（生物化学与分子生物学专业论文）黄花石蒜凝集素的纯化及性质研究.pdf

四川大学硕士学位论文 黄花石蒜凝集素( l y c o r i sc h i n e n s i sa g g l u t i n i n ) 的纯化及性质研究 生物化学及分子生物学专业 研究生：荣艳珍指导老师：鲍锦库 摘要：黄花石蒜球茎经匀浆、浸取、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱 ( d e a e - s e p h a r o s e ) 和s e p h a c r y ls 2 0 0 分子筛层析得到经s d s p a g e 检测为单 一蛋白带的黄花石蒜凝集素( l v c o r i sc h i n e n s i sa g g l u t i n i n ，l c a ) 纯品。经 s e p h a c r y l s - 2 0 0 凝胶过滤和s d s p a g e 测得其表观分子量为4 8 k d ，亚基分子 量为1 2 k d ，表明l c a 是由四个相同亚基组成的蛋白。l c a 只凝集兔血细胞， 其凝集兔血细胞效价为0 9 5 u g m l ，但是对鸡血及人a 、b 、a b 、o 型血均不凝 集。其凝血活性部分依赖于金属离子c a 2 + 、m 9 2 + 。糖抑制实验结果表明，甘露 聚糖是l c a 的专一性抑制糖，其次是甘露糖。 2 9 5 n m 激发时，天然l c a 的最大荧光发射峰在3 3 7 2 r i m 处，比游离t r p 的最大 荧光发射峰3 4 8 n m 蓝移了1 0 8r i m ，说日y t r p 周围的极性较弱，并未完全暴露于周 围溶剂中。2 8 0 n m 激发时，其最大荧光发射峰也在3 3 7 2 r i m 处，荧光强度增加， 说明i c a 的内源荧光发生了从t y r 至l j t r p 的能量转移。 研究了不同温度、d h 和变性剂对l c a 凝血活性和荧光光谱的变化，当温度 达8 0 ( 2 以上时，活性开始下降，1 0 0 。c 处理2 0 分钟，l c a 仍保留6 0 活性；p h 为 4 1 2 对活性的影响不大，p h 为2 时，完全丧失活性：温度的升高和p h 的改变对 荧光光谱影响不大。表明l c 敞寸热，酸碱具有较强的耐受性。 用荧光光谱法研究了三种变性剂脲、盐酸胍、s d s 在不同浓度下构象的变 化和凝血活性的变化情况。盐酸胍变性时，l c a 荧光最大发射波长和荧光强度 随盐酸胍浓度的增大而逐渐增大，其后随盐酸胍浓度的逐渐增大反而逐渐减小。 第1 页 四川大学硕士学位论文 3 m o l l 的盐酸胍使活性丧失5 0 。盐酸胍浓度达6 m o l l 时活性完全丧失。在低 浓度的脲中( 0 - - 4 m o l l ) ，l c a 分子构象已经发生明显变化，但是凝血活性仍 不变，脲浓度为5 m o l l 时荧光强度开始下降，最大发射波长蓝移：此时活性也 仅下降1 6 。当脲达到6 m o 儿时活性完全丧失。脲浓度高达8 m o l l 时荧光强 度继续降低峰位明显蓝移。在s d s 变性中，荧光强度开始有所增加，浓度达 l m m o l 【。时荧光强度最大，此后随s d s 浓度的增加又开始下降，5 m m o u l 时几 乎回到原来的水平。而凝血活性随s d s 浓度增大逐渐减弱。2 0 m ms d s 使l c a 完全丧失凝血活性，此时荧光强度也降到最低。由此变性过程分两个阶段进行， 存在一个中间体状态，此状态下l c a 的分子构象与天然态及加入高浓度变性剂 的状态都不同，表现为其荧光发射光谱的发射波长最大，荧光强度也最高。盐 酸胍较尿素可以产生更强的变性作用。 n b s 修饰t r p 过程中，荧光强度明显降低，最大发射波长开始并没有明显 变化，随着t r p 不断被修饰，发射峰明显蓝移。计算表明大约有3 个色氨酸残 基位于u 1 a 分子表面，但与凝血活性无关。用n e m 、p c m b 、d t t 修饰巯基 和二硫键，n a i 、n b s f 修饰酪氨酸，d e p c 修饰组氨酸，修饰后l c a 凝血活 性没有明显变化，说明巯基、二硫键、酪氨酸、组氨酸不参与凝集活性中心的 组成。与l c a 凝血活性相关的氨基酸有a s p g l u 、s e r t h r ，其中酸性氨基酸 a s p g l u 的羧基和凝血活性密切相关，对其修饰后导致凝血活性丧失5 0 ， s e r t h r 在凝集活性中扮演一定的角色。 丙稀酰胺对l c a 中t r p 淬灭程度达到1 0 0 ，k i 能淬灭6 2 9 的t r p 荧光， 而c s c l 几乎没有淬灭作用。甘露聚糖是l c a 专一性抑制糖，同时作为一种淬灭 剂能淬灭8 3 3 的t r p 残基的内源荧光。 