（生物物理学专业论文）抗肺癌单链抗体偶联绿色荧光蛋白基因的构建及表达研究.pdf

降夕亭z 乎 硕士学位论文 摘要 绿色荧光蛋囱作为一种新型l 勺标记分子，可威用于活体细胞的实时检测。目 前已有相当多的文献报道关于将g f p 基因与特定抗体或细胞园子纂因结合进行融 合表达的研究，诞明融合蛋白具商g f p 的荧光性质和配体骚自质的生物功能，可 用于对肿瘤的检测、药物筛选、细胞因子受体的分布以及功能等方面的研究，应 翔蔻景广滔。 目前闺内关于将绿色荧光蛋囱与其他细胞因予融合表逖的报道较少。相关的 援遘畜抗释癌单链抗体融台g f p 在粪核籀貔孛懿表达，殴爱重缝l l 1 8 一g 静融合蛋 囱活性研究等。本论文拟将抗肺揍单链抗体连接绿色荧光蛋白进行融合表达，预 黼目标蚤白应同时其有抗体活性殿光激发绿色荧光双重功缱。 本实验经p c r 方法从m r n a 逆转袋产物中克隆到抗肺癌抗体的熏链可变 隧和轻键可变区，并利用重叠延伸p c r 方法将翼构建为举链抗体s c f v 形式。利 遐酶甥逑接将s c 基因痒列插入翱绿色荧光蛋白基因3 壤均成g 国s e 钾震组基 因，并转化太肠杆菌表达。经碑t g 诱导袭达后并s d s p a g e 蛋囱电泳，与阴性 麓瓣照，在预期分子量范潮蠹毒蠛一弱鼓条蒂。秘嚣k i n 狡摇爨缝往蛋骞+ 窭 现两个明显的峰。s d s p a g e 电泳分析表明，其中一个峰的蛋白条带符合预期蛋 露分子量。3 9 6 n m 激发鬣示绿色袋先，证实蛋的鏊因在宿主中褥弱表达。不过， 表达出的蛋白是瓣具有抗体活性还需要进步的分析研究。 关键词：单穗抗体绿色荧光蛋白势予标记纂棱表达 却夕亨破学 硕士学位论文 a b s t r a c t u s eo f 血eg 佗e nn u o r e s c e n tp r o t e i n ( g f p ) o f a e q u o r e a v i c t o r i aa sar e p o r t e r h a s p r o v i d e ds e n s i t i v en e w 印p r o a c h e sf o rr e a lt i m em o 血t o r i n gi nl i v i i l gc e i i s m o r ea r l d m o r er e p o r t sh a v ed e m o n s t r a t e dt h a tw h e ng f pf u s e dt ot a r g e ta i l t i b o d y t 量1 eh o s tc e l l c a ne x p r e s sb i 胁c t i o 眦1 如s i o np r o t e i l l ，w h i c hh a st h en u o r e s c e mc h a r a c t e ro fg f p a n dt l ea n t i b o d ya c t i v i 吼a sa 1 1a l t e i n a “v et oi r n m l l l l o f l u o r e s c e n c e 删c r o s c o p y t 1 e e x p r e s s i o no f g f p g e n e 如s i o n sh a sb e e nu s e df o rt u m o rm o i l i t o r i n 岛h i 曲血r o u 曲p u t s c r e e n i n gd r u g s o r r e s e a r c h i n gm e f u n c t i o no f t h ea c c 印t o ro f c e n a i nc e l lf 如t o l i nt h i sp 印e r ae x p r e s s i o nv e c t o rm a tc o n t a i 璐g f pg e n ea 1 1 da 1 1 t i j u n gc a n c e r s c f vg e n ei sc o n m u c t f i r s t ，m ev 嘶a b l er e 百o no fh e a v yc h a i na n dl i g h tc h a i ni s c l o n e d 丘o mc d n a s 虹i r o u g l lp c r t h e n ，v lg e n ei sa m p l i f i e da n dm o d i f i e d 谢也 l i n k e rp “m e r ，e q u a im 0 1 eo fv ha n dm o d i 士i e dv la r et h e ns u b j e c t e dt 0s o ei i g a d o n a 1 1 ds c f v g e n ei sa m p l i f i e dw i t l lv h b a k a n dv l f 0 r s e q u c n c i n gr e s u l t si n d i c a t et h a tn o p o i n t m u t a t i o na n d f h m e - s l l i 茄n g m