（生理学专业论文）低氧对内皮素1（endothelin1et1）的调节.pdf

浙江大学硕士论文 a c t h c n s c 她 c r f r d a b e t - 】 g c h i f h r i h c m e 1 廿 n f r d 3 p b s p v n r m sc w b 缩略语中英文对照 a d r e n o c o r t i c o t r o p i ch o r m o n e a d r e n a l e c t o m y c o r t i c o t r o p i nr e l e a s i n gf a c t o r c o r t i c o t r o p i nr e l e a s i n gf a c t o rr e c e p t o r d i a m i n o b e n z i d i n e e n d o t h e l i n 1 g l u c o c o r f i c o i d h y p o x i ai n d u c e df a c t o r h y p o t h a l a m o p i t u i t a r y - a d r e n a la x i s i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y m e d i a ne m i n e n c e i n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n n u c l e a rf a t o rr j 3 p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e p a r a v e n t r i c u l a rn u c l e c u s r a d i o i m n m n o a s s a y s u b c u t a n e o u s w e s t e r nb l o t 肾上腺皮质激素 中枢神经系统 促肾上腺皮质激素释放激素 促肾上腺皮质素释放激素受体 二氨基联苯胺 内皮素一i 糖皮质激素 低氧诱导因子 下丘脑一垂体一肾上腺皮质轴 免疫组织化学方法 正中隆起 腹腔注射 核转录因子r b 磷酸缓冲液 室旁核 放射免疫测定法 皮下注射 免疫印迹 浙江大学硕士论文 中文摘要 内皮索1 ( e n d o t h e l i n ，e t - 1 ) 是目前所知血管收缩作用最强的生物肽，具有广泛的 生物学效应。正常条件下e t - 1 参与神经元的某些功能，病理情况下则参与许多中 枢神经系统疾病和心血管的病理过程。e t - 1 可以促进肾上腺素、p 物质、儿茶酚胺 等的释放。e t - 1 作为种旁分泌因子，在心血管系统内环境稳定控制系统中起着重 要作用。 低氧作为一种特殊的环境应激，可造成机体器官乃至组织和细胞的供氧不足， 激起全身性反应，也明显地影响神经内分泌的功能。本论文主要研究低氧应激对内 皮素1 表达的作用，以及这种变化的调节机制。我们利用人工模拟高原低氧的方法， 观察了海拔5 k m ( 1 0 8 0 2 ) 低氧下e t - 1 表达的变化。采用免疫组织化学方法 ( i h c ) 和原位杂交来测定大鼠下丘脑室旁核中e t 1 蛋白及m r n a 与c r f 蛋白及 m r n a 水平，利用放射免疫测定法( r i a ) 和w e s t e r nb l o t 来测定小鼠和青藏高原 土著动物根田鼠和高原鼠兔心脏与肌肉组织中的e t 1 和h i f 一1 疆蛋白水平。以探讨 低氧条件下影响室旁核e t - 1 功能的中枢神经肽c r f r l 调控机理以及影响心脏与肌 肉组织e t 1 作用的转录因子h i f 一1 盘和n f d 3 的调控机制。 结果： 1 ) 5 k i n 连续性( 1 0 8 0 2 ，5 4 0 2k p a ) 低氧2 5 天后大鼠下丘脑室旁核中e t - 1 和 c r f 表达的变化及c r f l 型受体( c r f r l ) 参与的对这种表达变化的调控作用。 e l - 1 蛋白含量在连续低氧l 天和2 天后没有显著变化。丽在连续 氐氧第5 天， e t l 蛋白含量明显下降，第l o 、1 5 和2 5 天其含量逐渐恢复至对照水平。c r f 蛋白 含量在连续低氧第j 、2 、5 、l o 天有明显变化，在第5 天变化最显著，第15 和2 5 天后其含量逐渐恢复至对照水平。血浆皮质酮水平在连续低氧1 5 天后，含量显著 上升，在2 5 天恢复到对照组水平。 皮下注射c r f r l 拮抗剂后，e t - i 蛋白水平相对于低氧组显著上升，而其m r n a 水平明显下降。c r f 蛋白水平相对于低氧组明显下降，近似于对照组水平；其m r n a 水平相对丁低氧组明显下降。但仍高于对照组。血浆皮质酮水平担对于低氧组显著 下降，恢复于对照水平。 浙江大学硕士论文 2 ) 常压低氧对小鼠、根田鼠和高原鼠兔心脏组织e t - 1 表达的变化及转录因子 h i f l 旺和n f k b 对其表达的调控作用。 