关键词：石蒜凝集素；分离纯化；化学修饰：变性剂；荧光光谱：荧光 淬灭； 第2 页 四川大学硕士学位论文 s t u d y o n p u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o n a n d c o n f o r m a t i o no f l y c o r i sc h i n e n s i sa g g l u t i n i n m a j o r ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y a u t h o r ：r o n g y a h z h e n s u p e r v is o t ：b a oj i n - k u a b s t r a c t ：an e wm a n n o s e 。b i n d i n gl e c t i nw a si s o l a t e df r o ml y c o r i sc h i n e n s i st r a u b b ye x t r a c t i o n ，p r e c i p i t a t i o nw i t h ( n i g h s 0 4 ，a n i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo n d e a e s e p h a r o s ec o l u m nf o l l o w e db yg e lf i l t r a t i o no nas e p h a c r y ls - 2 0 0c o l u m n t h ea p p a r e n tm ro fl y c o r i sc h i n e n s i sa g g l u t i n i n ( l c a ) w a sd e t e r m i n e dt ob e4 8 k d b yg e l f i l t r a t i o no n s e p h a c r y l s 一2 0 0c o l u m n i ns d s - p a g eu n d e rr e d u c i n g c o n d i t i o n ，p u r i f i e dl c a s h o was i n g l eb a n do fm r1 2 k d ，t h e r e f o r e ，t h ei n t a c tl c a w a sc o n s i d e r e dt ob eat e t r a m e r i cg l y c o p r o t e i nw i t hf o u ri d e n t i c a ls u b u n i t s t h e l e c t i nw a sa p o t e n ta g g l u t i n i nf o rr a b b i te r y t h r o c y t e sb u tw a s i n a c t i v ea g a i n s th u m a n r e dc e l l sa n dc h o o ke r y t h r o c y t e s m a n n ew a rt h em o s tp o t e n ti n h i b i t o ro fl c a h e m a g g l u t i n a t i o no fr a b b i te r y t h r o c y t e s ，f o l l o w e db ym a n n o s e m e t a li o nc a ”、m + w e r eh e l p f u lt oh e m a g g l u t i n a t i o na c t i v i t y t r e a t e dw i t he d t a - n a 2 l a al o s t a c t i v i t y a sm e n t i o n e d ，f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yd e c r e a s ea n dx m a xo ff l u o r e s c e n c e e m i s s i o ns p e c t r u mr e d s h i f t e d i n c u b a t et h ed e i o n i z e dl a aw i t hc a ”、m g z + t h e a g g l u t i n a t ea c t w i t yr e c o v e r e d t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r u mo fl c ae x c i t e da t2 8 0 n ma n d2 9 5 n ms h o w e da m a x i m u mp e a ka t3 3 7 2 n m t h ec h a r a c t e r i s t i cp e a ko ft y rd i dn o te x i s t ，w h i c h s h o w e dt h a tt h ef l u o r e s c e n c ee n e r g yo f t y rw a st r a n s f o r m e dt ot r pa n ds t r e n g t ht h e f l u o r e s c e n c eo ft r p w h e nl