u 伽o na r e b r o u 曲t a b o u t d 1 1 r i n g p c r 啪p l i f i c a t i o n 1 1 l e g f pg e n ei sc l o n e di n t o p p r o e xh t bp l a s m i db e t w e e n 1 e n c oi ) ( b ais i t e s a r e rm o d i f i e db yp c r u s i n gs 1a n dv l f o rp r i m e r ss ot h a t 也e a m p l m e d 曲舯e n t c o n t a i n sb g ll i 胁ois i t e s ，t h ep c r p r o d u c ta n d t 1 1 er e c o m b i n a n t v e c t o ra r ed i g e s t e dw i mb 百i i 十x h oi ，廿1 ei n o d i f i e ds c 知g e n ei si 1 1 s e r t e di n t ot h e c - t e n n 血a lo fg f pg e n eb e t 、v c e n b 西i i ，) ( h o i s i t e s ，也e nt r a n s f o m i n g t h e r e c o m b i n a 工l tv e c t c ri n t oe c o l i c o m p a r e d t ot h en e g a t i v eb a c 衄 a i ，t h ec o n s c n i c t e d p l a s m i dg a v eah i g l ll e v c lo f e x p r e s s i o ns i m i l 盯t o 也ea n 廿c i p a t e dp r o t e i n 出e r 口t gi i l d u c d o n i t 印p e 盯st w o s h a r pp e a k s 1 r o u 曲血ep l l r i 矗洲o no fn i n t a 吲i l m ea n a l y s i s o fs d s - p a g e s h o w st h a to n eo ft h em o l e c u i ew e i g h to f 血ef 诋i o np r o t e i t li ss i m i l a rt ot h et a r 伊t p m t e i n t h eh o s tc e l l sf l u o r e s c eb r i g h tg r e e nl l l l d e r3 9 6 mw a v e l e n 血，i tm e a l l sm e g e n eh a se x p r e s s e di nt h ec e l l s ，b u t 、v h e m e rt l l et a 曙e tp m t e i nh a s 恤eb i 0 1 0 9 i c a l f h l c t i o nn e e d sf h r t h e rr e s e a r c h k e y w 。r d s ： s c f vg f pm o l e c u i em a r k e r p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n 2 洳； 土磅 综述部分 绿色荧光蛋白研究进展 声所夕? z 穿 硕士学位论文 1 二l 日u吾 绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 是来源于发光水母 ( a e q u 。r e av i c t o r i a ) 的一种功能独特的蛋白质，分子量为2 7 k d ，具有2 3 8 个氨基 酸。 腔肠动物的绿光是由一组紧密联系的蛋白质的存在而产生的。一种是由水母 发光蛋白( a c q u o r i n ) ，分子量为2 1 4 k d 。它由三部分组成，一个c a ”结合脱辅基 蛋白，一个腔肠类荧光素和分子氧。另一种是绿色荧光蛋白。体外实验表明，c a ” 4 膨歹菩z 掌 硕士学位论文 在水母发光蛋白上的结合，激活了分子闻的交互作用，觚两使腔嬲类荧竞索氧往 为c o e l e n t e r 锄i d e ，产生一种蓝包荧光蛋白( 荧光最大波长4 7 0 n m ) 、c 也和光 ( 4 7 0 n m ) 。这种菔色荧光蛋白悬由结合到脱辅纂蛋白上的c o e l e n t e r a m i d e 组成 驰，处予激发态鼹e o e l e n t e r a m i d e 是这一爰应款激发爨。然蠢当g f p 被加入到反 应混合物中时，种与胶肠动物体内发出的光一致的绿色荧光( m a x = 5 0 8 n f l l ) 蠡l 子麓豢款蓝爸荧光蛋窦翻0 静蠡冬放射链传递蠢被疆察裂。这穆绿色荧光粒产生 可以大致的概括如下： 水母发光蛋囱蓝色荧光蛋自+ h v 1 a x 4 7 0 n m + c o 。 + + g f p h v m a x 5 0 8 n m 塞l g 2 年p r a s h e r 等人尧窿弱g 鼯静e d 凇辍寒，绿色荧毙蛋是臻为一耱凝望豹 标记基因，已目髓引起人们的兴趣。以g f p 为报错基因已成为基因转移研究领域 辩熬点之一，并成功应鬟在多释蒸因转移系统帮鞑缡麓。迄今麓盘，g 鼯基在大 肠杆菌、酵母和果蝇、h a l a 细胞、昆虫细胞、鼠及植物等异源细胞中表达成功， 并保存天然荧光活性。 由于绿色荧光蛋自受光激发产生荧光是特异性的独立过程，并不需要任何的 协同因子、底物斌其他来自水母的基因表达产物且由于其在异源细胞内融合表 达莲可囊发强诧成熟，叁发产生荧光且对异源缨悠蠹豹生理过程毙于扰，强嚣可 应用于活体细胞的实时梭测。如用来在满体内追踪某一特定蛋白的合成、运输和 定位，鬣子鼹铡缁魏分泌过程等簿。将g f p 与特定抗体蒙缀貔蠢子缝台送行轻台 表达，可用于对肿瘤的检测、药物筛选、细胞因子受体的分布以及功能等方面的 研究。对一系歹i 麓g f p 静n 端或e 浠融台蛋白质的憔质研究中，已诞萌融会蛋白其 有g f p 的荧光性质和配体爝白质的生物功能。同时，g f p 的检测极其方便，可用荧 光显微镜、流式细胞仪或湿微图像技术在活细胞中检测，对细胞既损伤。箍于这 然优点，g f p 基嚣已或势艇测体幽基因表遮及缨黩内蛋自定位十分重要的缀告基 因。 膨歹善破掌 硕士学位论文 第一节绿色荧光蛋愈懿理化性质 绿恕荧光蛋是是许多腔聪动物所特蠢的生甥荧光豢蛋自。1 9 7 l 每j 。m m o r i n 婷发现维多利亚水母( a e q u o r e av i c t o r i a ) 发出的绿光不是缘予水母发光骚白， 而是男羊中媛自g f p 造成的。1 9 7 4 年，m o r i s e 等首次证明穗维多幂i j 疆水母体内发 出嚣绿光，燕钙离子激游的承蹲荧光蛋鑫( 发藏毙) 涛戆鬣传递绘g f p 菇产垒靛， 0 f p 是一释接波及擐终藏瓣裁爨熬秘覆，掰接受懿黪鏊采鑫予荧光素黧氧化荧光 豢的复合体或钙离子激瓣的发光蟹白。 1 9 9 2 年p r a s h 。r 等人克隆到g f p 的c d n a ，由于绿色荧光蛋白独特的性质及其 广泛蘸应用，己爵盏；j 超人 j 的兴趣，对它的穗馥醑究馥越来越深入。驭承母体 肉分离掰的g f p 基闲，裔3 个外显子嬷成，长遮2 + 6 蝻。成熬g 静分子愚由2 3 8 个氨 蘧酸缓戏兹单体蛋白，艇封分子薰必2 7 0 。野生型s 鞭被紫外光潮蓝必激发后毙 发出绿色荧光，其最大荧光吸收激发峰在3 9 5 n m ，在4 7 5 n m 处有一个腐峰，荧光 发射峰在5 0 8 n m 。经过点突变产生的绿色焚光蛋囱的变种的荧光暇收激发膏相应 静改变。 f i g 2 野生型g f p 及其突变体荧光激发谱 i w t g f p2 g f p s 6 5 t3 g f p s 6 5 t p4 g f p s 6 5 t h 6 胁歹? z 掌 硕士学位论文 t a b 1 c o 珥嘶s o no f w t - g f p a n dm t g f pi nn u o r e s c e n tc h a m c t e r g f pk i n d sc o d e na r e am i xe x c i t a t i o n m a xe m i s s i o nr e i a l i v e w a v e i e n 血( n m )w “e l e n t h ( n m ) i m e n s i t v w 1 g f p 7 2 0 b p 3 9 65 2 6l m t g f ps 6 5 t 7 2 0 b d 4 7 05 0 66 ( 6 5 s e t - t h r ) v i s i b l e1 j g h te x c i t i n g m t g f ps 6 5 t p 6 9 6 b p 4 7 05 0 66 ( t r u n c a t e d12 唧 v i s i b l ei i 曲te x c h i n g m t g f ps 6 5 t h5 1 3 b d3 6 05 0 0o 5 ( 咖c a l e d7 5 ) 绿色荧光蛋白性质极其稳定，易耐受高温处理，需要在9 0 以上高温才能使 其变性。甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质，并且无光漂白现象。如用酸、 碱或盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，荧光就可恢复并且有和原 来一致的发射光谱。 纯化的g f p 的物理及化学性质的研究已确定了其多种重要性质。这种蛋白对 于多种变性因素具有很强的抗性。强的还原剂，如5 哪o l 几n a ：s q 威2 珊o l 几f e s 吼， 可将g f p 转变为非荧光形式。但当其暴露在空气中时，荧光又完全恢复。弱的还 原剂，如2 b 一巯基乙醇，l0 珊f 1 1 0 l l 二硫苏糖醇，l o m m o l 几还原型谷胱苷肽，或 1 0 m m o l l 半胱氨酸，不影响g f p 的荧光。中等强度的变性剂，如1 s d s 或尿素的作 用，以及用戊二醇或甲醛固定后，g f p 仍可保持其原有性质。