腹腔注射c o c l 2 实验中，小鼠e t - 1 蛋白含量在三个计量下相对于对照组都显著 性上升，h i f i 毡蛋白含量也在三个计量下相对于对照组都显著性上升；根田鼠e t - 1 蛋白含量在6 0 m g k g 的计量下相对于对照组都显著性上升，h i f l a 蛋白含量在 4 0 m g k g 和6 0 m g l k g 的计量下相对于对照缀都显著性上升：高原鼠兔e t - 1 蛋白含量 在三个计量下相对于对照组都没有显著性差异，h i f 一1c 【蛋白含量也在三个计量下相 对于对照组都没有显著性差异。 常压低氧处理后小鼠e t - i 蛋白含量在低氧2 ，3 k m 、5 k m 和7 k m 及5 k m 拮 抗组和7 k r n 拮抗组都显著性上升，其中7 k i n 拮抗组相对于7 k m 显著性下降：h i f 1 a 蛋白含量在低氧2 。3 k i n 、 5 k m 和7 k i n 及5 k m 拮抗组和7 k m 拮抗组都显著性上升。 根田鼠e t - 1 蛋白含量在低氧5 k m 和7 k m 及5 k m 拮抗组和7 k m 拮抗组显著性上升， 5 k m 拮抗组相对于5 k i n 显著性下降；h i f te t 蛋白含量也在低氧7 k m 和7 k i n 搭抗组 显著性上升。高原鼠兔e t - 1 蛋白含量在7 k i n 及7 k r n 拮抗组显著性上升，h i f 1 a 蛋 白含量低氧7 k m 和7 k m 拮抗组显著性k 升。 3 ) 常压低氧对小鼠、根田鼠和高原鼠兔肌肉组织e t - 1 表达的变化规律及转录因子 h i f 1 n 和n f k b 对其表达的调控作用。 腹腔注射c o c l 2 实验中，小鼠e t - 1 蛋白含量在三个计量下相对于对照组都显著 性上升，h i f h x 蛋白含量也在三个计量下相对于对照组都显著性上升；根田鼠e t - 1 蛋白含量在6 0 m g k g 的计量下相对于对照组都显著性上升，h i f l e t 蛋白含量在 4 0 m g k g 和6 0 m g k g 的计量下相对于对照组都显著性上升：高原鼠兔e t - i 蛋白含量 在三个计量下相对于对照组都没有显著性差异，h i f l a 蛋白含量也在三个计量f 相 对于对照组都没有显著性差异。 常压低氧处理后，小鼠e t - 1 蛋白含量在低氧2 3 k m 、5 k i n 和7 k m 及5 k m 拮 抗组和7 k m 拮抗组都显著性上升，其中7 k i n 拮抗组相对于7 k m 显著性f 降；h i f 一1 。 蛋白含量在低氧2 3 k m 、 5 k m 和7 k m 及5 k m 拮抗组和7 k m 拮抗组都显著性上升， 5 k m 拮抗组相对于5 k i n 显著性下降。根田鼠e t a 蛋白含量在低氧7 k i n 和7 k m 拮抗 组显著性上升，f i i f 1 。蛋白含量在低氯5 k m 和7 k a n 及5 k m 拮抗组和7 k m 拮抗组 显著性上升。高原鼠兔e t - 1 蛋白含量没有显著性差异，h i f 1 血蛋白含量低氧7 k m 浙江大学硕士论文 和7 k m 拮抗组显著性上升。 结论： 1 ) 连续性低氧促进大鼠下丘脑室旁核e t - 1 的分泌和基因表达。 2 ) c r f 通过其l 型受体参与连续性低氧后大鼠下丘脑室旁核e t - 1 分泌和基因表 达的促进作用。 3 ) 常压低氧促进小鼠和青藏高原土著动物根田鼠和高原鼠兔心脏和肌肉组织中 e t - l 的表达。 4 ) 小鼠、根田鼠和高原鼠兔心脏和肌肉组织中表达的转录因子h i f l a 和n f 一1 ( b 可能参与低氧促进e t - 1 表达的调控作用。 关键词：低氧应激；内皮素1 ：大鼠；小鼠；根田鼠；高原鼠兔；下丘脑室旁核 心脏：肌肉；免疫组织化学法；放射免疫测定；w e s t e r nb l o t 浙江大学硕士论文 a b s t r a c t e t - 1 ，a ni m p o r t a n tp e p t i d e ，i sr e l a t e dw i t hn e a r o e n d o c r i n o l o g ys y s t e ma n dc h r o n i c h e a r tf a i l u r e i tr e q u i r e st h em a i n t e n a n c eo fh o m e o s t a s i sp r o c e e d i n g w h e nt h eb o d yi s e x p o s e dt ot h es t r e s ss u c ha sh y p o x i aa n ds t r e t c h ，t h ee x p r e s s i o no fe t - 1w o u l dc h a n g e c o n s e q u e n t l y i nt h ep a s ty e a r s ，e t - 1h a sb e e nf o u n di ns e v e r a ln o n - v a s c u l a rt i s s u e s ， i n c l u d i n gt h o s eo ft h ec e