c aw a se x c i t e da t2 9 5 n m ，t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r u m s h o w e dam a x i m u mp e a ka t3 3 7 2 n m ，t h ek a xo ff l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r u m 第3 页 四川大学硕士学位论文 b l u e - s h i f t e dm o r et h a nl o n mc o m p a r e dw i t ht h ek “o ff r e et y r ( 3 4 8 n m ) ，w h i c h i n d i c a t e dt h a tt r y p t o p h a nr e s i d u e sw e r ee m b e d d e di nt h ep r o t e i nm a t r i xa l l o w i n ga m o d e s tw a t e ra c c e s s i b i l i t yo rl o c a t e dn e a rt h es u r f a c eo ft h em o l e c u l e t h ec o n f o r m a t i o nc h a n g e so fl c ai nt h ep r e s e n c eo fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n g u h c l 、u r e aa n ds d sw e r ei n v e s t i g a t e db ym e a s u r e m e n t so ff l u o r e s c e n c e s p e c t r a f f r ) ，a n dc o m p a r e d w i t ht h ea c t i v i t yc h a n g e s 。 t h ek “a n di n t e n s i t yo ff l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r u mo fl c ai n c r e a s e d w i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fg u h c li n c r e a s i n g a n dt h e nt h em a x i m u mp e a k b l u e s h i f t e da n di n t e n s i t yd e c r e a s e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fg u h c ii n c r e a s i n g ， a c c o m p a n y i n gb yh e m a g g l u t i n a t i o na c t i v i t yl o s s ，w h e nt h ec o n c e n t r a t i o nw a s r a i s e d t o6 m o l l , t h eh e m a g g l u t i n i n ga c t i v i t yw a sc o m p l e t e l yl o s t s t u d i e so nd e n a t u r a t i o nb yu r e ai n d i c a t e dt h a tt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f l c ai n c r e a s e do b v i o u s l ya st h ec o n c e n t r a t i o no fu r e ai n c r e a s e df r o m0t o 4 m o l l ，w h i l et h eh e m a g g l u t i n a t i o na c t i v i t yo fl c a m a i n t a i n e dt h eo r i g i n a ll e v e li n t h i ss t a g e 。