但g f p 对某些用于封 片的指甲油是根敏感的，所以使用熔化的琼脂糖或橡胶粘合剂封片较为理想。g f p 的荧光可被1 h 2 0 。和巯基试剂，如l m m o l 几 d t n b ( 5 ，5 _ b i t h i o _ b i s 一 2 一n i t r o b e n z o i ca c id ) 等不可逆的熄灭。g f p 荧光可 在p h 7 1 2 的试剂中保持稳定，p h 5 5 7 0 时，荧光强度减弱。但极端的p h 环境， 如p h 1 2 时，g f p 的荧光消失，不过通过透析或中和反应去掉变性条件 时，几分钟内g f p 就可完全复性，并恢复到原来的荧光，而且产生的发射光谱与 变性前一致。 # 掰歹善玻学 礤攀萤谂文 第二节绿色荧光蛋白蝻化学绩构鞠发光机制 2 。l 绿愁荧光蛋自戆 艺学结构 g f p 靛 乏学牲蔟裰爨稳定，其变牲霾簧在粥或p 疆 1 2 熬条转下遐 6 m o l 忍盐酸瓢处理，这镶瀵与g 转靛缩褥穗经裰关。 f i 9 3g 神蛋叁结构酶三绻立俸黧 y a 髓g 等静轿究表餮，g f p 罨宙两个鞠当簸翔鹣内含一个a - 蝶麓籁舞黉毯圈 1 1 个p 折叠的b 桶状结构组成的二聚体，p * 桶状结掏直径约3 n m ，离约4 n m 。 p 折叠彼此紧密结合，象桶税一样形成桶靛缩 鸯懿外阐，并且形藏了个蕊澍豹 巍键帑。捅状缝 鸯稍位子其米端的愆q 螺旋蔽及环羧缭构一起缀袋个革猿瓣蘩 密缝梅域，没肖可供扩散的凝体避入缝隙。这种坚安的络梅僳证了箕稳定漪抗热、 抗变性的特煮。 8 加歹菩z 穿 硕士学位论文 g f p 豹生色蘩霞黠蓑予8 螺旋上，几乎完美的包救予糖状结构中心。位于 翻桶中央的q 螺旋含有个由六肽组成的发光中心，而发光团是由其中的三肽 s e r 6 5 1 w 6 6 。g i y 6 7 经过环化形成了对羟基苯眯唑啉酮。生色基团彼予螺旋中部， 躐橇状结稳瓣足俺中心不裂0 。2 栅，在冀耀曩爨稷镶秘饕摄滢数氨蘩羧铡链。 魏e 6 4 联矬0 4 6 在黛雹基瓣瓣避游伽6 3 与謦三色基濯分开，臻生色慕溷缀副缳护。 g f p 的生色熬团是蛋白艨自身蠼化环化的结果，环化是一个有氧过程，在严格厌 氯条件下g f p 不能形成荧光，因为0 f p 的，主色团形成需要0 2 使t y r 6 6 脱飙氧化。生 色基团邋遭i 弦6 6 的脱质予( 黔盐) 和质子纯状态( 羟酚蒸) 静转换决定荧光发 瓣，魏模型为y 敞g 等豹鑫体学涯撰掰支持。 o f 嘻4 绿证荧光蛋蠢发光枫南示意鹜 g f p 粒发是蒸强是巍赣译2 碡夺对嚣鑫动继纯形袋戆，多拳置g f p 在会羧嚣蔫要 缀一定鹣妾蓐整过稷形成菠确懿橡蒙嚣才辑功麓。o 黝。等在l 。9 埃分辨率下鼹察 s 6 5 孓o f p ( 一种突变体) ，发现它的高级缨掏是内分子内的l l 股链组成的昼一橱状 结构，熬中心带有个与其共轴的螺旋，荧光基团的形成就是从速个螺旋开始的。 末端随机缺失实骏表碉，g f p 离缴结构的维持需要几乎所有残基的参每。e 采靖 懿强凝结稳袋子撩凝结糖癸，萁最嚣的约7 令氮鏊酸基无j 葶接列。这数氨綦羧残 基不形成“糖片”，教英缺失季影旗荧必特性。n 一末端怒撩状续掏末端的“嬉 予”，故其缺失会弓 起黄光的藏失。 有研究淡明，g f p 悬一种疏水性蛋白，可以用疏水层析进行分离纯化。 2 + 2 野生型绿夔荧光蛋龟豹发毙枫锲 野懋登舔色荧光蛋囱( 并i l dt y 淤g f 魏霹t g 黔) 翡嚣髂蛋鑫袋经菸夔澎艨成 熟豹蛋囱矮，同融s e r 5 5 一t y r 6 6 嵋1 y 5 7 环化形成生甑团。生色圈的形成首先是 9 墨育 所夕善破乎 硕士学位论文 g l y 6 7 熬氮熬对s e 拍5 静羰基遴攻舔琢彳芑生成五元环，同对失去一分子求形成账唑 基的第五碳原子。在有飘条件下，新的n = c 双键促进t y r 6 6 的a ，e 一飘化脱氢， 从而彤成一个连续的n 电子芳香族系统一生色团。 越鞲嶙蝮：羹 锄蛙型川 0 却歹事z 掌 硕士学位论文 b r e j c 等和p a l m 等眈较了 i f t g f p 和几种g f p 突变俸的晶体结誊鼋稻，提密了细致 的原于模型( 图3 a ) 。他们认为w t g f p 三融生色团状态之间的电荷、质子化彤式和 构象互不相同：a 一型生色团的t y r 6 6 是质子化的( 羟基化的藏中性的) ，具有3 9 5 n m 黝吸收蜂鞠s 0 8 的发射蜷；卜型生色霞的t y t 6 6 楚去质予化的( 酚盐式的或阴离 子化的) ，具有4 7 7 n m 的吸收峰和5 0 8 m 的发射峰；i 型生色团与b 一型一样是去质 予纯豹，毽具鸯矗望豹橡象，稳残生巷瓣豹氨蕊羧残基秘与生色溷在空阉上捆 邻的氨基酸残基间形成的氢键网控制着不同状态间的平瓢，决定糟质子在生色团 稻相部 ；l l 链闻静转移。 晶体学分析发现，在w t g f p 的t y r 6 6 酚羟基、一个束缚水分予( w a t3 0 4 ) 、 s e r 2 0 5 和g i u 2 2 2 之间形成一个质予传递网，允许质子迅速魄传递，控甫4 着生色团 鄹g 1 u 2 2 2 间的电赫转移。 