（化学工艺专业论文）磁性载细胞海藻酸盐微胶囊的制备及性能研究.pdf

摘要 本文以细胞固定化培养为研究背景，开展对载磁壳聚糖一海藻酸盐微球制各 的研究。采用脉冲电场工艺制备载磁微球，克服了传统工艺繁琐、操作复杂、大 量有机溶剂残留的弊端。鉴于天然多糖海藻酸钠和壳聚糖都具有良好的生物相容 性和生物降解性，而且价格低廉、易于工业化生产，实验将它们作为磁性微球的 载体材料。首先以微球粒径为检测指标，采用脉冲电场法制各载磁海藻酸钙微球； 在此基础上，以微球膜膨胀率为评价参数，进行了成膜工艺的研究。通过系列单 因素实验及正交实验，得到以下重要结论： 1 制各了平均粒径2 0 0 9 m 的载磁微球，微球球形度优良、在水中分散性好、具 有强磁响应性。 2 载磁海藻酸钙微球的制备因素中，f e 3 0 4 浓度、海藻酸钠浓度、锐孔孔径、溶 液滴出速度四因素与微球粒径均呈正向相关。c a c h 浓度与微球粒径均呈负相 关。海藻酸钠浓度对粒径影响显著，但浓度过低时不能形成完整微球。实验 采用海藻酸钠浓度1 0 - 5 0 9 l 。f e 3 0 4 浓度、c a c i z 浓度、溶液滴出速度为次要 影响因素。 3 载磁海藻酸钙微球的正交实验结果表明，在f e 3 0 4 浓度为i g l 、海藻酸钠浓 度为 0 9 l 、采用6 0 0 肛m 内径的金属锐孔、溶液滴出速度为4 m l h 、c a c h 浓度为2 0 9 l 的工艺条件下，可制各出形态好、粒径小的微球。其中，海藻 酸盐浓度为显著影响因素。 4 微球的成膜工艺各因素中，采用浓度为t g l 、分子量为5 万的壳聚糖，成膜 2 0 m i n 的条件下，可制各出膜稳定性最好的载磁壳聚糖海藻酸钙微球。 5 制各工艺对被包封细胞的生长代谢活性无影响。f e 3 0 4 包封率为9 3 , - - - , 9 6 。 脉冲电场工艺可实现磁性载细胞微球的高效简便制备。 关键词：脉冲电场；f e 3 0 4 ；壳聚糖；海藻酸钠；微球 a b s t a c t t h et h e s i sa i m st h ei m m o b i l i z e dc e l l sa st h es t u d yb a c k g r o u n da n dc a r r i e so u tt h e p r e p a r a t i o no fm i c r o r e a c t o rb a s e dc h i t o s a n - a l g i n a t em i c r o c a p s u l ew i t hf e 3 0 4 c o m p a x e dw i t ht h ep r e p a r a t i o no fm i c r o c a p s u l eb yt r a d i t i o n a lt e c h n o l o g y , s u c ha st h ec o m p l e x i t yo ft e c h n o l o g ya n dr e s i d u a lo fl a r g eo r g a n i cs o l v e n ，t h et e c h n o l o g yo fp u l s e e l e c t r i cf i e l dh a sm a n yg o o dc h a r a c t e r s c o n s i d e r i n gt h ec h a r a c t e r so fb i o c o m p a t i b i l i t y 、b i o d e g r a d a b i l i t y 、l o w e rp r i c ea n de a s i e ri n d u s t r i a l i z a t i o nf o rc h i t o s a na n ds o d i u m a l g i n a t e ，w ec h o o s et h e ma st h em a t e r i a l so fm a g n e t i cm i c r o c a p s u l e s f i r s t l y , t h e d i a m e t e ro fm a g n e t i cm i c r o c a p s u l e sw a sc h o s e na sj u d g ec r i t e r i a w ep r e p a r e dt h e s o d i u m a l g i n a t em a g n e t i cm i c r o s p h e r eu s i n gt h et e c h n o l o g yo fp u l s ee l e c t r i c f i e l d t h e n ，t h es t u d yo fm e m b r a