a n dt h e nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya n dk l a xo ff l u o r e s c e n c ee m i s s i o n s p e c t r u mo fl c a d e c r e a s e d w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fu r e ar e a c h e d6 m o f l ， f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yc o m et ot h el o w e s ta n dt h eh e m a g g l u t i n i n ga c t i v i t yw a s c o m p l e t e l yl o s t d e n a t u r a t i o nb ys d ss h o w e dt h a tw h i l et h ea c t i v i t yo fl c aw a se x p o n e n t i a l l y d e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o n so fs d s ，t h em a x i m u mw a v e l e n g t ha n d i n t e n s i t yw e r ef i r s td e c r e a s e d ，t h e ni n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gs d sc o n c e n t r a t i o n w h e nt h ec o n c e n t r a t i o nw a sr a i s e dt o2 0 m m ，t h eh e m a g g l u t i n i n ga c t i v i t yw a s c o m p l e t e l yl o s t ，a n df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yr e a c h e dt h el o w e s t t h ep r o c e s so fd e n a t u r a t i o nc a nb es e e na st w os t a g e s t h e r ee x i s t sa i n t e r m e d i a t es t a t ei nt h ep r e s e n c eo fl o wc o n c e n t r a t i o no fd e n a t u r a t i o n ，t h e c o n f o r m a t i o no ft h ei n t e r m e d i a t ei sd i f f e r e n tf r o mt h en a t i v ea n du n f o l d i n gs t a t e ，t h e m a x i u mw a v e l e n g t ho ff ro ft h ei n t e r m e d i a t ei st h em a x i u m ，a n df l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yi st h eh i g h e s t t h ee f f e c to fc h e m i c a lm o d i f i c a t i o no fa m i n oa c i d r e s i d u e s u p o n 第4 页 四川大学硕士学位论文 h e m a g g l u t i n a t i o nw a si n v e s t i g a t e d t h e r ei sad e f i n i t ed e c r e a s eo ff l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yw h i c hc o r r e s p o n d st ot h eo x i d a t i o no ft r y p t o p h a n u n d e rn a t i v ec o n d i t i o n s 2 7t r y p t o p h a nr e s i d u e sw e r ea v a i l a b l ef o rm o d i f i c a t i o nb yn b s ，w h i c hh a dn oe f f e c t o nt h eh e m a g g l u t i n a t i n ga c t i v i t y m o d i f i c a t i o no ft y r o s i n e ( n a ia n dn b s f ) ，h i s ( d e p c ) ，t h i o lg r o u p s ( p c m b ， n e m ) a n ds u l f h y d r y l0 9 t od i d n ta f f e c tt h eh e m a g g l u t i n a t i o na c t i v i t y t h i sr u l e s o u tt h ep o s s i b i l i t yo f t h e s e r e s i d u e sb e i n gi n v o l v e di ni t s b i n d i n ga c t i v i t i e s m o d i f i c a t i o no fs e r i n e t h r e o n i eh a dal i t