - p q 吖 摘要 a b s t r a c t 目录 第1 章绪论。 1 1 红曲色素概论 1 1 1 红曲的历史l 1 1 2 红曲菌微生物学的研究1 1 1 3 红曲菌的代谢产物及其应用2 1 1 4 红曲色素的结构及生物合成途径3 1 2 红曲色素衍生物的开发与现状 1 2 1 水溶性红曲黄色素的开发6 1 2 2 水溶性红曲黄色素的现状。6 1 3 分离纯化方法。6 1 3 1 薄层色谱法。6 1 3 2 高速逆流色谱法7 1 3 3 高效液相色谱法7 1 4 结构鉴定方法9 1 4 1 质谱简介：9 1 4 2 液相色谱质谱联用技术1 0 1 4 - 3 多级质谱技术1 l 1 4 4 高分辨质谱技术l l 1 5 质谱图谱解析 1 6 本研究的目的与意义 第2 章水溶性红曲黄色素的提取与分离 2 1 引言 2 2 材料与方法 1 4 1 4 2 2 1 仪器设备1 4 2 2 2 材料试剂1 4 2 2 3 实验方法14 2 3 实验结果 2 4 i 寸论。 1 6 2 4 1 样品萃取剂的比较l6 2 4 2 固定相的选择16 2 4 3 展开剂的选择16 2 4 4 相对湿度的影响1 7 第3 章水溶性红曲黄色素的纯化。 3 1 弓i 言 3 2 材料与方法 l l ； 1 8 3 2 1 仪器设备j 18 3 2 2 材料试剂。l9 3 2 3 实验方法19 3 3 实验结果 3 3 1 水溶性黄色素色谱图2 0 3 3 2 水溶性黄色素时间波长吸光值三维光谱色谱图2 1 3 3 3 不同组分峰前沿和峰后沿的光谱比照图2 l 3 4 讨论。 3 4 1 不同色谱柱的影响2 2 3 4 1 流动相中甲醇的比例的影响2 3 3 4 1 蒸发光散射检测器参数的影响2 3 第4 章水溶性红曲黄色素的结构鉴定2 4 4 1 引言。2 4 4 2 材料与方法2 4 4 2 1 仪器设备2 5 4 2 2 材料试剂2 5 4 2 3 实验方法2 5 4 3 实验结果。 4 3 1 水溶性红曲色素总离子流图2 6 4 3 2 高分辨质谱图及结果表。2 6 4 4 谱图解析 4 4 1 组分a 1 的裂解途径3 0 4 4 2 组分b 1 的裂解途径3 2 4 4 3 组分c 1 的裂解途径3 5 4 4 4 组分a 2 的裂解途径3 8 4 4 5 组分b 2 的裂解途径4 0 4 4 6 组分c 2 的裂解途径4 3 第5 章结论与展望 5 1 结论 5 2 展望 致谢 参考文献 4 7 4 8 5 0 摘要 红曲色素是天然色素的重要组成部分。近年来，随着食品安全意识深入人心， 红曲色素以其安全，稳定，低廉的优势而备受关注。然而，我国红曲色素产品单 一，生产水平低，品质不稳定等方面，成为了中国红曲产品拓展国际市场的巨大 障碍。因此，开发新型天然色素，改善红曲色素品质，提高产品竞争力，成为我 国食品添加剂行业的发展重点。 “水溶性红曲黄色素”的开发，拓展了红曲色素产品的应用领域，标志着我 国红曲色素产品研发水平进入了一个新阶段。但是，该红曲色素衍生物的分子结 构尚不明确，给产品的推广应用及其工业化技术革新带来了一定障碍。本文以分 离纯化水溶性红曲黄色素为基础，鉴定并阐明各组分的分子结构为目标：笔者以 工业化生产的水溶性红曲黄色素为原料，采用薄层层析法，高效液相色谱法，光 电二极管阵列检测秘蒸发光散射检测器联用技术，液相色谱一电喷雾质谱仪联用 技术，多级质谱技术，高分辨质谱技术等实验方法，经过了大量的实验，确立了 较优的色谱质谱条件，完成了水溶性红曲黄色素6 个主体组分的分离纯化与结构 鉴定工作。主要研究结果如下： 1 建立了水溶性红曲黄色素的薄层色谱分离条件。以色谱级甲醇为提取剂， 三氯甲烷：甲醇= l ：l ( v v ) 为展开剂，展开3 0 分钟，能够有效地分离水溶性红 曲黄色素。 2 依据薄层色谱的初次分离得到的不同色带，利用高效液相色谱法进一步分 离纯化，并确立了较优的色谱条件。同时，光电二极管阵列检测黔蒸发光散射 检测器联用条件的确立，为液质联用仪中的液相色谱部分奠定了基础。采用美国 w a t e r s 公司s u n f i r ec 1 8 柱( 4 6m m 1 5 0m m ，5g m ) ，0 8m l m i n 流速，甲醇和 水梯度淋洗( 见表3 1 ) ；蒸发光散射检测器要求气体压力2 5p s i ，喷雾器温度4 5 ，漂移管温度6 0 ，增益为1 。 3 多种质谱技术的应用，确定了不同组分的分子量和元素组成( 见表5 1 ) ， 从而为各组分分子结构的分析以及裂解途径的推断提供了可靠的信息来源。 