n et e c h n i c sw a sc a r d e do u tb yt e s t i n gt h es w e l l i n g r a t i oo fm e m b r a n e t h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n sw e r em a d et h r o u g ht h es i n g l ef a c t o r t e s t sa n do r t h o g o n a lt e s t s ： 1 m e a nd i a m e t e ro fm a g n e t i cm i c r o s p h e r e sp r e p a r e di nt h ee x p e r i m e n tw a sa b o u t 2 0 0 阻n i ta l s oh a sg o o dd e g r e eo fs p h e r i c i t y , e x c e l l e n td i s p e r s i b i l i t yi nt h ew a t e ra n d g o o dm a g n e t i cr e s p o n s i b i l i t y 2 a m o n g f a c t o r so ft h e p r e p a r a t i o n o fm a g n e t i c a l g i n a t em i c r o s p h e r e ，t h e c o n c e r n t r a t i o no ff e 3 0 4a n da l g i n a t e 、t h es i z eo fo r i f i c e 、p u m ps p e e da s s u m e da p o s i t i v ei n t e r a c t i o nw i t ha l g i n a t ed i a m e t e r , w h i l et h ec o n c c m t r a t i o no fc a c l 2a s s u m e d ap o s i t i v ei n t e r a c t i o nw i t ha l g i n a t ed i a m e t e r t h ec o n c e r n 仃a t i o no fa l g i n a t ew a st h e m o s tr e m a r k a b l ef a c t o r h o w e v e r , t h el o w e rc o n c c m t a t i o no fa l g i n a t ef a i l e dt op r e p a r e t h em i c r o s p h e r e t h ec h a n g eo fm i c r o s p h e r ed i a m e t e rw a ss t e a d yw i t ht h ef o l l o w i n g p r e p a r a t i o nc o n d i t i o n s ：a l g i n a t ec o n c e m t r a t i o n - - - 10 - - 5 0m g m l t h ep u m ps p e e da n d t h ec o n c e r n t r a t i o no ff e 3 0 4a n dc a c l 2w e r en o tr e m a r k a b l ef a c t o r s 3 t h eo r t h o g o n a lt e s t si n d i c a t e dt h a tt h em a g n e t i ca l g i n a t em i c r o s p h e r e so f9 0 0 d s h a p ea n ds m a l ld i a m e t e rc o u l db ep r e p a r e d i nt h e f o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：t h e c o n c e m t r m i o no ff e 3 0 4 一lg l ，t h ec o n c e m t r a t i o no fa l g i n a t e 一10 9 m ，t h es i z eo f o r i f i c e 一6 0 0 p m ，t h ec o n c e r n 仃a t i o nc a c l 2 - 2 0g l ，a m o n gt h e m ，t h ec o n c e r n t r a t i o no f