w t g f p 生色团基态a 的t y r 6 6 酚羟基呈中性形式g 1 u 2 2 2 羧基的静电排斥和与 替鑫t 3 0 4 、s e r 2 0 5 壤l 链氡形成熬氢键共嚣缎接这鼹状态。g l u2 2 2 羰蕊与s e r 6 5 形成 的氢键进一步稳定了这种状态。t h r 2 0 3 的羟基远离t y r 6 6 的氧原予，同时r 2 0 3 豹羧基氧与w a t 3 涎澎残一令氢键。 8 一型 鼽于也曲掏鼍 】型 者廖f 化照年科粕簟 。触舾 辩s 一，l h - 掣 击斌哥仡竹蕈 排电 厶型 f i g 7 野擞型g f p 生色网不同状态的原子模型 ( a 、由p a l m 簿提出；b 、由w e b e r 等搓出 生色团从中性的a 一烈到离子化的b 一型的转变涉及中间过渡态i ，但在晶体 却歹善矢掌 硕士学位论文 结构中避没有是到。在这种过渡态中，g l u 2 2 2 逶道与# a t 3 0 4 帮s e 娩0 5 形成豹氢键 网给生色团提供电荷。 w t g f p 生色闵基态b 的t y r 6 6 鼹断羟基去质子优的阴离子形式，h is 1 4 8 铡链与 t y r 强酚鲢形成的氯键帮w a t 3 0 4 与t 珏6 6 、t h r 2 0 3 馋隧氧、s e r 2 0 5 侧链氧形戏豹氢 键网共同维持这种状态。t h r 2 0 3 的构象发生了重排，侧链氧与生色团形成氢键进 步稳定了这魏状态。贯令重簧熬交诧是s e r 2 0 襄g l u 2 2 2 之鬓豹氢链螃裂，固 时g l u 2 2 2 的羧基飙还可能发生了反倾界构化( a n t i s y n i s o m e r i z a t i o n ) 。 最远，驿e b e r 等对莘分子和溶液中豹多 孛g 鼯突变落滋行繇究箍提鑫，s 择发 光机制模型还虚包括生色团的顺反光异构化和两性离子形式( z 型， z w i t t e r i o n i cf o r m ) 。裔可能是通过g l u 2 2 2 的质子传递形成两髓离子( z ) ，z + 的 能量比b + 盥能异丰句化形成b ，z + 回迁到基态z 与b 回迁到基态b 时释放出相同能量而 产生同样的荧光。两性离子( z ) 能用核磁共振检测到，倡还没有分离和检测到z 一 裂晶体。 2 。3 突变壅g 砷酶发炎祝鬟 通过突变已获得许多g f p 突变体。根据它们的荧光吸收或发射光谱特性，这 魑突变体可分为三类。 2 3 1i 型突变 光落特整不蜜，多建蔬农褴氨基毅残基突变凳紊零注氨麓馥残蒸，翔 c y c l e 3 g f p ( f l o o s m 1 5 4 t v 1 6 4 a ) 、s 9 1 l ( f 6 4 l 1 1 6 7 t k 2 3 8 n ) 、s 9 1 2 ( f 6 4 l ) 簿。此登突交静菇体结稳与w t g f p 稽同，掰鞋其漆郢质予传递霹畿该不会泼交， 发光机制应与w t g f p 相同。其中c y c l e 3 g f p 发射荧光的强度是w t g f p 的1 6 1 8 倍， 可能是突变导致g f p 二聚化作用降低，提高了g f p 的可溶豫，生色闭更易被激活。 2 3 2l i 型突变 寝 | 叟光谱红移，吸收漳为4 8 8 n 氆，发黪烽受5 0 8 n 毽。发瓣荧光戆强瘦弱驻裹于 w t g f p 。该型突变包含一个共同的s e r 6 5 突变，如s 6 5 t g f p 、s 9 2 5 ( g 6 4 l s 6 5 c 1 2 声辑歹蓼z 掌 硕士学位论文 i1 6 7 t k 2 3 8 n ) 、e g p p 等。当s e r 6 5 突变为豫r 、c y s 或a l a 拜于，荦慕携雩 入可能往 这些较小的氨基簸残基更好地折嶷在蛋自质内部，加快了环化、氧化生成生色团 的速度，其中s 6 5 t g f p 比w t g f p 快4 倍。s 6 5 t g f p 晶体学研究表明，箕构象不同予 w t g 即，w t g 印生色圈鳇乎褥与圆挫体对称锄之闻的夹角是一1 5 0 一1 7 0 1 ，两s 6 5 豫f p 的夹角鼹5 9 。这种变化使t h r 6 5c l ：与g 1 u 2 2 2 羧基紧密接触，g l u 2 2 2 羧基旋转导 致0 l u 2 2 2 与s e r 2 0 5 之阗斡氢键蘩裂。s s 5 粥瞎中莰毒秀令擞锌( 骡a t 3 0 4 、l h 两50 ) 与g 1 u 2 2 2 质子化的羧基配位形成魉键；t y r 6 60 与w a t 3 0 4 、m s l 4 8n 、t h r 2 0 30 形成氢键，促进了 y r 弱瀚酚羟蒸窀离，蘩笆霞上瓣羊y r 弱0 其篱淤溺离孑彩式存 敬，导致存在于w t g f p 生德团各状态间的平衡向b 一型移动，吸收光谱红移，只能 在4 9 0 唧处被激发产生欧b + 回迁到基态b 丽发射绿色荧光。另役g l u 2 2 2 突变为g l y 也会导致g 1 u 2 2 2 与s e r 2 0 5 之间的甄键断裂，该突变体只产生一个4 8 0 n m 的吸收峰， 与s e r 6 5 突变为g ly 、a 1 a 、c y s 、v a l 或t h r 其有相同的光谱特性。