该论文的完成，深化了我们对水溶性红曲黄色素结构层次的认识，为加快工 业化技术创新，扩大产品的应用推广，稳定产品品质奠定基础。同时，也为相关 标准的制定提供依据和参考，为改善人们的生活品质具有促进作用。 关键词。 水溶性红曲黄色素分离纯化结构鉴定高效液相色谱法液质联用 i i a b s t r a c t m o n a s c u sp i g m e n ti sa l li m p o r t a n tp a r to ft h en a t u r a lp i g m e n t i nr e c e n ty e a r s ，w i t h t h ef o o ds a f e t ya w a r e n e s sd e e p l yr o o t e di nb s ，p i g m e n t sf r o mm o n a s c u sh a v eb e e n m u c hc o n c e m e d 、析t i lt h e i rs e c u r i t y , s t a b i l i t y , l o w - c o s ta d v a n t a g e h o w e v e r ，s o m e q u e s t i o n ss u c ha st h ep r o d u c to fas i n g l e ，l o wq u a l i t ya n di n s t a b i l i t yh a v em a d et h e m l o s tp a r t so fi n t e r n a t i o n a lm a r k e t t h e r e f o r e ，t od e v e l o pn e wn a t u r a lp i g m e n t sh a s b e c o m et h ef o c u so fd e v e l o p m e n to f f o o da d d i t i v e si n d u s t r y t h ed e v e l o p m e n to f ”w a t e r - s o l u b l em o n a s c u sy e l l o wp i g m e n t s ”m a ye x p a n dt h e r a n g eo ft h e s ep r o d u c t s u s a g e a tt h es a m et i m e ，i ti n d i c a t e st h a tc h i n a r&dl e v e l o fm o n a s c u sp i g m e n ti n t oan e ws t a g e h o w e v e r , t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo ft h e s e p i g m e n td e r i v a t i v e sa r en o tc l e a r a n di t i sar e s i s t a n c eb a r r i e rf o ra p p l i c a t i o no f t h e s ep i g m e n t s t h ea u t h o ra i m st os t r u c t u r ei d e n t i f i c a t i n go ft h ew a t e r - s o l u b l e m o n a s c u s y e l l o wp i g m e n t sb yt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y , h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , p h o t o d i o d ea r r a yd e t e c t o r - e v a p o r a t i v el i g h ts c a t t e r i n g d e t e c t o r c o u p l e dt e c h n i q u e ，t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y f i n a l l y , t h ea u t h e rh a v eg o t6m a i n c o m p o n e n to fw a t e r - s o l