蛋白质组学总结.ppt

基因组的局限性全方位蛋白质研究的迫切要求医药研究开发的巨大需求高通量分离、鉴定技术的出现计算机信息科学的有力支持,蛋白质组学,蛋白质组学诞生的背景,功能基因组与蛋白质组,1,xx,4蛋白质组的基本知识1、概念蛋白质组（proteome）：一种基因组所能表达的全套蛋白质；一种生物中不同细胞的不同蛋白质的组合；一个细胞内的全套蛋白质，反映特殊阶段、环境、状态下细胞或组织在翻译水平的蛋白表达谱。,2,xx,2、技术路线与相关技术,技术路线,蛋白提取,样品,蛋白混合物,双向电泳,蛋白图谱,肽段,酶切消化,质谱分析,质谱数据,数据库检索,酶切消化,肽段混合物,双向电泳,数据库,3,xx,第二章蛋白质组研究方法,蛋白质组的技术基础（三大支撑技术）：双向电泳（2-DE），可以分离数千种蛋白质。生物质谱技术，精确测定多肽质量及序列。计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。除上述基本的蛋白质组研究技术外，新技术：多维色谱与质谱联用：大规模蛋白质分离与鉴定同位素编码亲和序列标签技术（ICAT）：简化样本、定量。酵母双杂交技术和免疫共沉淀（CoIP）：蛋白质间相互作用,4,xx,2大规模的蛋白质提取、分离技术,弥补以2-DE/MS为基础的蛋白质组技术方法的不足。,1、二维色谱串联质谱技术（2D-HPLC-MS-MS）,主要特点：快速（1-2小时）；易于和质谱连用（液相系统，避免胶上回收）；适用于各种蛋白质的分离（疏水性蛋白、偏酸偏减性蛋白、过大过小的蛋白）。二维色谱有多种组合模式：第一维常用离子交换色谱或凝胶过滤色谱。第二维常用反相色谱。,二、色谱质谱技术,5,xx,2、同位素亲和标记质谱技术（ICAT）细胞中蛋白质数目巨大，酶切后的多肽混合物十分复杂，现有的2-DE和2D-HPLC都难以完全分离。1999年Gygi等人发明同位素亲和标签技术（IsotopeCodedAffinityTags，ICAT），可以简化样本，并有定量作用。ICAT试剂由三部分组成：活性基团，能特异结合肽链中半胱氨酸残基的巯基；连接子，用于结合稳定的同位素；生物素，作为亲和标签，能与卵白素结合，用于选择分离标记的多肽。（卵白素可结合在固相支持介质。）,6,xx,ICAT试剂由三部分组成：,X代表8个氢或者氘原子,与蛋白中Cys的-SH连接,用于被标记多肽的亲和纯化,生物素,连接部分（重链或轻链）,巯基特异反应基团,7,xx,首先，对蛋白质进行标记。接下来，蛋白酶切形成多肽混合物。然后再使用亲和色谱分离只有标记肽段被保留（先洗脱下未标记肽段，再改变洗脱条件，洗脱下别标记肽段）。这样，使样品变得简单。比较标记了重链和轻链的肽段在质谱图中的信号强度，这样，可以实现对差异蛋白质的定量分析。,8,xx,C,-ICAT,C,-ICAT,C,-ICAT,C,-ICAT,C,-ICAT,C,-ICAT,亲和分离,-ICAT,C,酶切,质谱分析,-ICAT,C,9,xx,1细胞裂解的方法,一、温和的裂解方法,用于比较简单的样品：组织培养的细胞，血细胞、微生物或细胞器。1）渗透裂解：低渗溶液悬浮细胞。2）冻融裂解：用液氮迅速冷冻细胞(1-2min)，随后在37融化(1-2min)，反复几次。,第三章双向电泳的蛋白质提取与样品制备,10,xx,3）去污剂裂解：主要用于组织细胞。含有去污剂的缓冲液重悬细胞。4）酶裂解法：裂解植物、真菌和细菌等有细胞壁的细胞。等渗缓冲液含有某种酶：溶菌酶（lysozyme）细菌纤维素酶（cellulase）和果胶酶（pectinase）植物细胞溶细胞酶(lyticase)酵母细胞上述方法有时可以联合运用，裂解效果更好。