n t r a ln e l v o t l ss y s t e m ( c n s ) ，a n da tp r e s e n t ，m a n yr e s e a r c h e s s h o wt h a te t - 1p l a y san e u r o m o d u l a t o r yr o l ei th a sb e e ns h o w nt h a te t - 1 ( 1 0 1 0t o1 0 8 m ) o re t - i ( o 1t o 1r a m ) s t i m u l a t e st h er e l e a s eo fa r g i n n i ev a s o p r e s s i n ( a v p ) a n d s u b s t a n c ep ( s p ) f r o map e f i f u s e dr a th y p o t h a l a m u s h y p o x i a ，o n eo ft h ee n v i r o n m e n t a lf a c t o r si np l a t e a u ，i sd u et oal o w e r e do x y g e n p r e s s u r e ，w h i c hl e a d st oo x y g e nd e f i c i e n c yo ft h ew h o l eo r g a n i s m ，a n de v e ni nt i s s u e s a n dc e l l s ，c o n s e q u e n t l yd i s t u r b s p h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e s a n dd o e sh a r mt oh e a l t h h y p o x i aw i l le n h a n c ec r fe x p r e s s i o na n di n d u c et h er e s p o n s eo ft h eh y p o t h a l a m i c p i t u i t a r y a d r e n a l ( h p a la x i sa n de n d o c r i n es y s t e m s t h i ss t u d ya i m sa td e t e r m i n i n gt h e p a t t e r n so fe n d o t h e l i n 一1 ( e t - 1 ) r e s p o n s ea n dc o r r e l a t i o nw i t hc o r t i c o t r o p i n r e l e a s i n g f a c t o r ( c r y ) a n dc r fr e c e p t o rs u b t y p ei ( c r f r i ) o rn f r ba c t i v a t e db yh y p o x i a t oi n v e s t i g a t eh o wc r fr 1m o d u l a t e st h ee x p r e s s i o no fe t 一1i np v no ft h er a t w e t e s te t - 1p r o t e i nb yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n de t qm r n ab yi ns i t uh y b r i d i z a t i o n a f t e ri p c r yr 1a n t a g o n i s ti nr a t s t h ee t - 1p r o t e i ni nt h eh e a r to rs k e l e t o nm u s c l eo f t h r e em a m m a l s ( m i c e ，mo e c o n o m u sa n d0c u r z o n i a d ) w e r ea s s a y e db yr i a ，a n dt h e h i f 一10 【e x p r e s s i o nw a st e s t e db yw e s t e r nb l o t ： j 。