u b l em o n a s c u s y e l l o wp i g m e n t ( s e ec h a p t e r5 ，t a b l e 5 1 ) t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n tw e r ea sf o l l o w s ： 1 t l cw a se s t a b l i s h e dt os e p a r a t et h ec o m p o n e n t so fw a t e r - s o l u b l em o n a s c u s y e l l o wp i g m e n t w i t hm e t h a n o la se x t r a c t i n gs o l v e n t ，c h l o r o f o r ma n dm e t h a n o l ( v v ) w a su s e da sd e v e l o p i n gs o l v e n to ft h e s ep i g m e n t s a f t e r3 0m i n u t e s ，w a t e r - s o l u b l e m o n a s c u sp i g m e n t sc a r lb ee f f e c t i v e l ys e p a r a t e d 2 b a s e do nt h ec r u d es e p a r a t i o n b yt l c ，t h eo p t i m u mc h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n so fh p l cw e r ee s t a b l i s h e dw h i c hi sw i t hw a t e r ss u n f i r ec 18c o l u m n ( 4 6 m m x15 0m m ，5 r t m ) ，0 8m l m i n ，g r a d i e n te l u t i o n o f m e t h a n o la n dw a t e r ( s e et a b l e 3 1 ) a n ds oo n a tt h es a m et i m e ，t h eh y p h e n a t e dt e c h n i q u eo fp h o t o d i o d ea r r a y d e t e c t o rw i t he v a p o r a t i v el i g h ts c a t t e r i n gd e t e c t o rp r o v i d e sab a s i sf o rl c - m s 3 t h ea p p l i c a t i o no fav a r i e t yo fm a s ss p e c t r o m e t r yt e c h n i q u e sp r o v i d e da r e l i a b l es o u r c eo fi n f o r m a t i o nf o re a c hc o m p o n e n to ft h em o l e c u l a rs t r u c t u r ea n d i i i f r a g m e n t a t i o np a t h w a y t h ec o m p l e t i o no ft h i sp a p e ri s g o o d a tu n d e r s t a n d i n go ft h e i rs t r u c t u r e ， e x p a n d i n gp r o d u c ta p p l i c a t i o n s i ta l s ow i l lc o n t r i b u t et op r o v i d ear e f e r e n c ef o r r e l a t e ds t a n d a r d sa n dt oi m p r o v et h eq u a l i t y - o fl i f eo fp e o p l e k e yw o r d s ： w a t e r - s o l u b l em o n a s c u sp i g m e n t s s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n s t r u c t u r e - i d e n t i f i c a t i o nh p l cl c m s i v 1 1 红曲色素概论 1 1 1 红曲的历史 第1 章绪论 红曲，在我国古代又称为“丹曲、“赤曲”、“红米”等，是红曲菌在蒸煮过 的米饭上生长并发酵的产品。