,11,xx,二、剧烈的裂解方法,用于难以破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，比如酵母。1）超声裂解法。2）弗氏压碎法。3）研磨法。4）机械匀浆法。5）玻璃珠匀浆法。,12,xx,三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解,细胞裂解，蛋白酶释放出来，必须加以抑制。蛋白酶在低温下无活性，所以尽量在低温制备。如有可能，可加入强变性剂：8mol/L尿素、10%TCA或2%SDS。但在上述条件时，仍有些蛋白酶保持一定活性，所以需要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。,13,xx,分离策略：沉淀蛋白质，使之与其它成份分开，再重悬溶解蛋白质。附带作用：浓缩较稀的样品（如植物、尿液等）。注意：某些蛋白会由于重悬造成一定的丢失。,四、通过沉淀分离蛋白,14,xx,1）硫酸铵沉淀（盐析）。2）TCA沉淀（三氯乙酸沉淀）。3）丙酮沉淀。4）在冰丙酮中用TCA沉淀。5）苯酚提取，然后在甲醇中用醋酸铵沉淀。,沉淀方法,15,xx,五、清除影响二维电泳图谱的杂质,一方面，沉淀分离蛋白，另一方面除去杂质：1）盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子。2）内源性小分子。3）离子去污剂。裂解液中的SDS会影响第一向电泳，需以含有兼性离子去污剂、非离子去污剂的裂解液（或重泡涨液）将SDS稀释至终浓度低于0.25%，或其它去污剂与SDS的比率为8:1。亦可用丙酮沉淀方法去除SDS。4）核酸（DNA,RNA）使用DNase和RNaseA混合处理样品。,16,xx,2蛋白质的分步提取技术,硫脲、sulfobetaine和TBP可极大提高样品的溶解度，联合运用硫脲、表面活性剂SB3-10和TBP，可构成高效IEF裂解液，溶解传统方法难以溶解的蛋白。1998年，Molloy把分步提取法和高效裂解缓冲液联合起来，得到高分辨率的2-DE图谱。,17,xx,具体步骤：,第一步以水溶液提取（只溶解偏亲水性蛋白）。第二步以含Urea/CHAPS/DTT的溶液提取（传统裂解，溶解亲水性、中性和疏水性蛋白）。第三步以含硫脲/SB3-10/TBP的溶液提取（主要溶解疏水性蛋白）。有实验表明，11个大肠杆菌的膜蛋白在第三步提取出来。,18,xx,第四章双向电泳与蛋白质分离,利用了蛋白的两个特性对其进行分离。,第一向等点聚焦电泳利用蛋白的等点电进行分离,第二向SDSPAGE利用蛋白的相对分子量分离,原理,19,xx,1等点聚焦电泳原理,构成蛋白质的氨基酸是两性电解质，决定了蛋白质的在一定的pH条件下带有电荷。在低pH条件下，蛋白质所带电荷为正；在高pH条件下，蛋白质所带电荷为负。在某一pH条件下，蛋白质所带净电荷为零时；则此pH为该蛋白的等电点(pI)。蛋白质的等电点取决于蛋白质的氨基酸组成，是蛋白质的一个物理化学常数，可以据此特性分离蛋白质。,20,xx,+,+,pH7.0,+,pH7.0,pH9.0,pH4.0,pH9.0,pH4.0,实现聚焦,据此，设计含有pH梯度的凝胶，在外加电场作用下，蛋白质向与它的等电点一致的pH处泳动，直至聚焦于该处。,+,pH7.0,pH9.0,pH4.0,pI大于pH7,21,xx,IPG胶条的平衡在第一向等点聚焦电泳结束之后，第二向电泳进行之前，必须对胶条进行平衡。平衡第一步的作用是让蛋白变性，当SDS单体浓度高于1mmol/L时，与蛋白定量结合(1g蛋白/1.4gSDS)，掩盖蛋白所带电荷，并使构象均呈雪茄装。