a l g i n a t ew a st h em o s tr e m a r k a b l ef a c t o r 4 t h em i c m s p h e mm e m b r a n ew a sm o s ts t e a d yw h e nt h em o l e a u l a rw e i g h to f c h i t o t o s a nw e r e2 0 0 0 0d a l t o na n d5 0 0 0 0d a l t o na n dt h ec o n c e r t r a t i o no fc h i t o s a nw a s 1m g m l 5 t h ep u l s e de l e c t r i cf i e l dp r o c e s sw a ss i m p l e ，c o n v e n i e n ta n df e a s i b l e ，a n di th a d n on e g a t i v ee f f e c to nt h eg r o w t ha n dm e t a b o l is mo fc e l l s t h ee n c a p s u l a t i o n e f f i c i e n c yo ff e 3 0 4w a s9 3 , - 。9 6 k e yw o r d s ：p u l s ee l e c t r i cf i e l d ；f e 3 0 4 ；c h i t o s a n ；a l g i n a t e ；m i c r o s p h e r e 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名： 查垫指导教师签名：耷i 刍塑日 8 年6 月1 5 日翮年月引习 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：7 z - l讲 、i i 产 的思年6 月心日 1 1 细胞固定化技术 第一章绪论 当前发酵工业关注的重点问题是消除产物对细胞生长代谢的抑制作用、保护 发酵过程中的细胞活性、简化发酵产物的分离操作并降低分离过程能耗、解决因 染茵引起的倒罐损失等问题【l 】。针对这些问题，人们采用固定化细胞技术，即用 适当的载体材料和方法负载细胞，在一定程度上可以保护细胞免受发酵过程的机 械搅拌剪切损伤、增加细胞浓度和发酵强度、为实现细胞与产物分离提供便利。 固定化细胞技术是2 0 世纪7 0 年代兴起的一种生物技术。所谓固定化细胞技 术【2 1 是指用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持生 化活性、反复使用的方法。由于固定化细胞技术不需要把酶从细胞中提取出来， 酶活力损失少，酶活回收率较高，因此该技术的应用已经超过固定化酶的应用。 细胞被固定化后细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物分离容易、能实 现连续操作，可以大大提高生产能力等优势，因此在近几十年来固定化细胞技术 得到了迅速的发展和广泛的应用。 1 9 5 9 年，h a t t o r i 和f u r u s a k a 3 】首次将大肠杆菌e c o l i 吸附在树脂上，实现了 细胞固定化。1 9 7 3 年，含有l - 天冬氨酸酶的微生物被固定化【4 】，并用于l - 天冬 氨酸的生产。2 0 世纪7 0 年代末，动物、植物固定化细胞技术也得到了快速的发 展。目前随着对细胞固定化技术的深入研究，固定化活细胞或称为固定化增殖细 胞的研究工作几乎涵盖了所有的微生物发酵工艺，已有大量的研究文献发表，并 且部分研究成果已应用于生产实践，比如啤酒生产、氨基酸、有机酸发酵和抗生 素生产等【孓引。 1 1 1 固定化细胞的制备方法 固定化细胞方法按照固定化载体与作用方式的不同，可分为吸附法、包埋法、 共价结合法、交联法。 吸附法9 1 吸附法y , n q 载体结合法，是依据带电的微生物细胞和载体之间的 静电、表面张力和粘附力的作用，而使微生物细胞固定在载体表面和内部形成生 l 物膜的方法，可分为物理吸附法和离子吸附法两种。此法交为简便，活力损失较 小，但细胞与载体作用力小，易脱落。 共价结合法共价结合法是细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基 团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。此法的优点是细胞与载体结 合紧密，不易脱落，但制备较难，且活力损失较大。 交联法交联法是利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团如 氨基酸、羟基、硫基、咪唑基发生反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细 胞，其结合力是共价键。