t l ee f f e c to nh a e m a g g l u t i n a t i n ga c f i v i t y a 5 0 l o s si nh e m a g g l u t i n a t i o na c t i v i t ya f t e rt h em o d i f i c a t i o no fa s p g l ui n d i c a t e d t h a tp h e n o l i ch y d r o x y lg r o u p sw a se s s e n t i a lf o rt h ec a r b o h y d r a t e b i n d i n ga c t i v i t yo f l c a f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gs t u d yo nl c aw i t hc s c i ，k i ，a c r y l a m i d ea n dm a n n e s h o w e dk i ，a c r y l a m i d ea n dm a l l n e q u e n c h e dt h ef l u o r e s c e n c eo fl e c t i nt h r o u g h d y n a m i cq u e n c h i n gm e c h a n i s m ，a n d1 0 0 o ft r pw e r eq u e n c h e db ya c r y l a m i d e ， 6 2 9 o o ft r pw e r eq u e n c h e db yk i 8 3 3 o ft r pw e r eq u e n c h e db ym a n n e t h e r e w a sn od e t e c t a b l ec h a n g ei nt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fl c aa f t e rt r e a t e dw i t h c s c l k e yw o r d s ：l y c o r i sc h i n e n s 坛a g g l u t i n i n ( 删；p u r i f i c a t i o n ；d e n a t u r a t i o n ； c h e m i c a lm o d i f i c a t i o n ；f l u o r e s c e n c es p e c t r a ； 第5 页 四川大学硕士学位论文 1 引言： 植物凝集素是至少具有一个非催化结构域、可与单糖或寡聚糖特异可逆结 合的所有植物蛋白【1 1 ，存在于近于种植物的种子和营养器官中。从1 8 8 8 年 s t i l l m a r k 首次发现蓖麻凝集素1 2 1 ，1 9 3 6 年第一次分离纯化出凝集素一伴刀豆球蛋 白( c o n a ) ，至今已经发现了近千种不同的植物凝集素，在生理生化及分子生 物学方面对它们进行了许多研究。在此过程中人们逐步确认了凝集素广泛的生 物学活性与其糖结合专一性的关系，以后相继发现了凝集素对人血型抗原的专 一性结合以及促细胞有丝分裂作用和凝集恶性细胞的能力，同时还发现凝集素 具有抵御许多疾病和抗植物病虫害以及抗肿瘤和人类免疫缺陷病毒活性等方面 的作用1 3 1 ，对凝集素的研究逐渐受到广泛的关注。分离纯化凝集素，通过对其理 化性质，蛋白质结构与功能以及编码基因的深入研究，不仅能够将其应用于植 物抗病基因工程，提高植物对病原的抗性，而且也有助于揭示不同凝集素的作 用机理及其在植物反应中的作用。特别是近年来由于分子生物学的发展，许多 植物凝集素基因被克隆，对凝集素及凝集素糖复合物的糖结合位点结构的分析， 使得我们对植物凝集素的生物学功能有了更深的认识。近来发现植物凝集素具 有保护造血干细胞的作用，为造血干细胞移植、白血病治疗打下了基础，这为 凝集素的研究和应用开辟了更广阔的领域1 4 】。 凝集素广泛的生物学活性主要归因于其特异的糖结合活性，而特殊的氨基 酸对它保持这种结合活性是必须的；故确定这些特异的氨基酸是研究凝集素结 构与功能关系的基础，而化学修饰可以鉴别哪些氨基酸位于功能区l ”，从而提 供凝集素一级结构和生物学活性的相关性。借助光谱学仪器分析可以研究不同 条件下蛋白质结构的变化，再配合活性的检测是研究蛋白质结构与功能关系的 有效手段。荧光光谱可用于对蛋白质分子中特殊荧光基团( 如t r p 、t y r 残基) 所处的微环境进行研究，荧光淬灭方法也广泛应用于蛋白质溶液构象的研究 1 6 , 7 , 8 1 。 黄花石蒜，又名中国石蒜( l y c o r i sc h i n e n s i s t r a u b ) ，属单子叶植物纲，百 合目，石蒜科植物，多年生草本【9 】。本文从黄花石蒜中分离纯化出石蒜凝集素 ( l y c o r i sc h i n e n s i sa g g u l t i n ) ，并结合荧光光谱，化学修饰等手段对其结构微环 第6 页 四川大学硕士学位论文 境，性质及生物学性质等进行了初步研究，以揭示不同条件对i _ c a 分子结构和 活性的影响以及l c a 分子中一些重要基团与其分子结构和活性之间的关系。 