h er e s u l t sa r ea sf o r o w e d ： 1 ) e f f e c t so fc o n t i n u a lh y p o x i ao nt h ee t - 1a n dc r f e x p r e s s i o ni nt h er a t t h ei m m u n o r e a c t i v ee t - 1 p r o t e i n i np v no ft h eh y p o t h a l a m u ss h o w e da s i g n i f i c a n td e c r e a s ef o r5df o l l o w i n gc h a h 5 k m ，t h i sh y p o x i ad i dn o tc a u s es t a t i s t i c a l d i f f e r e n c eo fe t - 1l e v e lf o ro t h e re x p o s u r ep e r i o d sa l t h o u g hs h o w i n gad e c r e a s e d t e n d e n c y c h a h 5 k m f o rl da n d2 dd e c r e a s e dc r y p e p t i d el e v e li np v n h o w e v e r , t h e 浙江大学硕士论文 h y p o x i af o r5 da n dlo ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dc r f p r o l o n g e de x p o s u r et oc h a h 5 k m f o r15a n d2 5 dd i dn o ta l t e rc r fp e p t i d el e v e li np v n ，t h ec h a h 5 k mi n c r e a s e d p l a s m ac o r t i c o s t e r o n el e v e l sf o rld ，2 d ，5 d ，10 d ，a n d15 d ，r e s p e c t i v e l y , t h ep e a ko ft h e p l a s m ac o r t i c o s t e r o n eo c c u r r e da t5a n d10d ，a n dr e t u r n e dt ot h ec o n t r o ll e v e la t2 5d ， t h ec r fp e p t i d ew a si n c r e a s e db yc h a h s k mf o r5 d t h i si n c r e a s ew a s m a r k e d l ya b o l i s h e db yad a l l yp r e t r e a t m e n tw i t hc p 一15 4 ，5 2 6 ，ac r f r la n t a g o n i s t c r fm r n ae x p r e s s i o ni np v nm a r k e d l yi n c r e a s e db yc h a h 5 k mf o r5 d a p r e i n j e c t i o no f c p - 15 4 ，5 2 6f o l l o w i n gt h eh y p o x i ae x p o s u r ec a u s e dad e c r e a s ei nc r f m r n a e x p r e s s i o ni np v ns h o w i n ga l la b o l i s h e da c t i o no f t h ei n c r e a s e dc r f m r n ab y c r f r la n t a g o n i s t t h ep l a s m ac o r t i c o s t e r o n el e v e li nt h eg r o u po fc h a h 5 k mf o r5 d w a sr e m a r k a b l yi n c r e a s e d ，h o w e v e r , t h ed a i l yt r e a t m e n tw i t hc r f r la n t a g o n i s t f o l l o w i n gc h a h 5 k m r e s u l t e di nt h ed e c r e a s e dc o r t i c o s t e r o n e t h ei m m u n o r e a c t i v i t y o fe t - 1w a sd e c r e a s e dr e m a r k a b l y t h i sh y p o x i a e a t i s e de t - 1d e c r e a s e ，h o w e v e r , w a s r e v e r s e da n di n c r e a s e dd r a m a t ! c a l l yb yf o l l o w i n gc r f r la n t a g o n i s tt r e a t m e n t e t _ 1 m r n ai np v nw a si n c r e a s e dr e m a r k a b l y , w h i c hw a sr e v e r s e db yc r f r la n t a g o n i s t t r e a t m e n t 2 1e f f e c t so fa c u t eh y p o x i ao nt