此外，黄色荧光 突变俸# y f n 圆8 5 g s 7 2 a 1 2 0 3 f 、￥f p 2 ( s 6 5 g s 7 2 a 善2 0 3 ￥) 孛s e r s 5 自g 多毒j 墓已 使其吸收光谱发生红移，而t h r 2 0 3 突变为p h e t y r 可能又通过n n 相互作用增强 生篷錾弼滔赘哥缀纯性，傻暖敦峰进一步经移终1 3 2 4 n 壤，翔￥黪i 5 g s 7 2 a t 2 0 3 f ) 的强吸收峰为5 1 0 n j 力，用4 8 8 唧光激发，发射出发射峰为5 2 5 n m 的靛光。 2 3 3i h 型突变 光谱发生改变，荧光暇收峰为3 8 5 n m ，发射酶为4 5 0 n 1 1 1 。该型突变有一个共同 豹t y r8 6 突变，烟萤色荧光突变毒搴b f p l ( y 褐h y 1 4 5 f ) 、s 9 4 2 ( f 6 4 l y 6 6 h ) 、 s 9 5 0 ( f 6 4 l y 6 6 h v l6 3 a ) 、p 4 ( y 6 6 h ) 等。w s c h t er 等对b f p l ( y 6 6 h y 1 4 5 f ) 进行 菇终学及跫动力学骚究发现，其蹩色霾构象襄w t g 瓣麴一梯，毽灏绕生夔烫豹氢 键发生了童排。飘键网中的水分子( w a t 3 0 4 ) 不与生色团h i s 6 6 形成氢键。使生色 鬻与g l u 2 2 2 之闯不能遂行矮子传递，导致存在予并t g f p 垒镌霞吾状态阗的平鬻自 a 一型移动，突变体仅在3 8 5 衄处谢一强吸收峰。此外受激，a 不能转变为1 4 ，a 阐迁到蘩态a 而发射蓝色荧光。间辩对折藏状态的b f p l 和艇色团滋行p h 蕊滴定酶 结果也表明，完熬的蛋自处于折爨状态时其生德团是中性的。t h r 2 0 3 对于形成 和稳定离子化的嫩色团鼹必需的如有t h r 2 0 3 突变为i l e 的突变体，i l e 不能与生 魏团形成氢键，瓣碍了t y r 弱酸羧蒺豹电蔼，即阻碍了生镪翅由a 一型转变为b 一型， 新歹警z 掌 硕士学位论文 静致位予生色团t 的酚氯基( t y r 6 6o ) 靛有中缝豹羟基仡形式，该突交俸便寄 3 9 5 n m 的吸收峰。 第三节绿色荧光蛋白在生物技术中的应用 g f p 馋为生物标记分子具有蹙丈的潜力，主要是因为它具有以下特性：( 1 ) 种属不依赖性，柱多种生物中均能表达：( 2 ) 荧光强度商，可在瞽通荧光短微镜 下浸测；( 3 ) 不鬟要反应褒凌与辅助爨予，不曩予班往常爝豹l a e z 、l u 、a t 、 g u s 等报铬基因，尤其适用于体内的即时检测( r e a lt i m e ) ；( 4 ) 相对较小的分 予藿( 2 7 x 蚤) 茨攀薅蛋鑫容易与之聚合，特裂是在耱经元中茏萁遥雳；( 5 ) g 印 肷链中一些特定氨基酸的替代可以产生不同颜色的光，这魑突变体可适应于不同 研究的需簧。由予这些优点，g f p 在生命秘学研究中得到广泛的运用。 3 1 分子标记 作为一种新型的报告基霞，| g f p 已在燕物学酶许多研究领域褥翔应餍。藉用 绿色荧光覆自独特的发光机制，w 将g f p 作为蛋囱质标签( p t e i n _ t a g g i n g ) ，即 利用d n a 重组技术，将目的基因与g f p 基因构成融合基因，转化合适的细胞进行 表达，然嚣氆助荧毙显徽镜覆可辩耩记豹蛋白矮滋嚣缨爨内涎体溅察。由予g f p 相对较小，只有2 3 8 个氨辏酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能， 秘溺g f p 静这一黪毪已经麓深了载稍对缀艴内一魏过程鹣了薅，翔缓藏分裂、染 傻体复制和分裂，发育和信号转导等，显示了g f p 作为分予标记的应用潜力很广。 3 ，1 1 熬因表达的报告 由于g f p 作为报告基因具有赢观及时、应用藏匿广的特点，闲而用予灏因整 台、细黢分选及转基函动甥豹研究是其他掇告基暇所无法比拟的。g f p 可用于# 测 定质粒的转染效率和整合效率。将g f p 表达质粒转入不同类型的细胞瞬时寝达， 胃滏毙较不嚣缨爨闼转染效率豹麓舅。嚣撰，茭了弩 究0 凇豹整会效率，魄霹鞋 将稳定表达g f p 的细胞计数来测定。此外，在基因工程中融将g f p 作为筛选细胞的 印夕善幺掌 硕士学位论文 标记。将g p p 与目的基因融合后转入细胞中，当其融合表达肘，可通过荧光显微 镜或流式细胞仪筛选产生荧光的细胞，也就找到了表达目的基因的细胞，用于进 一步的研究。 目前将g p p 应用于动物成体中的研究还刚刚起步，主要是作为转基因动物研 究中的报告分子，用来标记外源基因在导入动物胚胎或卵后在成体中的表达。在 转基因鼠的研究中由于传统的p c r 和杂交技术用于检测基因的整合时较为繁琐， 使用g f p 将转基因的鼠可以简便地从未转入基因的鼠中携选出来。还有人在斑马 色的胚胎中观察到g f p 的绿色荧光并用之建立了一个转基因的新品种，若将g f p 与即将转入动物的基园融合可以帮助我们更快地获得需要的品系。 g f p 还可用作研究细胞发育的谱系。将g f p 用于示踪细胞发育过程中基因表达 的变化情况，观察不同细胞在不同发育阶段的基因表达，从而显示一种生物在发 育过程中的变化。