平衡的第二步是以碘乙酰胺代替第一步中使用的DTT，否则DTT会影响SDS-PAGE的电泳效果。,22,xx,2SDSPAGE原理,在电场的作用下，带电粒子能在凝胶中迁移，迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键，所以可使寡聚体解聚成亚基；在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的作用下，蛋白质分子内的二硫键被打开。这样，解聚后的多肽分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，其所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异。所带电荷多少与分子大小呈正比（即各种蛋白亚基的荷质比基本一致）。,23,xx,再者，多肽-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒，不同的蛋白质亚基-SDS复合物所形成的椭圆棒的短轴基本上相同，但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。因此，这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷与构型的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。,24,xx,3胶上蛋白检测,一、考马斯亮蓝染色特点：简单、无毒性、对比度好、与下游蛋白鉴定方法兼容。缺点：检出限10ng、修饰谷氨酸侧链，费时（24-48h）二、银染特点：灵敏度200pg。缺点：醛类特异反应是胶上酶切后肽的回收有一定困难。先银染，再加大上样量进行2-DE，考染，质谱鉴定。,25,xx,第五章图像分析与细胞蛋白谱的建立,完成2-DE后，凝胶图像要扫描保存，以数字化图像的形式储存起来。工作步骤：1、蛋白质点检测2、背景消减扣除背景染色对蛋白丰度计算的影响。3、归一化处理使不同胶上同一蛋白质点准确地相对定量，进行比较。4、蛋白质点匹配,26,xx,质谱（MassSpectrometry,MS）特殊的天平：称量离子的质量,依据不同方式将样品离子按质荷比mz分开,质量分析器,离子源,检测器,第六章生物质谱技术与蛋白质鉴定,27,xx,一、MALDI离子源,原理,分析物分散于基质中，形成晶体,激光束辐射到基质和样品分子上,基质吸收激光束能量后汽化，部分样品分子伴随基质的汽化而解吸，基质与样品之间发生电荷转移，样品分子电离,1基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,28,xx,特点之一：产生的离子多为单电荷离子谱峰与样品各组分的质量数又一一对应关系，所以MALDI最适宜分析多肽及蛋白混合物。基质为小分子有机酸及其衍生物，由于：,29,xx,二、线形飞行时间质量检测器,MALDI离子源通常用飞行时间(timeofflight,TOF)检测器作为质量分析器，构成基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。,离子源,+,+,+,+,检测器,激光,线形MALDI-TOF原理图,Uacc,高真空无场飞行管,30,xx,脉冲激光使样本离子化，在外加电场作用下获得动能，进入高真空无电场飞行管道，以在加速电场内获得的速度飞行。质量较小的离子飞行速度快，到达检测器早；质量较大的离子飞行速度慢，到达检测器晚。,31,xx,2肽质量指纹谱鉴定蛋白质技术,特定的质量，且产生的片段数目亦有特异性，故称指纹谱。