h ee t _ 1a n dh i f - l ae x p r e s s i o ni nt h eh e a r to ft h e m i c e ，膨o e c o n o m u sa n dd c u r z o n i a e b yu s i n ga ni n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o no fc o c l 2 ( 2 0 ，4 0a n d6 0m g & g ) ，e t - 1a n d h i f l de x p r e s s i o ni nm i c eh e a r tm a r k e d l yi n c r e a s e dv i aa l li n j e c t i o no ft h r e ed o s e so f c o o l 2 ，e t - 1e x p r e s s i o ni n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yw i t ht h ed o s eo f6 0m g k ga n dh i f 一1a e x p r e s s i o ni n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yw i t ht h ed o s eo f4 0m g k ga n d6 0m g k gi n 尬 o e c o n o m u s c o c l 2h a dn os i g n i f i c a n tr o l ei n0c u r z o n i a e e t - ia n dh i f l ae x p r e s s i o ni nm i c eh e a r tm a r k e d l yi n c r e a s e dw i t h2 3 k m 。5 k m a n d7 k mh y p o x i af o r6 h ，a n dw i t h 7 k i nh y p o x i aa n dt h es u b c u t a n e o u so fn f 一1 cb a n t a g o n i s tt h ee t - 1a n dh i f l ae x p r e s s i o ni n c r e a s e dm a r k e d l y i n3 _ o e c o n o m u s ，e t - 1 e x p r e s s i o n i n c r e a s e df o l l o w i n g5 k i n ，7 k r na n dt h e7 k ma n t a g o n i s ta n dh i f le t e x p r e s s i o ni n c r e a s e df o l l o w i n g7 k ma n dt h e7 k ma n t a g o n i s th o w e v e r , e t - ia n d h i f - 1qe x p r e s s i o ni n c r e a s e do n l yf o l l o w i n g7 k i na n dt h e7 k ma n t a g o n i s ti nd c u i 2 0 y i i a e 一 一 塑堡查兰堡主堡苎 3 ) e f f e c t so fa c u t eh y p o x i ao i lt h ee t - 1a n dh i f l ae x p r e s s i o ni nt h es k e l e t o n m u s c l eo f t h em i c e ，腻o e c o n o m u sa n d0 c u r z o n i a e b yu s i n ga l li n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o no fc o c l 2 ( 2 0 ，4 0a n d6 0m g k g ) ，e t - 1a n d h i f l ae x p r e s s i o ni nm i c eh e a r tm a r k e d l yi n c r e a s e dv i aa ni n j e c t i o no ft h r e ed o s e so f c o c l 2 e t - 1e x p r e s s i o ni n c r e a s e 。