e d w a r d 等的实验结果表明，g f p 可用于谱系作团和谱系分析的 研究，也可用于检测发育过程中细胞迁移( 包括极细胞和卵泡细胞等) 和细胞形态 的变化。 3 1 ，2 在细胞生物学中作为荧光标记用于细胞动态的研究 由于g f p 分子较小( 2 7 k d ) ，能穿过细胞膜与核膜，因而可用作蛋白c 端或n 端 的荧光标记，用于细胞动态的研究。但其两端只能去除几个氨基酸才不至影响荧 光发生。将g p p 与各种细胞器内的蛋白融合，就能将该细胞器标记为绿色，便于 在显微镜下观察其运动过程。如现在用g f p 标记肌动蛋白的微管结合蛋白或与细 胞骨架相作用的细胞器来研究肌动蛋白与微管组成的网络动力学。1 9 9 6 年， e l r d a r d t 【5 增人首次报道了利用g f p 的特性研究细胞分化蛋白f t s z 的定位。研究显 示f t s z 在细胞分裂位点形成了一个环状物，且至少有9 种蛋白在细胞分裂中起重 要作用，尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用g f p 融合蛋白已经搞清 楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。 通过纺锤体或中心粒与微管间接相连的蛋白和g f p 融合可用于研究细胞分 裂。在芽殖酵母中将纺锤体极体相关蛋白n u f 2 p 用g f p 标记，能确定先前未知的有 丝分裂过程，特别能显示后期有丝分裂纺锤体的四种依次运动情况。 细胞分泌途径是由内质网、高尔基体和核内体溶酶体组成的主要的细胞内 却歹萝破掌 硕士学位论文 膜系统。这稀结擒中蛋南转运静篱度动态过程包含一套美杂而特辣的税澍。研究 分泌途径可以用g f p 标记一神分泌蛋自丽观察英在细胞中囊泡内转运过程。 通过标记k d e l 受体这种胺蛋白可以研究内质网和高尔基体之间高度动态的褶互 作用，内履网中强是的峰解则可通过标记一耪e r 膜蛋白翔突变黝分泌蛋自采分 析。利用g f p 来枪测目标蜃白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的 生理过礁送行受洋尽残察豹薪方法。 3 1 3 活绥憨肉蛋宣豹定位磅究 使用g f p 可以示踪蛋自在活细胞内的位置。例如用g f p 来研究人的c y c l i n 和 c d k 对鲡脆周期的调节过程。e y c l i n 可後c 睬固定子细胞内的特悫位置e y c l i na c d k 复台物在拨里，丽c y c l i n8 l c d k 复合物处于间期的细胞质中，势部分与 微管相谶。在有缝分裂期，b 类c y c l i n c d k 迅速穆至核内与纺锤体相连。最近的 鹾究表翻，c y e l i n 8 2 蔓要篷予巍尔基搭中。这魑蛋白豹定位不仅可以邋过g f p 的标记来显示，而且它们在整个细胞周期中的运动过程都可以用g f p 来示踪。 g 跨靛窭嚣援供了一条鼹察溪维瑰内攫自定锭瓣崭薪逡羟。我们穗缨魏国定 就可实时观察各种条件下的活细胞内的鬣白分布情况。这对于细胞周期乃歪信号 传导的研究无疑楚一个蕊大的帮秘。s 硪等天曾攮遒将g f p 融合黧大弱释麓细稔 膜表面用作标记骚自，这一技术将有助予提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、 构建细胞生物传艨器用作环境检测以及撵测信号转导过程等等。这些都为传统生 物学研究提供了耨愚路敷掰方法，成为交叉学科研究的热点。 3 2g f p 在信鼍转导中的应鼹 新避研究发现，某螺突变的g f p 能够发生荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c ee n e r g et r a n s f e r ，f r e t ) 。f r e t 是一种觚荧光分子的激发状态到临近 藜态接受分子之闯量子力学能量转移豹觋象。f r 黻发生的褥提条传是。荧光接受 分子必颁在荧光提供分予释放态所具有的波长范豳内接受能量，如果供应分子和 接受分子穗互定位在见个继岽之内，裂# 嚣剥手f r 双豹产生。因梵f r t 对予秀个 荧光分予相互问的定位和距离高魔敏感( 在纳米藏围内) 。两个分予间微小的线性 胁夕= z 乎 硕士学位论文 或空间定位关系的破坏可以强烈地改变能量转移的效率。由于f r e t 能量转移并非 是1 0 0 的效率，一个实用而有效的检测f r e t 的方法是，仅仅激发荧光供应分子， 然后计算供应分子对于接受分子荧光释放的比率。比值的变化是一个理想的观测 细胞动态变化的指标。因为它消除了g f p 分子在绝对浓度、细胞的厚度、激发源 的能量度以及检测的绝对效率等的影响。利用f r e t 可阻作成g f p 依赖的生物探针， 现已有研究人员设计大分子或分子配对物来改变g f p 之间原有生理信号反应的 f r e t 。 研究发现可以通过调节g f p 来改变f r e t 。把一个释放蓝色荧光的g f p 融合到一 个绿色荧光g i y 突变体上。并在它们之间介入一个蛋白酶敏感的间隔子，这两个 g fp j | 台好可以发生f r e t 。当加入蛋白酶时，间隔子被切除，两个g f p 之间的距离发 生弥散性改变，f r e t 被完全阻断。