,肽质量指纹谱(peptidemassfingerprinting,PMF)是指蛋白被酶切位点专一的蛋白酶水解后，得到的肽片段质量图谱。由于所产生的肽段具有特定序列、长度，因而具有,32,xx,为什么要酶切蛋白样品？蛋白分子往往有许多的修饰位点，而且这些修饰未必均一，因而，难以通过质量直接确定样品为何种蛋白。但如果进行酶切后，产生了多条肽段，其中有些肽段是没有修饰位点或未被修饰的，其质量信息，能准确反应肽段的氨基酸构成情况，在数据库中查找、比对时，便可知这类肽段源于何种蛋白，进而确定样品是何种蛋白。这是对蛋白分子进行胶上酶切的重要原因之一。此外，酶切产生肽段数目固定，是肽质量指纹图谱的重要信息；18O从头标记也需要对蛋白分子进行酶切。,33,xx,常用酶类要求：水解为点专一；切出的肽段适合质谱分析（约几千Da），利于检索；酶自身稳定，不易降解。常用酶类：胰蛋白酶和Glu-C蛋白酶等。,34,xx,3液相色谱电喷雾串联质谱,一、电喷雾电离源的工作原理利用高压电场使进样端的毛细管流出的液滴带电，在N2气流作用下：液滴溶剂蒸发表面积减小表面电荷密度不断增加库伦斥力与表面张力达到雷利极限液滴爆裂为带电的子液滴；这一过程不断重复，最终液滴非常细小，称喷雾状，表面电场强大，使分析物离子化，以带单电荷或多电荷离子形式进入质量分析器。,35,xx,36,xx,电喷雾电离产生多电荷离子：,可以用质谱仪的小的质量范围测定大的生物分子，相当于将质谱仪的质量范围放大的n倍。,37,xx,多电荷离子的有关计算：,对于蛋白质，产生的多电荷离子为：M+nHn+系列离子。假设某一质谱峰(m/z)1对应的离子为M+nHn+,另一相邻质谱峰(m/z)2对应的离子为M+(n+1)H(n+1)+,且两个峰均为同一蛋白质产生，则可通过建设联立方程组来得到M和n的具体数值:,解方程组得到M和n。可以编制程序将所有相关的峰进行计算并取平均值，则可得到较精确的分子量信息。这一过程称作解卷积(Deconvolution)。,38,xx,二、液相色谱电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS),ESI后连接串联质谱，可检测离子结构碎片和质荷比，提供离子结构（比如序列）的信息，应用于核酸、多肽及蛋白的鉴定和翻译后修饰的分析。,串联质谱仪,离子源,多级质量分析器,碰撞室,一级质量分析器,总离子,母离子,碰撞室,二级质量分析器,子离子,产生,分析核质比,母离子经高速惰性气体碰撞诱导解离，产生碎片离子/子离子,39,xx,三级四极杆质量分析器是怎样测定多肽序列的？由三个顺序连接的四极杆构成，第一、三个四级杆分别用于母离子和子离子选择，第二个充当碰撞室。由电喷雾离子源生成的总离子经过第一个四极杆（一级质量分析器），筛选出特定离子母离子进入后续检测；母离子进入第二个四极杆（碰撞室），经高速惰性气体碰撞诱导解离，产生碎片离子（子离子）；子离子由第三个四极杆（二级质量分析器）分析其质荷比。最后，根据母离子产生的各种子离子的质荷比计算出子离子的质量，根据断裂处相邻的子离子的质量差，确定氨基酸残基，进而推算出氨基酸序列。,40,xx,小肽断裂碎片离子定义,b,y,四肽,a、b、c型离子保留肽链N端，电荷留在离子C端,x、y、z型离子保留肽链C端，电荷留在离子N端,41,xx,二、18O标记从头测序技术,肽段的断裂主要形成b或y型离子，但判断受样品纯度、溶液中盐分因素制约，有时不易读出。同时为保证能够只读出含有肽段原始末端的y型离子，解决办法蛋白质在酶解时，酶解液中H218O和H216O各占50%，这样酶解后肽段的羧基端上的羟基氧的18O/16O同位素丰度比为1：1，使得y型离子系列的M+2/M的同位素峰的丰度比远高于正常未标记18O离子的同位素峰的丰度比，从而比较容易地分辩出y系列离子，用这种方法可以较准确地读出10个以上的氨基酸序列。