此法制备麻烦，活力损失较大，但细胞与载体结合较紧。 1 1 2 固定化细胞的载体材料 适用于固定化技术的常用载体材料包括有机载体、高分子载体和无机载体 等，其中高分子材料因其诸多良好的性能往往成为人们首选的载体材料。高分子 载体一般可分为天然高分子材料和人工合成高分子材料两大类。天然高分子材料 主要包括卡拉胶、明胶、琼脂、甲壳素、壳聚糖、海藻酸钙、醋酸纤维素和血纤 维蛋白等；人工合成高分子材料主要包括聚丙烯酰胺( p 枷) 、聚乙烯醇( p v a ) 、 聚氨酯、光敏树脂、聚乙烯氧化物等高聚物。 在选择高分子载体材料时应考虑下列关键因素【1 0 】：载体材料的稳定性( 包 括对温度、p h 值、微生物试剂和化学试剂的稳定性) 及生物相容性；制备固 定化细胞的方法及成型的难易；较好的机械强度并能长时间重复使用；毒性 ( 包括对人和对细胞的存活性) 的影响；培养基的来源和成本。 如何进一步克服高分子载体使用寿命较短，操作半衰期不够长，对底物和 产物存在扩散阻力等问题成为目前细胞固定化研究的热点。为此，微胶囊固定化 技术已被国际上列为2 1 世纪重点研究开发的高新技术。生物微胶囊作为一种新 兴的细胞固定化载体，已经得到很好的发展。 1 2 生物微囊化固定化培养细胞 生物微胶囊的典型特征是具有一层半透的微囊膜和膜内的液态环境。微囊膜 将细胞、酶等大分子物质阻隔在液态环境中，而允许细胞所必需的碳源、氮源、 氧、无机盐等小分子物质的自由进入及囊内生物物质的重要代谢产物的自由排 2 出；同时，微囊膜又阻止外环境中生物大分子如抗体等地进入。因此，生物微胶 囊的主要功能是保护膜内细胞核控制物质通过微胶囊的传递，此种培养方式具有 许多突出的优点，现为细胞固定化研究的一个热点。 与传统的游离细胞培养相比，生物微胶囊具有以下优点： ( 1 ) 微胶囊对包埋的细胞可以起到隔离和保护的作用； ( 2 ) 利用微囊化培养方式可以实现细胞的高密度培养，相应的提高产品浓度 和生物转化的效率； ( 3 ) 微囊化细胞可以重复或连续使用而不会大量流失； ( 4 ) 抗污染效果好。 1 2 1 微胶囊技术的基本概念和内涵 微胶囊技术是一种用成膜材料把固体或液体包覆使形成微小粒子的技术，其 中，被包覆的物质通常为囊心，微胶囊外部由成膜材料形成的包覆膜称为囊壁。 囊心可以是固体、液体、气体及细胞微生物等生命物质。形成囊壁的材料也很多， 有无机和有机材料，但应用最普遍的是高分子材料，常用的微胶囊制备材料由蛋 白质类、植物胶类、纤维素类、缩聚物类、共聚物类、均聚物类、腊类和无机材 料类等。通常所说的微胶囊粒径大小均在几微米到1 - 2 毫米之间，新近出现的 纳米微胶囊粒径在1 - 1 0 0 0 纳米范围。 微胶囊的大小：一般在2 - 2 0 0 1 m a 范围内，理论上可制成在0 0 1 - - - 100 0 0 眦n 的微胶囊。囊壁的厚度一般在0 5 - - - , 1 5 0 9 m 范围内。 微胶囊的形状：微胶囊可呈现各种形状，如球形、粒状、肾形、谷粒形、絮 状和块状。 微胶囊具有改善和提高物质外观及其性能的能力。具体的讲，微胶囊能够储 存微细状态的物质，并在需要时释放该物质。微胶囊亦可转变物质的颜色、形状、 溶解性、反应性、耐久性、压敏性、热敏性及光敏性。 微胶囊技术是在本世纪3 0 年代开始其研究工作的，首先是美国依靠凝聚法 微胶囊技术成功地研制出无碳复写纸，从此微胶囊技术得到迅速发展。至今已拓 展到医药、食品、农药、饲料、印刷、涂料、粘合剂、化妆品、洗涤剂、感光材 料、纺织等行业。特别是微胶囊技术应用于印刷领域中，产生了许多新的工艺， 增加了新功能，提高了产品的附加值，我国该技术的研究尚在起步阶段。 1 2 2 微胶囊的制备方法 1 乳化一溶剂挥发法 此法又称为液中干燥法，传统上常用于聚乳酸( p l a ) 、乳酸羟基乙酸共聚 物( p l g a ) 等微球的制备。将囊心物质溶解或者分散在材料溶液中( 如连续相 及乳化剂溶液) 制成乳浊液，挥发除去材料溶剂，分离得微球。针对不同囊心物 质、不同材料，必须对有机溶剂种类、乳化剂选择、药物与载体重量比、载体重 量与有机相体积比、乳化温度和溶剂挥发的温度等进行多项筛选工作，以制备合 乎要求的微球。近年来也采用壳聚糖作为乳化法的制备材料。对于水溶性差的物 质，为了提高运载率，将其溶于油相，以壳聚糖稀醋酸溶液为连续相，获得o w 初乳，加入到油相中，形成o w o 复乳，用戊二醛等交联，离心纯化干燥而得。 由于该类方法使用了戊二醛等化学交联剂，为了避免其毒副作用，有研究得出可 用热交联法与天然交联剂交联法制备【1 1 ，1 2 】。据报道，用天然交联剂g e n i p i n 替代戊 二醛所获得壳聚糖药物注射微胶囊，其毒副作用小，更适于作为注射药物的长效 靶向控释【1 3 _ 1 5 1 。 