红曲历史悠久，早在汉代王桀诗赋七释中即有 “西旅游梁，御宿素餐，瓜州红曲掺揉相拌，较滑膏润，入口流散 的记载；宋 初陶谷的清异录中有“以红曲煮肉 的词句。然而，其药用价值的记载始于 元朝吴瑞的日用本草，其中写道：“红曲酿酒，破血行药势”。至明朝，李时 珍撰写的本草纲目和宋应星撰写的天工开物对红曲米的制作方法及用途 已经作出了明确的记载，并对其药用价值给予了更加充分的肯定。本草纲目 中写道“红曲甘、温、无毒，主治消食活血，健脾燥胃，治赤白痢下水谷 。 1 1 2 红曲菌微生物学的研究 红曲菌( m o n a s c u ss p p ) 最早由中国人发现，并应用于生产生活中。然而， 红曲菌的分类与命名却最早由法国学者v a nt i e g h o m 于1 8 8 4 年完成，并由此开 始了红曲菌的微生物学研究。多数红曲菌在蒸熟的米饭或土豆葡萄糖琼脂培养基 上，生长繁殖数天即可呈现明显的红色，如图1 1 所示。 o 图1 1 红曲菌菌落与红曲米3 】 f i g u r e1 1 c o l o n i e so fm o n a s c u sa n dr e dr i c e t 3 】 - 红曲茵( m o n a s c u s ) 属于真菌界( e u m y c o p h y t a ) ，子囊菌门( a s c o m y c o t a ) ， 真子囊菌纲( e u a s c o m y c e t e s ) ，散子囊菌目( e u r o t a l e s ) ，红曲菌科( m o n a s c a c e a e ) ， 红曲菌属( 胁，脚伽) 3 】。如今，有至少5 8 个种在美国典型微生物菌种保藏中心 ( t h ea m e r i c a nt y p ec u l t u r ec o l l e c t i o n ，a t c c ) 保藏；但是，依据1 9 8 3 年 h a w k s w o r t h 和p i t 的研究报告【4 】，其实大多数红曲菌只属于以下三个种：丛毛红 曲菌( m p i l o s u s ) ，紫色红曲菌( m p u r p u r e u s ) ，红色红曲菌( m r u b e r ) 。 目前，在我国红曲色素和功能性红曲工业生产中，紫色红曲菌( m p u r p u r e u s w e n t ) 和红曲红曲菌( m a n k an a k a s a w a s a t o ) 应用得较为普遍，并得到了我 国卫生监管部门的认可。 1 1 3 红曲菌的代谢产物及其应用 红曲菌代谢产物丰富，主要应用在着色剂、发酵剂及医疗保健品三大领域。 我国古代医学家早在明代就已经将红曲应用于医学领域，但是对其中不同成分的 分离提纯，功能阐述并未明确。1 9 3 9 年日本学者远藤章( a k i r ae n d o ) 从红曲红 曲菌( m r u b e r ) 的发酵物中分离出了莫纳可林k ( m o n a c o l i nk ) 。该物质与土霉 素发酵产生的洛伐它汀( l o v a s t a f i n ，m e v i n o l i n ) 是同一种物质，能够有效地抑 制胆固醇生物合成的关键酶h m g c o a 还原酶( 3 羟基3 甲基戊二酰基辅酶a 还原酶，3 - h y d r o x y l - 3 - m e t h y lg l u t a r y lc o a r e d u c t a s e ) 的活性，阻碍了胆固醇的合 成，从而达到调节异常血脂的作用，并对低密度脂蛋白胆固醇的抑制有特异作 用。 着色剂红曲色素是产业化程度最高的红曲产品之一，已经广泛地应用于肉制 品加工、果汁饮料、酱油、红醋、化妆品等生产中。目前市场上的红曲产品有红 曲米、红曲红、功能性红曲、红曲酒、红曲豆腐等。我国的红曲米和功能红曲已 国际市场，美国以食品辅料从中国进口功能红曲，欧洲则以食品配料的名 国进口红曲，用于肉制品的生产。随着全球经济一体化的发展，我国的国 总量不断增加，红曲产品的需求量与日俱增。为提高产品品质，规范企业 我国制定了一系列红曲产品的国家标准，见表1 1 。 