,42,xx,四极滤质器（QuadrupoleMassFilter）四极滤质器（四极杆）由四根平行金属杆组成，理想的四杆为双曲线，但常用的是四支圆柱形金属杆，被加速的离子束穿过对准四根极杆之间空间的准直小孔。在四极杆上加上直流电压U和射频电压V，在电场力的作用下，只有mz合适的离子才会通过稳定的振荡进入检测器。通过调节电压并保持UV比值恒定时，可以实现不同mz的检测。,43,xx,44,xx,三、肽序列标签鉴定技术（peptidesequencetag,PST）数据库检索鉴定蛋白质时，可用读出的部分氨基酸序列结合此段序列前后的离子质量和肽段母离子质量，在数据库中查寻，这一鉴定法称为肽序列标签技术。,PST检索鉴定实例：从马心肌红蛋白的胰蛋白酶酶切肽段中选取母离子进行串联质谱分析及蛋白质鉴定。,N端G-L-S-D-G-E-W-Q-Q-V-L-N-V-W-G-KC端,1257.8y10,309.3y3,45,xx,第七章蛋白质翻译后修饰的鉴定,蛋白质翻译后修饰与其活性有关，是蛋白质鉴定的一项重要内容。修饰基团有20多种类型，常见的有磷酸化、糖基化和乙酰化等。,46,xx,1磷酸化蛋白质的鉴定,四、蛋白质磷酸化位点的分析,2、磷酸肽的识别,（4）中性丢失扫描（neutrallossscanmode）,第一个（Q1）和第三个（Q3）四级杆同步扫描，但扫描范围不一样，二者之间保持一个特定的电压差值，这个电压差所代表的质核比m/z值代表某一中性分子的质量。第二个四级杆（Q2）为碰撞室，将Q1输送过来的离子碰撞诱导裂解，再送入Q3。这样只有在Q2中解离后丢失某一特定中性分子的离子才会通过Q3，到达检测器。,47,xx,Q1,Q2,Q3,+,选择母离子,总离子,母离子,子离子,碰撞诱导裂解,子离子,中性碎片,+,选择丢失H3PO4的子离子,48,xx,（5）前体离子扫描（precursorionscanning）,又称母离子扫描（parentionscanning），是连续扫描第一个质量分析器Q1，让各种核质比的离子依次通过Q1，在Q2诱导碰撞解离。设定Q3分析器的电压和频率，使之只能传输某一特定核质比的离子。检测器在得到子离子信号时，已知前体离子通过Q1时的电压，据此可知前体离子的质量。,49,xx,Q1,Q2,Q3,+,母离子扫描,总离子,母离子,子离子,碰撞诱导裂解,子离子,中性碎片,+,P,+,PO3-子离子,P,50,xx,3、磷酸化氨基酸位点的确定,串联质谱产物离子扫描将选定的磷酸肽在CID室打碎，检测其全部碎片离子，根据碎片离子质量数推断肽段的序列和磷酸化位点。磷酸肽在CID室碰撞诱导解离后，易产生丢失80Da（HPO3）和98Da（H3PO4）的碎片离子，这些离子形成的峰很高，易分辨。,51,xx,-98,52,xx,2糖基化蛋白质的鉴定,糖基化蛋白简称糖蛋白，广泛存在于动物、植物、微生物和病毒中。糖蛋白在各种生命现象中发挥重要作用：细胞识别、信号转导、免疫与应答、分化与反分化等均与糖蛋白的糖链结构和功能有关。真核细胞表达的糖蛋白药物，如干扰素（IFN）和促红细胞生成素（EPO）都需要正确的糖基化修饰。,53,xx,（2）糖蛋白的平均分子量及糖含量测定与普通蛋白不同，糖蛋白分子结构具有不均一性：微不均一性（不同的糖链连接与同一位点），糖蛋白的微不均一性，使得分子离子峰变宽，检测灵敏度降低。显著不均一性（同一蛋白质不同的氨基酸位点连接糖）。,54,xx,第八章蛋白质间连锁图的建立,利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Gen