2 喷雾干燥法 该法是制备微球的一种物理机械法，包括流化床喷雾干燥法( 又称空气悬浮 法) 与液滴喷雾干燥法 1 6 , 1 7 】。前者通常是囊材溶液从流化床的底板空隙喷出，在 流化床中心固定的开口圆筒内，将其喷在被向上气流吹动的固态囊心物上得到微 囊；后者是将药物分散在成球材料的溶液中，再用喷雾法将此混合物喷入热气流 中使液滴干燥固化得到微球。常用的仪器设备为双喷嘴喷雾干燥装置，其中一个 喷嘴喷出药物水溶液和聚合物( 乳酸羟基乙酸共聚物，p l g a ) 有机溶剂组成的 乳浊液，另一个喷嘴同时喷出5 甘露醇水溶液。乳浊液介质在热气流中迅速蒸 发而形成微球，微球在离心力作用下抛向器壁前，其表面就被从另一喷嘴喷出的 甘露醇( 抗黏剂) 包裹，这样就避免了普通转盘式单喷嘴喷雾干燥器制备微球时 容易黏附在器壁表面的缺点。另外，由于缩短了在高温器壁黏附时间，大大增加 了多肽蛋白质类药物及微生物细胞等生物活性的保留率。 3 锐孔凝固浴法 4 锐孔凝固浴法是通过喷嘴将线性聚合物液滴喷入凝固浴中并使液滴固化形 成微球的方法。 近年来，利用锐孔凝固法制备口服微球的研究越来越多。典型例子是用带 针头的注射器将海藻酸钠溶液直接滴入氯化钙溶液中反应形成海藻酸钙凝胶珠。 若仅在重力场作用下，使海藻酸钠溶液自针孔滴出，液滴的重力必须克服针孔内 壁的表面张力及海藻酸钠溶液粘滞力才能使液滴从针孔末端滴落，通常在重力场 中滴制的微球粒径约为针? l # i - 径的2 5 - 3 倍，单位以n l n l 计。为了制备小粒径 微球，p o n c e l e 1 引、马小军等【1 9 1 相继开发了用于细胞固定化的静电液滴法微球制 备技术和设备，通过在锐孔和凝胶浴之间施加高压静电场，在远大于重力的电场 力作用下，锐孔处液滴在粒径较小时便可克服表面张力滴入凝胶浴固化，形成的 微球球形度好，粒径分布范围窄，产量可以达到1 0 0 0 m l _ h 。与乳化法相比，静 电法微球成型技术的主要特点是：微球成型过程简便、高效，成型条件温和，生 物质包封率和活性高，无需有机溶剂等。 1 2 3 微胶囊的功能与释放方式 1 微胶囊的功能 微胶囊的功能大体上分为两类：即保护保存物质和改变物质的形状和性质。 具体可分：( 1 ) 保护挥发性物质，如使香料的香味或农药的药性持久化；( 2 ) 使互 相作用的物质能混合、共存，如反应型粘合剂主体可与含固化剂的微胶囊混合而 改变原双组分状态；( 3 ) 防潮和抵抗光、氧的作用，一些容易受潮或受光和氧影 响会变质的药品，可制成微胶囊加以保护；( 4 ) 药物持续效用的控制，如微胶囊 化的药品，服用后能在胃内保持稳定而到肠道中方才溶化，以收到充分疗效；农 药、化肥也可利用微胶囊任意控制其持久性；( 5 ) 调节比重，如利用酚醛树脂来 包封氮气，使其漂浮在原油贮藏库的上部，以防止火灾；( 6 ) 使液体固态化，这 是微胶囊化最常用的功能。如无碳复写纸中无色染料油经微胶囊化转变为固体， 而被稳定在纸面上；( 7 ) 使颜色隐蔽，染色物质加上微胶囊后，外观上即呈白色； ( 8 ) 具有光敏性、热敏性和力敏性，如热的作用可使微胶囊变形破裂而释出灭火 剂；( 9 ) 具有半渗透性，通过选择适当的微胶囊保护膜可制成人造红血球。 2 微胶囊释放方式 微胶囊产品的释放方式，是通过调节温度和湿度、熔融、溶解、压力、扩散、 酯解、光分解、调节p h 值、超声波以及加入表面活性剂等手段进行的。 微囊化细胞培养的研究表明：微胶囊可以为细胞提供适宜的生存空问。 基于上述优点，微囊化细胞有着广泛的应用前景，如可应用于在微生物发酵 方面。微囊化动物与微生物细胞培养生产高产值生化药物，或直接作为药物用于 治疗神经内分泌疾病或其它单基因遗传病、肿瘤和心血管疾病等。此外，微囊 化细胞还可应用于环境污染物的降解等方面。但微囊化细胞在目的产物的分离和 提纯方面存在诸多不便，且目前微囊化细胞培养几乎全都采用间歇操作方式，费 时费力。此外，少数微囊染菌如不及时处理可能造成大面积污染，但传统作业方 式极为不便。载磁微球的出现为实现连续操作开拓了新的方向。 1 3 磁性微球及其制备技术 磁性微球是指以磁性粒子作为核心，在磁性粒子表面包裹高分子材料而形成 的微粒。磁性微球的研究始十2 0 世纪7 0 年代末，u g e l s t a d 成功地在重力条件下 制备了尺度均一的单分散的聚乙烯微球。这类微球兼具磁性粒子和高分子材料的 双重特性，一方面因其具有超顺磁性，在j i - 力l l 磁场的作用下能快速、简单地分离， 并可在磁场作用下定位，另一方面因其具有与生物活性物质反应的特殊功能团， 可以作为生物活性物质的载体。国外有学者将其形象地称为“动力粒子力 ( d y n a b e a d ) 。磁性微球因具有“在外界磁场存在下能定向运动 这一特殊性能， 使其在医药工业【2 4 1 ( 靶向药物、酶标、临床诊断) 、生物工型2 5 。