该实验提示可以通过偶联g f p 到适当的转录因 子、跨膜受体、细胞间信号转导指示分子，来动态观测活细胞的生理功能。 在上述实验基础上，有研究人员开始设计f r e t 依赖的c a 2 + 敏感指示剂，其设 计原理是，钙调蛋白( c a m ) 通过肌球蛋白轻链激酶( m l c k ) 结合到c a m 结合区。蓝色 荧光蛋白和黄色荧光蛋白通过c a m 和m l c k 区域融合在一起。当c a “增多时，肌球蛋 白轻链收缩b f p 平口y f p 距离靠近。该实验发现，通过改变两个g f p 之间的距离， 可以增加f r e t ( 如下图所示) 。 ( a ) 帕m 。 枷n n 、 、 f r e 7 一、 5 m f i g 8 通过f r e t 检测蛋白间的相互作用 最近，有学者用g f p 依赖的生物传感器测量活细胞内生化动力学通过利用 胁歹善矢掌 硕士学位论文 带有g f p 标记静蛋白激酶矗转染绍耱，蕊涮有关e 删p 盼动森荧光变讫。通道融合蓝 色荧光g f p 到调节亚单位或融合绿色荧光g f p 到p k a 的催化暇单位，设计出了c a 胛 传感器。当c a m p 浓度很低时，两个荧光分子距离很近，并出现f r e t 。如果增加c a m p 浓度，发生豫疆熬霹糍热急剔下降。剥鬟该方法，可以援测出e 棚p 靛动态变化， 并开创了在整体条件下，研究c a m p 调节倍号转导途径的新方法。 3 3 药物筛选 许多新发展的光学分析方法融经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技 术l 蚨数璧众多麴德舍掺中快速戆选窭我们甄感兴趣的药掳。基予细胞鲍荧光分 析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标 鬣白螽受体、离予逶遂或簿豹状态戆变纯。荧毙搽耱分毒楚爨罴镶号传导中薅号 分子的迁移功能，将一荧光蛋白岛信号分子相偶联，根据荧光蛋囱的分布情况即 可推断信号分子静迁移状况，并榷断该分子在迁移孛懿功能。由予g f p 分予塞夺， 农活细胞内可溶腹对细胞毒性较小，因而常用作获光探针。 在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂，其中很多涉及到僻号分予在细胞 爨之闯的迂移。嘲翔当傣号分子粒菜一特殊受体结合后常会导致既圣# 一受体复合 物从某一细胞区域迁移到另一区域，而这一迁移过程通常会介导重要的生理功 越。霾瑟，这些受俸霉鬻被霉箨瑟秘薅逡鹣基据，若菜一嚣麴具蠢与接号分子类 似的功能，那么该药物即具有潜在的医药价值。利用g f p 荧光探针，将很容易从 数量众多的纯台镌中羯繇密那些纯台裙篡骞与信弩分子稍像静靛g l 起配棒受传 复合物迁移并介譬生理威应的功能，且这一筛选过程简单方便，所嚣成本也很低。 利用这一原理，已经成功构建了个筛选模型用予研究药物介导游糖皮质激素受 体( h g r ) 的迁移过程。农一9 6 孔扳中培养细胞，劳以一编码h g r g f p 蛋白的质粒 转染该细胞。当细胞用待筛选的辩物处理后，h g r 书f p 从细胞质疑移a 细胞核的 _ j 建程可实辩或在蘩一时莰连被疆嶷，擐攒荧光分毒鼗可攘甑哪秘药物舆有与 h g r 配体棚类似的功能。利用g f p 来进行药物筛选i 掴于受其必须与迁移的信号分子 穗耩联，英筛选容量稳对鞍嚣，毽是峦予游p 在缎魏蠹豹雾透毪强及独特鹣发光 机制，因而在药物筛选中具有相当大的成用潜力。 却岁尊z 掌 硕士学位论文 f 酶9h g r g f p 羧内迁移模型黼 3 ，4 融合抗体 近二十年来，抗体生成技术荫了飞速发展，融经从细胞工程抗体( 杂交瘤技 术摹竞隧蒎傣) 发震到了第三代抗体：基透工耧菝髂，宽其是禳莲体拣俸瘁技 术的出现，解决了人源抗体的研制问题，促进了释种性能优良抗体以及具有多种 功能的抗体融合餐自的开发。萃镳抗体( s i n g l e c h a i nv 8 r i 曲l ef r 8 9 m e n t ，s c f v ) 怒研究撄较多的种小分子抗体，其优越性在于w 在宿主细胞内大量表达，易于 基因工稔操作，尤其易于构建抗体融合爨白。近年来，关乎绿色激光蛋自融合单 链抗薅熬报道缀多，国内瞧有钼荧掇道，如程虹譬缀遂将摭嚣手瘪零链双功毙抗体 融合g f p 舆核表达载体并导入小鼠成纤维细胞n i h 3 t 3 表达并获得成功。又如胡晓 簿掇道在太强抒蘩孛表达耋缓i l 1 8 及确 l 1 8 一s 挣驻金鬃壹著测定荬生甥活注。 其中表达的r h i l 1 8 一g f p 保持了g f p 的绿甑荧光性质，另一方面，谈融合蛋白还能 与兔抗入r h i l 1 8 反应，并其育与r h i l 1 8 相同斡垒钫活穗。因融合抗僖具有与拭 原结合及发射荧光两种特性，故遮一人工分子可用做免疫染色的稳测试剂，直接 应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。 由予技术上的约原联，一般融会技体均置于凝核表达装统如e e o l i 巾表达。 为便于表达蛋白的分离纯化，一般在单镳抗体的n 端或c 端插入一6 h i s 序列，便 予爱n i 一辩l 矗亲帮蒺辑撞缝纯嚣掭豢童。壤这一技零毽莓农些润题。壶予攘薅分 子内