2 丞溘世! e 曲基鱼塞的公彦纯丝! i 结翘鉴定 表1 1 红曲产品的国家标准( 现行) t a b l e1 1 n a t i o n a ls t a n d a r d so f m o n a s c u sp r o d u c t s i i 4 红曲色素的结构及生物合成途径 红曲色素是红曲菌的次生代谢产物之一，由一系列聚酮类化合物组成。红曲 色素是一种由橙色、黄色和红色化合物组成的混合物。虽然应用方面起主要作用 的是红色部分，但是目前的应用并没有必要进一步分离。许多学者【5 】认为，红曲 色素包括至少1 0 种以上的色素部分，但是只有少数组分结构被鉴定了出来。目 前，结构已阐明的色素有6 种【6 】，可分为3 类：红斑素( r u b r o p u n c t a t i n ) 、红曲 红素( m o n a s c o r u b r i n ) 呈橙色，红曲素( m o n a s c i n ) 、红曲黄素( a n k a f l a v i n ) 呈 黄色，红斑胺素( r u b r o p u n c t a m i n e ) 与红曲红胺素( m o n a s c o r u b r a m i n e ) 呈紫红 色，均是非水溶性的，可溶于有机溶剂。其结构【6 l 如图1 2 所示。 r o r = c s h llr l l 脚l 联恤i n 红斑素m = 3 5 4 2 r = c t r 玉5 瑚s c 岫红哇自红素m = 3 8 2 2 ( a ) 橙色组分结构式( o r a n g e ) 3 r o r 嘲lm 咖s c i l l 红岳嗦m = 3 5 8 2 r 删5a n k a f l a v i n 红曲黄素m = 3 8 6 2 ( b ) 黄色组分结构式( y e l l o w ) r o r 产c ! 一l lr | 蛔叩哪觚i m 红斑日安素 m = 3 5 3 2 r = c _ q h l 5m 溉& 0 n j b r 跚妇红曲躐m = 3 8 1 2 ( c ) 紫红色组分结构式限e d ) 图1 2 红曲色素六种主要组分结构式 6 1 f i g u r e1 2 s t r u c t u r eo fm o n a s c u ss p p i g m e n t s 红曲菌利用直接或间接利用葡萄糖，经代谢反应生成乙酰c o a 和丙二酰 c o a ，并以此原料，二者在聚酮体合酶( p o l y k e t i d es y n t h a s e s ，p k s s ) 的作用下生 成四酮化合物，四酮化合物与1 分子丙二酰c o a 进一步反应，生成五酮化合物， 如此循环使酮基化合物碳链加长，最后生成不同种类的色素组分 7 1 ，见图1 3 。此 外，不同色素之间能够发生一些转化反应，见图1 4 。对于红曲色素生物合成的 深刻认识，必然对水溶性红曲黄色素的谱图解析过程有重要作用。 4 丞渣世! e8 自速鱼塞的公寓纯丝芝结担鉴定 r 乙酰c o a + 丙二酰c o a 上 聚酮合成酶 四酮化合物 五卜 六酮化合物 上 红曲色素 丙二酰c o a 2 图1 3 红曲色素的生物合成途径 f i g u r e1 3 b i o l o g i c a ls y n t h e s i so fm o n a s c o r u b r i n r z o oo r 2 9 h 1 l & c t h l s 图1 4 红曲色素问的转化 f i g u r e1 4 t r a n s f o r m a t i o no f m o n a s c u sp i g m e n t s 1 2 红曲色素衍生物的开发与现状 5 。 泓j 璃 乏； 丙 1 2 1 水溶性红曲黄色素的开发 随着食品安全意识深入人心，天然色素替代合成色素，已经成为一种历史潮 流。目前，红曲色素已经进入了国际市场，美国和欧洲分别以食品配料和食品辅 料的名义从我国进1 ：3 红曲色素，作为着色剂和防腐剂代替合成色素和亚硝酸盐用 于火腿肠的生产。红曲色素以其对酸碱稳定、耐热性好、耐光性好、不受金属离 子及其氧化剂和还原剂的影响、安全性高等特点，受到了海外市场的热捧。然而， 我国红曲色素产品单一，生产水平低，品质不稳定等因素，成为了红曲产品拓展 国际市场的巨大障碍。因此，开发新型天然色素，改善红曲色素品质，成为我国 食品添加剂行业的发展重点。水溶性红曲色素衍生物的研究与开发，正是在这种 产业背景下，应运而生。 自上世纪9 0 年代起，以甘纯玑教授【l 】为代表的一批学者开始对红曲色素衍 生物进行开发研究，并取得了一定的成绩。