2 材料和试剂 2 1 材料 黄花石蒜球茎采于四川青城山，兔血采集于学校附近市场，人a ，b ，o ，a b 血 来自华西医院。 2 2 试剂和仪器 d e a e s e p h a r o s e ，s e p h a c r y ls 一2 0 0 均为p h a m a c i a 公司产品；丙烯酰胺和甲 叉双丙烯酰胺分别为s i g m a 和f l u k a 公司产品；d 一半乳糖( g a l ) 、n 一乙酰半乳糖 胺( g a l n a c ) 、d 甘露糖( m a n ) 、d 一果糖( f r u ) 、d 葡萄糖( g l c ) 、2 - n 一乙酰 胺基葡萄糖( g l c n a c ) 和甲状腺球蛋白( t h y r o g l o b u l i n ) 为s i g m a 产品，甘露 聚糖肽( m a n n a n ) 由微生物实验室孙启玲老师赠送；n 一溴代丁二酰亚胺 ( n b r o m o s u c c i n i m i d e ，n b s ) 为a c r o s 公司产品；苯甲磺酰氟( p m e t h y l b e n z e n s u l f o n y lf l u o r i d e ，p m s f ) 和对氯汞苯甲酸( p c m b ) 为m e r c k 公司产品； 焦碳酸二乙脂( d e p c ) s i g m a 公司产品；s d s 为a l d c i c h c h e m i c a lc ot t d 产品 丙稀酰胺( a c r y l a m i e d ) 华美生物工程公司产品( 光谱纯) ；氯化铯( c a e s i u m c h l o r i d e ) 为上海试剂一厂；其余常用试剂均为进口分装或国产分析纯。 紫外光谱在岛滓u v - 1 8 0 0 型紫外分光光度计上进行。 荧光光谱在h a c h if - 4 5 0 0 荧光分光光度计上进行，激发和发射光谱谱 宽均为5 n m ，扫描速度为2 4 0 n m m i n 。以2 8 0 n m 和2 9 5 n m 为激发波长，测得荧 光发射光谱，测定温度为2 5 。 3 方法 3 1 血细胞的处理 新鲜采集的兔血，鸡血，人血( a 、b 、a b 、o 型) 用生理盐水3 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，处理三次，配成4 的悬液备用。 第7 页 四川大学硕士学位论文 3 2 血凝活力的检测 按照文献【10 j 方法进行测定。在“v ”型血凝板中每孔加2 钆l 生理盐水，取 2 5 8 1 凝集素溶液与等量的生理盐水作倍比稀释，然后加2 却l2 的兔红细胞， 振荡后室温放置2 小时，肉眼或显微镜观察结果。人的a 、b 、a b 、o 型和鸡 血细胞凝集作用测定方法与文献【5 1 相同。 3 3 l o a 的分离纯化 3 3 1 粗品的制备 黄花石蒜球茎洗净，拨去外壳，用搅拌器匀浆。用5 倍体积的生理盐水4 下隔夜抽提。匀浆液用4 层纱布过滤，7 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟。缓慢搅拌下向上 清中加入硫酸铵至终浓度为8 0 ，4 下隔夜放置。离心收集沉淀部分，灭菌高 水透析直到检测不到硫酸铵。离心除去蛋白沉淀，上清即为粗品，- - 2 0 保存。 3 3 2d e a e s e p h a r o s ef f 阴离子交换柱层析纯化l c a 用d hz 9 ，o 0 5 m d 垤，| 自勺t n s - h o 缓冲液平衡d b 蛆- s e p h a r o s e 柱。粗品过 滤后与p h 7 9 ，0 5 m o l l 的t f i s h c l 缓冲液母液以9 ：1 比例混匀，上柱，流速 为2 m u m i n ；用缓冲液进行洗脱，当紫外检测仪的数值 0 0 2 后，改用0 - - l m o 扎 n a c l 梯度洗脱，用处理好的兔血检测各峰的蛋白活性。收集活性蛋白峰，浓缩 保存。 3 3 3 分子筛层析 将过d e a e s 印h a r o s ef f 的浓缩样品取2 5m l ，用p h 7 0p b s 缓冲液平衡 的s e p h a c r y ls - 2 0 0 进行凝胶过滤，控制流速在o 6 1 o m l m i n 之间，以处理好的 新鲜兔血细胞检测活性，收集活性部分，冷冻干燥。 3 4 蛋白浓度的测定 用f o l j n 一酚试剂测定，以牛血清白蛋白作标准【1 1 | 。 3 5l o a 纯度鉴定 第8 页 四川大学硕士学位论文 聚丙烯酰胺凝胶电泳按l a e m m l i 【1 2 1 系统进行不连续s d s p a g e ( 分离胶浓度 为1 0 ，浓缩胶浓度为4 ) 。 3 6s e p h a c r yis - 2 0 0 分子筛层析测定表观分子量 按照a n d r e w l l 3 】的方法测定，以有效分配系数k a v 计算l c a 的分子量，( k 。 = ( v 。v 。) ( v t v 0 ) 。