7 】( 固定化酶、 细胞分离、细胞标记) 、化学- r 、| l , t 2 粥0 1 、环境保护【3 1 3 2 】和能源开剔3 3 ，3 4 】等各个领 域的研究日益活跃，并显示出较好的应用前景。 1 3 1 磁性微球的结构 磁性颗粒与高分子形成的复合结构与磁性微球的制备方法有关。从目前的研 究情况看，磁性微球一般为核壳式结构，可分为三大类【3 5 】： 1 核一壳结构，磁性材料为核，高分子材料组成壳层； 2 混合结构，磁性颗粒分散在磁性微球内部； 3 多层夹心结构，外层和内层为高分子材料，中间为磁性材料。 6 一 口 m 嘲膊期纳e 榭私煳孵嘲酝伯稿酬融 细笨细洲i 伯细蚺伪) | 瑚幻岍 图1 1 常见的磁性微球类型 f i g 1 1t h ec l a s s i f i c a t i o no f t y p e so f m a g n e t i cc a r r i e rp a r t i c l e s 1 3 2 磁性微球的特性 磁性微球的粒径为纳米或微米级尺寸，具有磁性材料的核心和高分子材料的 壳层，这些特殊的结构特征使它具有以下特性： 1 表面效应和体积效应：表面效应是指超细微粒的表面原子数与总原子数之 比随着粒径变小而急剧增大，表面原子的晶体场环境和结合能与内部原子的不 同，具有很大的化学活性，其表面能大大增加。这是由于表面原子的周围缺少相 邻原子而具有不饱和性，易与其他原子结合而稳定下来。可见表面效应是一种影 响化学特性的因素。体积效应是由于超细微粒包含的原子数减少而使带电能级加 大，会使物质的一些物理性质因能级间歇的不连续而发生异常。上述两种效应可 具体反映在比表面激增，微球官能团密度及选择性吸附能力变大，达到吸附平衡 的时间大大缩短，粒子的稳定性大大提高。 2 磁效应：具有磁性可使磁性微球在外加磁场作用下方便地进行分离和磁导 向。当磁性四氧化三铁晶体直径小于3 0 n m 时，具有超顺磁性，即在磁场中有较 强磁性，没有磁场时磁性很快消失，从而磁性微球能够在磁场中不被永久磁化。 3 生物相容性：磁性微球在生物工程，特别是在生物医学工程中应用，有一 个重要方面就是要有生物相容性。多数生物高分子如多聚糖、蛋白质类具有很好 的生物相容性。它们在人体内安全无毒，可降解，不与人体组织器官产生免疫原 性，这种性质在靶向药物中尤为重要。 4 功能基团特性：生物高分子有多种反应活性功能基团，如- o h ，c o o h ，- n h ：， 可连接具有生物活性的物质，如免疫蛋白、生物酶等。 7 1 3 3 磁性微球的制备方法 磁性高分子微球一般由磁性物质的超细粉末组成核，外面再由高分子材料包 裹磁核颗粒组成壳层。 1 顺磁性物质的制备方法 磁性微载体中的顺磁性物质决定了磁性微球的磁性能，制备磁响应性强，粒 径小的磁核是制备性能良好的磁性微球的关键。其制备方法很多，有化学共沉淀 法、机械研磨、金属有机热分解法、电解法和真空蒸镀法等【3 “1 1 。 目前应用最广泛的磁核颗粒是四氧化三铁，制备四氧化三铁纳米粒子的方法 主要有两种：中和沉淀法和沉淀氧化法。 1 ) 中和沉淀法：即将摩尔比为2 ：1 的三价铁盐( f e 3 + ) 与二价铁盐( f e 2 + ) 混合溶 液直接加到强碱性的水溶液中，铁盐在强碱性水溶液中瞬间水解结晶形成f e 3 0 4 纳米晶粒；另一种为滴定水解法，该方法是将稀碱溶液逐渐滴加到摩尔比为2 ：1 的三价铁盐( f e 3 + ) 与二价铁盐( f e 2 + ) 混合溶中，使铁盐的p h 值逐渐升高，达到6 7 时水解生成f e 3 0 4 纳米晶粒。反应原理为： f e 2 + + 2 f e + 8 0 h 一f e 3 0 4 + 4 h 2 0 2 ) 沉淀氧化法：是将二价铁盐( f e 2 + ) 溶液与适量的碱溶液混合反应生成 f e ( o h ) 2 胶体溶液，在搅拌的情况下可以采用向胶体中鼓入空气或加入双氧水两 种方式使f e ( o h ) 2 部分氧化并最后生成f e 3 0 4 纳米晶粒。反应原理为： f e 2 + + 2 0 h f e ( o h ) 2 3 f e ( o h ) 2 + o = = = = = f e 3 0 4 + 3 h 2 0 影响磁核颗粒性能的因素有：f e c l 2 和f e c l 3 的比例，n a o h 的量及反应温度 等。磁性微粒的大小对磁流体的稳定性至关重要，磁性微粒之所以能在基液中稳 定地悬浮是因为磁性粒子很小足以使分子的热运动克服粒子间相互聚集的磁性 引力。 2 磁性微球的制备方法 磁性微球的制备方主要有物理沉积和化学聚合两种途径。 1 ) 物理沉积法 物理沉积是先把聚合物溶解在含有磁性微粒的介质中，然后加入大量的沉淀 剂，使得溶解的聚合物从介质中沉析到磁性微粒的表面，从而形成复合磁性微球。 该方法制备的复合磁性微球经常含有溶剂、沉淀剂等杂质，微球形貌不易控制。 