2 0 0 1 年8 月，“水溶性红曲红色素和 黄色素的制备” 2 1 被国家知识产权局授予发明专利并授权公告。该产品的研制成 功，拓展了红曲色素的应用领域，也标志着我国红曲色素产品研发水平进入了一 丛渣世红凿埴鱼盍曲佥直纯丝皇结翅鉴定 色谱技术操作简单，分析速度快，不需要昂贵的仪器设备，结果直观，并有较高 的分离能力，尤其是在大量样品的检测方面优势突出，被广泛地应用于复杂样品 的分析中。红曲色素系红曲菌的次生代谢产物，种类繁多，应用薄层色谱分离红 曲色素，在各种文献中屡见不鲜5 】【8 】【9 1 。因此，选择薄层色谱法分离水溶性红曲 黄色素也成为了本实验的首选。 ( 1 ) 样品萃取剂的比较：样品预处理的关键一步是选择合适的萃取溶剂。红 曲色素是一系列聚酮类化合物的混合物，是红曲菌次生代谢产物的重要组成部 分。多为醇溶性色素，少数为水溶性色素。水溶性红曲黄色素是在其基础上化学 衍生而得到的。实验表明，甲醇是该衍生物的最佳萃取剂。 ( 2 ) 固定相的选择：本文作者分别选择了氧化铝，柱层析硅胶和薄层硅胶试 剂三种固定相进行实验，并比较了分离度和分辨率。笔者发现，氧化铝作为固定 相时分离效果最差，薄层硅胶试剂最好；因此，作者选用薄层硅胶试剂作为本项 目的薄层层析固定相。 ( 3 ) 展开剂的选择：虽然选择展开剂有许多理论依据及数学推导，但因为分 析的对象千变万化，多数情况下是在基本理论的指导下，根据个人经验选择最佳 展开剂，过程中除了需要密切关注相邻峰的分离度外，也要考虑色谱峰分离数的 多少。 1 3 2 高速逆流色谱法 高速逆流色谱( h i g hs p e e dc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ，h s c c c ) 是一种 液液色谱分离技术。它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特 殊的单向性流体动力学平衡，以其中一相作为固定相，另一相作为流动相，由于 行星运动产生的离心力场使得固定相保留在螺旋管内，而流动相不断穿透固定相 从螺旋管出口处流出。这样两相溶剂实现了连续、高效的混合和分离，随流动相 进入螺旋管的溶质在两相溶剂之间反复分配按分配系数的次序，依次被洗脱。由 于没有固体支撑，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，从而避免 了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，尤其适合于天然生物活性成 分的分离。 1 3 3 高效液相色谱法 高效液相色谱法( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 是一种 重要的现代分离分析技术。由于它采用了新型高压输液泵、高效微粒固定相和高 灵敏度检测器，使其具备了分析速度快，分离效率高，选择性高，检测灵敏度高 等特点，已经广泛应用于天然产物、合成药物、生物大分子等研究中。 检测器是液相色谱仪的三大关键部件之一，在液相色谱中具有举足轻重的地 位，在分离分析含有复杂组分的实际样品时，由于其中各组分具有不同的物理化 学特性，使用单一检测器检测，往往难以得到完全的信息。为了在液相色谱一次 分离检测中得到更多更准确的定性定量信息，不同的检测器联合使用可以发挥各 检测器的优点，一次色谱进样分析得到更多、更准确的信息。检测器联用的方式 有如下几种：串联、并联和一体化。本实验中，运用光电二极管阵列检测器 ( p h o t o - d i o d e a r r a yd e t e c t o r , p d a d ) 和蒸发光散射检测器( e v a p o r a t i v e l i g h t s c a t t e r i n gd e t e c t o r , e l s d ) 串联方式进行检测，得到了良好的效果。 光电二极管阵列检测器( p d a d ) 始于2 0 世纪7 0 年代，是在紫外可见光 检测器( u l t r a v i o l e t v i s i b l ed e t e c t o r , u v o v i s ) 的基础上发展起来的。与传统的色 散型紫外可见光检测器相比，它具有典型的“倒光学系统”【l l 】，一次进样可以 得到色谱组分的时间波长吸光值三维光谱色谱图，为分析工作者提供十分丰富 的定性定量信息，尤其在峰纯度的检验方面，优势突出。 