其中：v 。为柱床体积，v o 为外水体积( 以蓝色葡聚糖 - - 2 0 0 0 0 上柱测得) ，v o 为洗脱体积。 3 7 凝集素基本理化性质检测 3 7 1 糖抑制实验 凝集素倍比稀释后，于每孔中加入2 5 l 生理盐水配制的8 0 m m o l l 果糖、 葡萄糖、半乳糖、甘露糖、n 一乙酰半乳糖胺、n 一乙酰葡萄糖胺，1 甘露聚 糖、甲状腺球蛋白、唾液酸，振荡1 0 分钟，每孔加入2 5 l2 的兔血球悬液， 振荡，2 5 静置2 小时，检查活性。 3 7 2 温度对l c a 凝血活性的影响 凝集素以生理盐水配制成o 1 m g m l ，在2 0 、4 0 。c 、6 0 、7 0 c 、8 0 。c 和1 0 0 。c 处理2 0 分钟后，冷却至室温，以倍比稀释测定活性。 3 7 3p h 对l o a 凝血活性的影响 纯化的凝集素用不同p h 的缓冲液( p h2 0 的k c l - h c i 缓冲液，p h4 0 和6 0 的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液，p h7 0 的p b s 缓冲液，p h9 0 的n a h c 0 3 - n a 2 c o3 缓冲液和p h1 2 o 的k c i - n a o h 缓冲液) 配制成o 1 m g m l ，放置过 夜，倍比稀释测活性。 3 7 4 金属离子对l c a 凝血活性的影响 将l c a 溶液对5 0m m o l le d t a n a 2 充分透析，室温放置过夜。4 。c 再用 生理盐水充分透析除去过量的e d t a n a 2 。在“v ”型血凝板上加入经e d t a n a 2 处理过的凝集素，对生理盐水进行倍比稀释后，分别加入2 0m m o l l 的c a c l 2 、 第9 页 四川大学硕士学位论文 z n c l 2 和m g c l 2 溶液2 5 p l ，振荡后，分别加入2 5 9 1 兔血细胞悬液，室温放2 小 时，检查凝集结果。同时测定去除金属离子后l c a 的凝集活性，并以未经 e d t a n a 2 处理的凝集素为对照。 3 7 5 变性剂对l c a 凝血活性的影响 3 7 5 1 不同浓度盐酸胍对l c a 凝血活性的影响 生理盐水配制0 、o 5 m 、1 m 、3 m 、6 m 盐酸胍溶液各3 m l ，o 2 4 m g 凝集 素样品溶于其中，室温放置2 小时后倍比稀释测活。 3 7 5 2 不同浓度脲对l c a 凝血活性的影响 生理盐水配制0 、2 m 、4 m 、5 m 、6 m 、8 m 脲各3 m l ，0 2 4 m g 凝集素样品 溶于其中，室温放置2 小时后倍比稀释测活。 3 7 5 3 不同浓度s d s 对l c a 凝血活性的影响 0 1 mp h9 0 甘氨酸一氢氧化钠缓冲液配制0 、1 r a m 、5 m m 、1 0 m m 、2 0 m m s d s 溶液3 m l ，o 2 4 m g 凝集素样品溶于其中，室温放置5 分钟后测定活性。 3 7 6 甘露聚糖对l c a 凝血活性的影响 生理盐水配制0 、o 0 5 m g m l 、o 1 m g m l 、5 m g m l 、i m g m l 、2 m g m l 、5 m g m l 的甘露聚糖各3 m l ，o 2 4 m g 凝集素样品溶于其中，室温放置2 小时后倍比稀释 测活。 3 8l c a 部分基团的化学修饰 3 8 1t r p 的修饰与数目测定 按s p a n d e 等的方法 1 4 , 1 5 】进行修饰反应。用0 1m o l l ，p h5 1 的磷酸缓冲 液配制l c a 溶液( 浓度o 0 8m g m 1 ) 。取4 支试管，分为两组，每组两管。第 1 组作活性对照，第2 组每隔5 分钟加入驰ll o m m 0 1 l 的n b s ，每次取样于 2 8 0 r i m 处测光吸收值，直到继续滴加n b s 光吸收值略有回升为止。根据下列 公式来计算被修饰的色氨酸残数：n = f 1 3 1 x a a 2 s o x m ，) ( c x 5 5 0 0 ) ；其中，a 2 8 0 第1 0 页 四川大学硕士学位论文 为蛋白质经n b s 修饰后于2 8 0 n m 处光吸收的下降值，m ，为蛋白质分子的相对 分子量，c 为溶液中的l c a 的浓度( m g m 1 ) ，1 3 1 是经验系数，5 5 0 0 是色氨 酸的摩尔消光系数。 3 8 2t y r 的修饰 n b s f 的修饰参照l i a o l l 6 1 等的方法，反应在0 1 m o i l ，p h8 0 的 i r i s h c i 缓冲液中进行。n b s f 先用异丙醇溶解后加入到反应体系中，l c a 的最终浓度 为l m g m l ，反应在2 5 恒温水浴进行6 0 分钟后，将反应体系用0 1 nh c i 调至 p h5 0 6 0 以终止反应，透析除去过量的试剂，检测活性。 n a i 修饰t y r ，参照鲍锦库等【1 7 i 的方法进行。n a i 和i c a ( 1 m g m 1 ) 分 别用0 0 5 m o 札，d h7 0t r i s h c i 缓冲液溶解后加入到反应体系中。