2 ) 化学聚合法 化学聚合主要有包埋法、单体聚合法、化学转化法及共沉淀洲4 2 1 。 a 、包理法是制备磁性聚合物微球最早的一类方法，它是将磁性微粒分散于 天然或合成聚合物溶液中通过雾化、沉积、蒸发等手段得到磁性聚合物微球【4 3 】。 由于其制备过程简单，费用低等特点，至今仍被加以改进并应用。b a h a r 等【删 将悬浮有f e 3 0 4 的油相倒入水相，搅拌，然后在室温下蒸发油相溶剂氯仿，制得 带有反应性醛基的磁性聚苯乙烯微球，并将其用于固定化葡萄糖淀粉酶的研究。 y e n 掣4 5 】在f e c l 2 和f e c l 3 的酸性水溶液中溶解壳聚糖，然后通过控制p h 值得到 磁性壳聚糖微球。e m i r 等【4 6 】将磁粉分散在壳聚糖的醋酸溶液中，然后将其乳化 在矿油和石油醚组成的油相中，以戊二醛作交联剂制备了磁性壳聚糖微球。国内 中南大学张阳德研究小组等【4 7 4 8 】采用类似的方法制备了磁性白蛋白微球并用于 抗肿瘤药物阿霉素的载体。c h a t t e r j e e 掣4 9 】将人血清蛋白溶解到悬浮有铁氧体粉 末的水中，并进一步将其乳化在含有司班的棉籽油中，然后加热使乳化体系升温 至1 3 0 。c ，令蛋白固化制备了磁性蛋白微球。d e l g a d o 研究小组【5 0 】采用复乳技术 ( d o u b l e e m u l s i o n ) ，将分散有磁性颗粒的水乳化分散在溶有聚乳酸的二氯甲烷中 形成w o 乳化体系，然后再将其乳化分散在含有1 w v 聚乙烯醇水溶液中，得 到w o w 复合乳液，最后在搅拌下将二氯甲烷挥发制备了磁性聚乳酸微球。 包埋法操作简单，但所制备的微球形态不规整，微球平均粒径较大( 约5 0 0 n m 以上甚至微米级，且粒径分布宽。此外，包埋法制备磁性聚合物微球通常要使用 较大量的乳化剂，尽管通过一些后处理可以去除大量乳化剂，但是微球中不可避 免会有残余，这样使磁性聚合物微球在生物医药领域的应用受到限制。 b 、单体聚合法是在磁性粒子和单体存在下，加入引发剂、稳定剂等聚合而 成的核壳式磁性高分子微球。方法主要有：辐照引发聚合【5 1 1 、微悬浮聚合【5 2 1 、 反相悬浮聚合、粒子凝胶反应、乳液聚合、种子聚合、无乳聚合法等。 日前，挪威的d y n a l 公司在磁球的制备方面较为领先。其方法是选用各种单 体在通氮、加热、加乳化剂和分散剂并多向搅拌下进行长时间的悬液或乳液聚合， 然后对制得微球上的化学基团进行还原或衍生化，用铁盐溶液浸润微球并抽真 9 空，最后碱化，有时还需再行包被。虽然性能也很好，但操作极为繁琐，需要专 门的设备和技术。 c 、化学转化法【5 3 ，5 4 1 是指将一定浓度的磁性金属阳离子渗透和交换到大孔树 脂中去，然后利用化学反应使金属离子转化为磁性金属氧化物，使之均匀分布在 聚合物的孔结构中渗透和转化步骤可反复进行；另一种办法是将树脂硝化，然后 在酸的存在下由硝酸将金属( 如铁) 氧化成金属氧化物，但这样得到的磁性微粒仅 限于树脂表面，该方法操作简便树脂中磁性分布均匀磁含量容易控制，但对树 脂的要求比较严格例如用一定比例的二价和三价铁离子溶液浸泡阳离子交换树 脂然后将树脂加入碱性溶液中使铁离子转化为f e 3 0 4 微粒这两步操作可以反复进 行。 d 、共沉淀法 5 5 - 5 8 1 是指二价与三价铁离子在碱性条件下沉淀生成f e 3 0 4 ，或 利用氧化还原反应生成f e 3 0 4 的同时利用高分子材料( 例如聚乙二醇葡聚糖等) 作 分散剂从而得t ! i ；, l - 包有高分子的磁性微球共沉淀法得到的磁性微球通常粒径较 小( 几n m 到几百个n 1 1 1 ) 因而具有较大的比表面积和固载量但其磁响应性较弱， 操作时需要较强的外加磁场例如向，二羧基聚乙二醇溶液中滴加二价与三价铁离 了溶液同时保持体系的p h 值在8 8 5 之间下反应一段时间利用外加磁场进行分 离后可以得到纳米级的聚乙二醇磁性微粒。 1 4 磁性微球的应用 磁性聚合物微球不仅具有聚合物微球的诸多特性，同时具有磁性，在6 1 - 力n 磁 场作用下可定向运动到特定部位，或迅速从周围介质中分离出来，因此自上世纪 7 0 年代中期以来，磁球不但在靶向给药【5 9 - 6 4 1 、细胞分离【6 5 6 7 1 、亲合色谱【6 8 6 9 】、 核酸研究、固定化酶等领域【7 0 - 7 4 得到广泛的研究，而且在有机和生化合成、生物 催化、环境食品微生物检测等方面也具有广泛的应用前景。下文就简要介绍磁性 高分子微球在细胞分离、固定化酶、靶向给药以及环境检测等部分领域的应用进 展。 1 细胞分离 细胞分离无论是在临床还是生物工程以及食品卫生等领域具有重大意义，细 胞分离是磁性聚合物微球的典型应用之一。与传统的细胞分离方法相比，磁性聚 1 0 合物微球用于细胞分离具有以下优点，可以直接从原样如血样，骨髓、组织匀浆、 培养介质等中将目标细胞分离出来，同时这种分离方法简单快捷。