蒸发光散射检测器( e l s d ) 是一种新型的通用性检测器，其响应不依赖于 样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影 响；对热不稳定和挥发性化合物亦有较高灵敏度；广泛的梯度和溶剂兼容性，无 溶剂峰干扰1 1 l 】。另外，由于蒸发光散射检测器的色谱条件与质谱条件要求是一致 的，流动相均在样品检测前挥发除去。所以，使用高效液相色谱法蒸发光散射 检测器联用( h p l c e l s d ) 可以为液质联用( l i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym a s s s p e c t r o s c o p y ，l c m s ) 摸索色谱条件，节省昂贵的l c m s 系统的操作成本，可 作为低成本的质谱检测方法的开发工具。 对色谱图中某一色谱峰定性定量之前，确定该峰是单一的化合物还是几种化 合物的混合物是十分重要和必要的。只有当确认未知峰基本上是单一化合物之 后，定性定量工作才是可靠和正确的。目前常用的方法【1 2 】如下： ( 1 ) 光谱重叠法：在色谱峰的不同部位( 通常是峰前沿、峰顶和峰后沿) ， 8 分别取该点光谱图经归一化处理后进行比较，依据重叠程度判断峰纯度。 ( 2 ) 多重吸收比率：不同检测波长下两个信号，采用两个检测信号比对时间 作图检测信号比率图，若得到的是一条直线，则可判断为纯峰。 ( 3 ) 光谱抑制法：该方法是在方法二的基础上进一步发展，测定两个波长信 号差出，并以彳对分析时间作图，得到差示光谱图。若该峰是一个纯物质时， 该差示光谱图应为零信号；若是混合物是，该差示光谱图应为非零信号。 ( 4 ) 色谱光谱三维图：作者利用“光谱叠加法 ，通过对照色谱峰的峰前沿， 峰后沿两个位置的光谱图来确定色谱峰的纯度。另外，三维光谱色谱图和选择 离子流图( 见第4 章) 也同样反应了峰纯度这一问题。 1 4 结构鉴定方法 有机质谱是鉴定有机化合物结构的重要工具之一。它可以提供分子量信息和 极其丰富的碎片离子信息，广泛地应用在天然产物鉴定、药物分析，多肽、蛋白 质化学等领域。质谱方法以其高灵敏度、高分辨率和分析速度快而居于特别重要 的地位，通常只需要微克级甚至更少的样品即可得到很好的、可供结构鉴定的质 谱图，一次分析仅经历几秒，甚至不到1 s 的时间就可以完成。 1 4 1 质谱简介 质谱( m a s ss p e c t r o s c o p y ，m s ) 仪器一般由真空系统、进样系统、离子源、质 量分析器、检测器和计算机系统组成【13 1 ，如图4 1 所示。样品分子在离子源内被 电离，产生各种各样的离子。这些离子经过质量分析器后，按照其质荷比m z ( 即 离子质量与其所带电荷的比值) 分离，分离后的离子依次被检测器检测，其相应 强度被记录下来，形成了一个以离子质荷比为横坐标，相应强度为纵坐标的质谱 图。 9 c 鲫咖c 洲 图4 1 质谱仪器的基本结构1 3 】 f i g u r e4 1 b l o c kd i a g r a mo fam ss y s t e m 1 4 2 液相色谱质谱联用技术 液相色谱质谱( l c m s ) 联用技术的研究开始2 0 世纪7 0 年代，然而，由于液 相色谱仪流动相为液体，接口技术不成熟的限制，液质联用技术发展缓慢，直到 9 0 年代电喷雾电离( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n ，e s i ) 的出现，商品化的液质联用仪 才迅速发展起来。电喷雾电离( e s i ) 解决了液相色谱仪和质谱仪压力匹配、流 量匹配和流动相汽化等问题，具有高离子化效率、多种离子化模式，“软 离子 化方式可以使热不稳定化合物得以分析并产生高丰度的准分子离子峰等优点，得 到了广泛的认可。 电喷雾电离( e s i ) 的工作原理【1 4 】：待分析样品和流动相以一定流速进入喷 口，在电场和辅助气流的作用下喷成雾状的带电微液滴。在加热气体的作用下， 液滴中溶剂被蒸发，使液滴直径逐渐变小，因而表明电荷密度增加，当达到雷 利限度( r a y l e i g hs t a b i l i t yl i m i t ) 时，即表面电荷产生的库仑排斥力大致相等， 则会发生“库仑爆炸”，产生更小的带电液滴；这些液滴中的溶剂继续蒸发，如 此反复，直到液滴表明形成的电场，最终样品离子从液滴中解吸出来，通过锥孔 和质量分析器，具体过程如图4 2 所示。 