ds i g n i f i c a n t l yw i t ht h ed o s eo f6 0m g k ga n dh i f l a e x p r e s s i o ni n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yw i t ht h ed o s eo f4 0m g k ga n d6 0m g k gi nm o e c o n o r nz l s c o c l 2h a dn os i g n i f i c a n tr o l ei noc u r z o n i a e e t - 1a n dh i f le te x p r e s s i o ni nm i c eh e a r tm a r k e d l yi n c r e a s e dw i t h2 3 k m ，5 k m a n d7 k mh y p o x i af o r6 h ，a n dw i t h7 k mh y p o x i aa n dt h es u b c u t a n e o u so fn f kb a n t a g o n i s tt h ee t - 1a n dh i f l e te x p r e s s i o ni n c r e a s e dm a r k e d l y i nmo e c o n o m u s e t - 1 e x p r e s s i o ni n c r e a s e df o l l o w i n g5 k m ，7 k r na n dt h e7 k i n a n t a g o n i s t a n dh i f 0 e x p r e s s i o ni n c r e a s e df o l l o w i n g5 k m ，7 k m ，5 k r na n t a g o n i s ta n dt h e7 k i na n t a g o n i s t h o w e v e r , e t - 1a n dh t f l ae x p r e s s i o ni n c r e a s e do n l yf o l l o w i n g7 k ma n dt h e7 k m a n t a g o n i s ti no c u r z o n i a e t h o s ed a t as u g g e s tt h a t ： 1 ) c o n t i n u a l h y p o x i ai n d u c e dt h ee t - ie x p r e s s i o ni np v no fr a th y p o t h a l a m u s 2 ) c r f r lm o d u l a t e dt h ee t - 1e x p r e s s i o nu n d e rt h ec o n t i n u a lh y p o x i ai np v no fr a t h y p o t h a l a m u s 3 ) a c u t eh y p o x i ai n d u c e dt h ee t - 1e x p r e s s i o ni nt h ei nt h eh e a r to rs k e l e t o nm u s c l eo f t h em i c e 。m ? o e c o n o m h sa n doc u r g o n i a e 4 ) h i f l aa n dn f kbm i g h tm o d u l a t e dt h ee | 1e x p r e s s i o ni nt h eh e a r to rs k e l e t o n m u s c l eo f t h em i c e 。mo e c o n o m l g sa n d0c u r z o n i a e k e y w o r d s ：h y p o x i a ，e t - 1 ，r a t ，m i c e s k e l e t o nm u s c l e ，i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y mo e c o n o m u s ，0 c u r z o n i a e ，p v n ，h e a r t ， r i a ，w e s t e r nb l o t 7 浙江大学硕士论文 第一章前言 内皮素l ( e n d o t h e l i n ，e t - 1 ) 是1 9 8 8 年由日本学者y a n a g i s a w a ( y a n a g i s a w ae ta l ， 1 9 8 8 ) 在猪主动脉内皮细胞培养液中提纯并命名的物质，是目前所知血管收缩作用最 强的生物肽，具有广泛的生物学效应。正常条件下e t - 1 可能参与神经元的某些功能， 病理情况下则可能参与许多中枢神经系统疾病的发病和病理过程。据研究报道e t - 1 可以促进例如肾上腺素、p 物质、儿茶酚胺等的释放。e t - 1 作为一神旁分泌因子， 在心血管系统内环境稳定控制系统中起着重要作用：它还参与了心肌梗死等许多病 理生理过程。e t - 1 与脑血管及心血管等疾病的深入研究，对临床治疗脑血管及心血 管等疾病具有重要的价值。 我们实验室利用低气压舱模拟高原低氧，从整体、细胞和亚细胞水平，系统地 研究了低氧对下丘脑垂体肾上腺( h p a ) 轴的作用( 杜继曾，1 9 9 6 ) ，证明低氧抑 制c r f 神经元的发育( 杨生妹等，1 9 9 6 ) ；也证明了低氧抑制大鼠下丘脑一垂体甲 状腺( h p t ) 轴( 杜继曾，1 9 9 6 ；t a m a s y e t a l ，1 9 8 6 ) 和下丘脑垂体性腺( h p g ) 轴( 史小军等，1 9 9 8 ) 以及免疫系统轴( 白海波等，1 9 9 5 ；白海波等，1 9 9 7 ) 。