n a i 终浓 度为2 0 m m o i l ，3 0 反应3 0 分钟后，透析除去过量的试剂，检测活性。 3 8 3 巯基的修饰 按r o b e r t s 等f l s 】的方法，用0 2 m o l l 的p h 8 0p b s 配制n e m ，使其浓度为 0 0 1 m o l l 。在n e m 修饰l c a 的反应中，每次加入1 0 # ln e m 溶液，5 分钟后测 定3 0 0 n m 的光吸收值，然后再加入n e m ，直至3 0 0 n m 的光吸收值不再下降为 止，透析除去过量的试剂，检测活性。 按r i o r d a n t l 9 l 的方法进行，用p h 5 8 醋酸一醋酸钠缓冲液配制5 m m o l l p c m b ，反应中每次加入p c m b1 0 # l ，数分钟后测定2 5 5 n m 吸收值的增加，继 续加入l o u ip c m b ，数分钟后再行测定，直至加入p c m b 后吸收值不再上升为 止，样品透析并检测凝集活性。 用0 2 m o l l 的p h8 0p b s 配制0 1 m o l l 碘乙酸，l c a 溶于其中，终浓度 为im g m l ，4 0 反应1 0 分钟，生理盐水透析除去过量的碘乙酸，测定活性。 3 8 4 羧基的修饰 按c c a r r a w a y 等f 2 0 j 的方法，采用水溶性的碳二酰亚胺( e d c ) 修饰，配以 亲核剂甘胺酰乙酯。1 0 0 # 1e d c 加到l m l 含1 m 甘胺酰乙酯的凝集素样品中， 凝集素浓度2 m g m l ，室温搅拌反应2 小时，反应过程中用h c l 使p h 维持在4 5 ， 第1 1 页 四川大学硕士学位论文 反应结束后对灭菌水透析测活。 3 8 5s e r t h r 的修饰 s e r t h r 的修饰参照d a n i e l 方法进行1 2 1 1 ，l c a 用0 0 5 m o l ，p h7 0 的磷酸缓 冲液配制，终浓度为l m g m l 。p m s f 先用异丙醇溶解后加入到反应体系中，最 终浓度分别为0 、2 5 m m o l l 、5 m m o l l ；反应在3 0 * ( 2 恒温水浴进行3 0 分钟后， 透析去除过量的试剂，检测活性。 3 8 6 二硫键修饰 按s p a n d e 方法进行，l c a 用o 1 5 m o l l ，p h6 8 的磷酸盐缓冲液( p b s ) 配制， 终浓度为l m g m l ，加入d t t 使其终浓度为2 0 m m o l l ，用c = o 1 m o l ln a o h 调 p h 至8 0 ，室温反应3 h 后，用p b s 缓冲液平衡透析，检测活性。 3 8 7 组氨酸残基修饰 按s n e h a 等【2 2 】的方法，用生理盐水配制浓度为l m g m ll c a 溶液2 m l ，加 入2 和l2 ( v v ，乙醇配制) d e p c 进行修饰，2 4 0 n m 下检测吸收值不断上升并趋 于平稳，4 c 放置过夜，透析除去过量的试剂，检测活性。 3 9l c a 的荧光光谱研究 3 9 1 天然态的荧光光谱 未经处理样品荧光光谱的测定是在生理盐水中测定。l c a 浓度为 o 1 m g m l ；激发光波长为2 8 0 n m 和2 9 5 n m ，测定发射光谱，再以3 3 7 2 n m 为 发射波长，测定激发光谱。 3 9 2 不同温度下荧光光谱 凝集素以生理盐水配制成0 1 m g m l ，在2 0 。c 、4 0 c 、6 06 c 、7 0 。c 、8 04 c 和 1 0 06 c 处理2 0 分钟后，冷却至室温，进行荧光光谱的测定。 3 9 3 不同p h 下的荧光光谱 四川大学硕士学位论文 凝集素用不同p h 的缓冲液( p h2 0 的k c l 一h c l 缓冲液，p h4 0 和6 0 的 柠檬酸柠檬酸钠缓冲液，p h1 0 0 的n a h c 0 3 - n a 2 c o3 缓冲液和p h 1 2 0 的 k c l 一n a o h 缓冲液) 配制成0 1 m g m l ，放置过夜，进行荧光光谱的测定。 3 9 4 色氨酸残基化学修饰后l c a 的荧光光谱 按上述s p a n d e 等的方法 1 4 ，1 5 1 进行色氨酸修饰同时测定荧光光谱的变化。 3 9 5 变性剂对l c a 荧光光谱的影响 3 9 5 1 盐酸胍对l c a 荧光光谱的影响 生理盐水配制0 、o 5 m 、1 m 、3 m 、6 m 盐酸胍溶液各3 m l ，0 2 4 m g 凝集 素样品溶于其中，室温放置2 小时后，进行荧光光谱的测定。 3 9 5 2 不同浓度脲对l c a 荧光光谱的影响 生理盐水配制0 、2 m 、4 m 、5 m 、6 m 脲各3 m l ，0 2 4 m g 凝集素样品溶于 其中，室温放置2 小时后，进行荧光光谱的测定。 3 9 5 3 不同浓度s d s 对l c a 荧光光谱的影响 o 1 mp h9 0 甘氨酸一氢氧化钠缓冲液配制0 、l m m 、5 m m 、1 0 r a m 、2 0 r a m s d s 溶液3 m l ，0 2 4 m g