l o g 鹅f l o w l ；i = ：= ； 驯h i 加w 玳a 鲈 图4 2 电喷雾电离技术的原理图1 1 5 】 f i g u r e4 2 s c h e m a t i co fa ne l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n ( e s i ) s o u r c e 1 4 3 多级质谱技术 多级质谱包括通常所说的二级质谱和离子阱技术的所谓1 1 级质谱( m s “) 。其 排列方式可以是空间上的( 如三级四极杆) ，也可以是时间上的( 如离子阱) 。质 谱质谱( m s m s ) 的目标是得到分析者感兴趣的某一前体离子的再次碎裂图谱 ( 二级质谱图) ，从而由它的特征图谱( 特征的断裂方式) 得到比一级质谱图( 分 子离子峰+ 碎片峰) 更为详尽的结构信息。同时，二级质谱可以锁定感兴趣的目 标离子，从而排除了杂质离子，大大地降低了化学噪音和生物学基质的干扰。 1 - 4 4 高分辨质谱技术 按其性能分类，有机质谱仪可分为低分辨和高分辨质谱仪两种，低分辨质谱 图上的离子峰质量一般为整数，高分辨质谱测定的是精确质量，精确度达原子质 量单位( d a ) 四位以上小数值。 由于组成有机化合物的各种元素所有天然同位素的质量除1 2 c 外都不是整 数，虽然甲原子的质子、中子和电子数目是乙原子中的质子、中子和电子数目的 整数倍，但是它们的质量比并不是整数，由相同数目的质子、中子和电子组成的 不同分子也具有不同的质量。原因在于质子和中子结合成原子核时，有一部分质 量转化为结合能而造成“静质量亏损”【1 8 】。按照物理标度的原子质量单位计算， 质子：1 0 0 7 8 2 5d a ，中子：1 0 0 8 6 6 5d a ，电子：0 0 0 0 5 4 8d a 。但是，氘的静质 1 1 量并非以上三种基本粒子质量之和，而是少一点，这就是结合成氘核时静质量亏 损的结果。由于每一种原子核都有其特定的结合能，所以形成不同原子核的静质 量亏损的的数值与它们结合的质子和中子数不成比例。例如，c o 、n 2 和c 2 h 4 的相对分子质量都具有相同的整质量数2 8 ，但它们的精确相对分子质量却不相 同，分别是2 7 9 9 4 9 1 4 ，2 8 0 0 6 1 4 8 ，2 8 0 3 1 3 0 0 。高分辨质谱仪则可以区别以上3 种分子。由高分辨质谱给出的精确分子质量和碎片离子质量，可获得化合物的分 子式和碎片离子的元素组成，为结构式的推断创造了条件。 1 5 质谱图谱解析 质谱谱图解析是根据质谱谱图中的各种信息分子离子峰，碎片离子峰， 同位素离子峰，亚稳离子峰，多电荷离子峰等质荷比及强度，各种离子产生的机 理离子碎裂的基本机理来推测未知化合物的结构。采用高分辨质谱，可以准 确测量未知化合物的精确质量，由此推出元素组成，确定其分子式。还可以采用 质谱质谱( m s m s ) 联用技术，亚稳扫描和碰撞诱导解析( c o l l i s i o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ，c i d ) 等技术来研究母离子和子离子间的关系，找出离子碎裂途径， 推出未知化合物的结构。 分子在离子源中电离后产生各种各样的离子，如分子离子，碎片离子，多电 荷离子等。不同的离子化方法得到的质谱图会有一定的差异。如在电子轰击电离 ( e l e c t r o ni m p a c t ，e 1 ) 过程中，可使分子失去电子形成分子离子。此时，与分 子量相对应的峰，称为分子离子峰，用m ? 表示；用软电离的方法，如化学电离 ( c h e m i c a li o n i z a t i o n ，c 1 ) ，快原子轰击电离( f a s ta t o mb o m b a r d m e n t ，f a b ) ， 电喷雾电离( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n ，e s i ) ，大气压化学电离( a t m o s p h e r i c p r e s s u r ec h e m i c a li o n i z a t i o n ，a p c i ) 等条件下，与分子量对应的峰，成为准分子 离子峰，用【m + h 】+ 表示。电离后形成的分子离子具有范围较宽的内能，内能低 的分子离子( m ? ) 比较稳定，不会在被收集以前分解，在质谱图上以分子离子 ( m ? ) 形式出现。然而，内能高的分子离子( m ? ) 很不稳定，可以通过各种与 能量有关的反应分解产生一个离子和一个中性碎片。这种离子分解反应可以连续 进行下去，产生一系列的碎片离子。因此，我们可以通过碎片离子的质荷比与丰 1 2 盛盗竺红曲筮鱼丞