随着 研究的深入，低氧对其他神经肽( 例如神经肽y 、血管紧张素、内皮素等) 的作用 也越来越受到研究者的重视。 自从1 9 8 8 年日本科学家y a n a g i s a w a 发现内皮素以来，至今已逾1 5 年的历史，作 为一个心血管的重要生物活性多肽，它不仅涉及内皮素的合成、代谢、降解、分布、 功能和生理作用，而且在心血管疾病中亦具有十分重要的意义。近年来内皮素受体 拮抗剂的出现和临床应用，又为内皮素的基础和临床研究注入了新的活力。此外内 皮索还在肿瘤、呼吸系统、l 肾病、糖尿病、和心源性、出血性休克等疾病中具有重 要的病理生理意义。因此，研究应激条件( 特别是低氧应激) 时e t - 1 的功能变化及 其调控机制对于机体疾病的治疗有重要的理论价值和临床意义。 ， e t - t 有2 1 个氨基酸，分子量为2 ，4 9 2 d ，n 端为胱氨酸，c 端为色氨酸，全链内 有4 个胱氨酸形成两对二硫键，其结构与一般活性肽不同，而与某些动物神经毒素具 有同源性。e t - i 的合成首先是e t 基因转录成核不均r n a ，后者剪切成m r n a ，进而 译成由2 1 2 个氨基酸组成的前一原一内皮素( p p e t ) 。p p e t 首先分裂成称为大内皮素的大 分子肽( y a n a g i s a w a e ta i ，1 9 8 8 ) ，大内皮素分三种，即由3 8 个氨基酸组成的大内皮 浙江大学硕士论文 素1 和大内皮素2 以及由4 1 个氨基酸组成的大内皮素3 。此后大内皮素经e t 转化酶 ( h i t e y ，1 9 9 5 ) 分解成2 1 个氨基酸组成的e t - 1 、2 和3 ，它们彼此之间仅2 6 个氨基 酸不同。e t - l 是在血管内皮上表达的( y a n a g i s a w ae ta l ，1 9 8 8 ) ，它是唯一在血管内 皮细胞上表达的e t 。e t - 2 在肾脏和空肠上表达，而e t - 3 在肾上腺、空肠和肾脏均表 达。脑内存在e t _ 1 平口e t - 3 ，由于e t 不能通过血脑屏障，提示e t - 1 是由脑组织产生的。 入脑的额叶、颞叶、顶叶皮层的3 6 层神经元细胞、侧脑室旁结构、丘脑神经核团、 尾状核、杏仁核、下丘脑、基底核、黑质、中缝核、小脑的p u r k i n j e 细胞、迷走神经 运动背核均有e t 表达，其中以丘脑下部和纹状体含量最高。e t 释放后须与靶细胞膜 上的特异受体结合，才能产生生物学效应。研究发现至少存在三种受体，g 1 e t 小 e t b i i e t c ( h i l e y ，1 9 9 5 ) 。e t 与不同受体结合可产生不同的功能，例如可产生即刻 效应和远期效应。e t 受体存在包括中枢神经系统在内的许多器宫，丘脑及丘脑下部、 侧脑室周围、穹窿下器、苍白球、尾状核、脑干、小脑、脉络丛、松果体、海马、 橄榄体、垂体等处均可见e t 受体，尤以脑干和小脑的受体数量最多。 y o s h i d a 等( y o s h i d ae ta l ，1 9 9 4 ) 发现e t - 1 是通过与兔动脉平滑肌细胞的e t a 受体引起血管收缩的。进一步研究发现e t 既可与兔和鼠的e t a 受体结合，又可与 其e t b 受体结合。受体激活后使c a 2 + 内流及细胞内c a 2 + 动员，同时激活磷酯酶a z 和c 、蛋白激酶c ，促进n a + - h + 交换，诱导c 1 0 s 原癌基因的转录，抑制n a + r a t p 酶。c a 2 + 增船引起平滑肌收缩，最终引起血管收缩。e t - i 仍被认为是目前能引起多 脏器动脉血管收缩的最强的血管收缩肽，它能引起人类、猫、鼠脑动脉长时间的持 续收缩。由于e t 与受体结合后分离非常缓慢，所以e t 具有长时间的收缩血管作 用，并且不易被清除和消退。许多学者指出，由于中枢神经系统及周围神经系统许 多神经元均有内皮素肽及受体的表达，e t - 1 可能是一种神经调质或者神经递质。e t 还能影响其它神经肽，例如p 物质、儿茶酚胺的释放。脑内血管内皮细胞是血脑屏 障的主要构成，血脑屏障的主要作用是调节水和电解质在脑内的平衡。对鼠和人的 微血管内皮细胞研究发现e t _ 1 能激活内皮细胞酶的活性，提示e t 1 可能参与缺血 性脑水肿的病理过程( s p a t ze ta l ，1 9 9 5 ) 。 体内及体外实验均证明了e t l 的收缩血管作用。这种收缩作用不易被清除， 而且具有剂量依赖性。通过血管造影术能观察到向脑池内注射e t - 1 能诱发犬的基 底动脉持续收缩，且收缩效应持续到2 4 小时以上。有的3 天后e t - l 引起的血管收 9 浙扛大学硕士论文 缩作用仍存在。许多研究结果表明，e t - 1 参与蛛网膜下腔出血脑血管痉挛的病理过 程，但是蛛网膜下腔出血脑血管痉挛的机制是复杂的，参与的因素很多，其机理尚 需进一步探索。由于神经元及神经胶质e t - 1 受体的表达，所以e t - i 除了促使血管 收缩引起缺血损伤外，还可能直接作用于神经元及神经胶质细胞。细胞内c a 2 + 超载 是缺血性脑血管病神经细胞坏死的重要原因。e t - 1 能增加体外培养的胶质细胞、神 经母细胞瘤和胶质瘤杂交的细胞内c a 2 + 浓度。对神经元也有类似的结果。其机制可 能是：通过影响磷酸肌醇的代谢使细胞内c a ”动员。使双氢吡啶敏感性电压门 控c a 2 + 通道开放，细胞外c a ”离子内流，导致细胞内c a 2 + 超载。另外，e t - i 升高 还可以刺激兴奋性氨基酸的释放，增多的兴奋性氨基酸激活e t a 受体，打开c a 2 + 、 n a + 通道，改变离子通透性，使c a 2 + 、n a + 大量内流，引起细胞肿胀、坏死。b a r o n e 等( g a r o n ee ta l ，1 9 9 4 ) 用微透析法对鼠局灶性和全脑性脑缺血时细胞外液进行测 定发现e t - 1 水平升高。b i a n 等( b i a ne ta l ，1 9 9 4 ) 报道了兔m c a o 脑缺血模型脑 组织内皮素的含量，结果发现脑缺血后脑组织e t 合成增加，且与缺血性脑水肿的 发展呈正相关。该结果提示内皮素可能参与脑缺血、脑损伤，加重缺血性脑水肿。 引起e t - i 水平升高的原因不明，可能为：与包含有内皮素的神经元及内皮细胞 的脑组织破坏后逸出来有关；e t - 1 分泌反应性增强：急性缺血性脑梗塞时局部 灌注压下降，致使血管内皮细胞受到的压力减少，于是内皮细胞产生e t 增多： 局灶性脑缺血时反应性星形胶质细胞均有可能是产生e t - l 的来源之一。不论是何 种原因引起的e t - 1 升高，升高的e l - l 可引起侧支血管收缩，使病灶局部血流量减 少，加重梗塞区脑组织缺血及神经元损伤，并形成恶性循环，使预后恶化。实验证 明给动物注射e t - 1 可造成缺血型局灶性脑损伤，并且e t - 1 所致梗塞范围与e t - 1 的浓度有关。随着剂量的增大，缺血范围也增大。从大脑中动脉注射e t - 1 己成为 制作鼠脑缺血模型的一种方法( m a r s t o ne ta 1 1 9 9 5 ) 。实验性心肌缺血模型动物和 心肌梗塞患者，血浆e t i 浓度都很高。 近年来人们对低氧反应通路的研究越来越深入。低氧诱导因子h i f l a 被认为 是诱导低氧基因和修复细胞氧内环境稳定的一个核心调节因子。作为转录因子 h i f ic t 已经被发现能在低氧应激下启动多种低氧适应的基因转录，如e t - i 、e p o 等。1 9 9 2 年，s e m a n z a 和w a n g 在低氧的肝癌细胞株h e p 3 b 的核提取物中发现一种 特异性结合于红细胞生成桑( e p o ) 3 端增强子的寡核苷酸序列( 即低氧反应元件： 浙江大学硕士论文 i - i r e ) 的核蛋白因子( s e m a n z ae ta l ，1 9 9 2 ) 。它与低氧反应相关的基因的h r e 结合， 介导低氧反应，在细胞低氧途径中发挥重要作用，此蛋白因子即为低氧诱导因子 ( h v p o x i a - i n d u c i b l ef a c t o r , h i f ) 。迄今为止，一共发现了三大h i f 基因家族：h i f 1 、 h i f 一2 和h i f 一3 。h i f l 是一个二聚体由h i f l 毡； 丑h t f 一1 b 两个亚基组成( s e m e n z a e ta l ，2 0 0 0 ) 。h i f 。1 1 3 在细胞中构建性表达，不受低氧诱导，但h i f 一1 a 直接与细胞内 氧分压有关：常氧下h i f 1 e t 迅速降解，而在低氧下h i f 1 伍蛋白的迅速积累，可呈 指数形式增高。h i f 1 d 的表达调控表现在m r n a 、蛋白、核定位和转录活化作用等 多水平上，但大多数实验证明h i f l am r n a 水平的调节并不重要，推测低氧对其 的调节主要发生在翻译和翻译后水平( g r e g ge ta l ，2 0 0 0 ) 。但r a t c l i f f e 等的研究并 未发现h i f 一1 在翻译水平上的调节机制。在翻译后水平上，发现h i f 10 【的调控区 在5 3 0 6 5 2 氢基酸之阀，将这段序列进行蛋自表达，常氧可使其降解，水平下降， 而低氧、c o c l 2 、去铁胺可使其稳定，水平升高。 作为另一类关键性的核转录因子核转录因子n f r d 3 ( n u c l e a rt r a n s c r i p t i o n f a c t o r - w b ，n f r d 3 ) 通常以同源或异源二聚体非活性形式存在于几乎所有类型细胞的 胞质，具有十分重要的功能。它与免疫细胞的活化，t 和b 淋巴细胞的发育，应激性 反应，细胞凋亡等多种细胞活动有关。n f k b 家族成员通常以同源二聚体或异二聚 体形式与其抑制蛋白i r b s 形成复合物，以非活性形式存在于细胞质中，只有在受到 各种活化因素的作用，n f v d 3 才能被激活。能激活n f v b 的因素很多，包括各种应 激性刺激，细菌粘多糖，病毒，氧自由基和多种细胞因子等。n