不像在电场， 使用磁分离，由于在静磁场中样品中的离子或带电溶质中不会受到干扰，最重要 的是，和传统的离心或过滤方法分离细胞相比，磁分离细胞的结合和洗提过程很 温和不需要很大剪切力，因此对细胞不会产生破坏：此外，当需要分离大量某种 活细胞时，磁分离技术更易于放大操作，而传统的流式细胞术难以实现这一目的。 利用聚合物微球进行细胞分离的一般过程是：将细胞表面特异性抗体包覆磁 球表面，与细胞原液混合孵育、磁分离，然后用适当方法将目标细胞解离，并将 聚合物微球分离出来，得到纯净的细胞。磁性聚合物微球在应用于细胞分离时， 通过选择表面特异性抗体的不同，既可以用于分离不需要的细胞( 反相分离) ，也 可用于富集所需要的细胞( 正相分离) 。 p o y n t o n 等【7 5 】用含有抗生素蛋白、植物凝结素等配体结合的磁性微球，进行 骨髓中t 细胞的分离，用于白血病的治疗。j o s e p h s o n 7 6 】贝u 将戊二醛活化的硅烷 化磁性微球用于人血中淋巴细胞的分离；b j e r k 用来分离并纯化人血中嗜碱细胞。 r 豇n b a u m 等将磁性聚戊二醛微球标记分离人血红细胞，可分离除去超过9 5 的 未标记细胞。d u r c o v a 使用磁性微球从体细胞分离并纯化干细胞，可以获得纯度 高达8 3 的干细胞。此外，u g e l s t a d 等【| 7 7 】就磁性微球用于细胞分离也作了较详尽 的综述。 2 固定化酶 酶是一种生物蛋白质，作为一种生物催化剂，因其具有高选择性、催化反应 条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业，但天 然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其 难以在工业中更为广泛的应用。因此，酶在大规模生产中，使酶能反复使用，是 很有经济价值的课题。固定化酶的使用，推动了酶在生产上的应用。固定化酶， 即用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可 回收及重复使用的一类技术。用磁性微球作为固定酶载体有以下优点：( 1 ) 可以很 好地保持它的活性和稳定性；( 2 ) 通过磁分离使得体系中酶的回收更加方便，提 高了酶的使用效率；( 3 ) 磁性载体固定化酶放入磁场稳定的流动床反应器中，可 以减少反应体系中的操作，适合大规模连续化生产；( 4 ) 利用外部磁场可以控制 磁性材料固定酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌，提高固定化酶的催化 效率。 k o n d o t 7 8 】等采用两步无皂乳液聚合的方法制备了热敏性磁性聚合物微球，并 进一步采用碳化二亚胺法将胰蛋白酶固定在微球上，实验结果表明，经过这种微 球固定的胰蛋白酶仍具有非常高的活性。国内邱广明等采用改进的乳液聚合制备 了表面带有羧基的磁性聚合物微球，采用碳化二亚胺法在磁性微球表面固定中性 蛋白酶，制备活性高达7 0 0 u g ；缓冲溶液p h = 6 0 、离子强度较高时，固定化酶 的活性最高。邱广亮等研究合成了具有磁响应性聚乙二醇微球，并以此为载体， 固定化旷淀粉酶，在最适条件下，固定化酶的活性达3 4 0 0 0 u g 千胶) ，并且该 固定化酶对酸、碱、热的稳定性大大增强，其操作稳定性也大大增加。b i l k o v a 等利用将半乳糖氧化酶固定在磁性p ( h e m a - c o e d m a ) ，d 一半乳糖激活反应结 果表明固定后氧化酶具有高活性几乎相当于是其本来活性。 3 靶向给药 磁靶向给药系统( m a g n e t i ct a r g e t e dd r u gd e l i v e r ys y s t e m ，m t d d s ) 是近 年来研究的一种新型靶向给药体，在一些疾病治疗特别是恶性肿瘤等重大疾病的 治疗方面具有诱人的应用前景。采用m t d d s 可以降低药物的使用剂量和毒副作 用，提高药物的治疗效率。通常磁靶向给药系统由磁性聚合物微球和药物组成， 药物通过物理吸附、包埋、化学键合等方式结合在微球上。大多数载药磁性微球 是通过大动脉注射给药的，然后在外加磁场作用下定位至病灶部位通过微球的聚 集时产生的栓塞作用以及药物的缓慢释放，从而达到治疗目的。因此m t d d s 在 疾病治疗方面可以大大降低药物的使用剂量和毒副作用，提高药物的治疗效率。 1 9 6 0 年，f r e e m a n 首先报道了将5 - - 1 0 0 n m 的铁晶导入血管系统，在外加磁 场的作用下，磁性铁晶聚集在身体的特定部位。m y a s 等制备了含吲哚美辛的磁 性聚甲基丙烯酸甲酯微球，经动脉或静脉给药后，在大鼠尾部施加磁场，给药 6 0 m i n 后，大鼠尾部的药物浓度比对照组高出6 0 倍。近年来，磁性聚合物微球 作为药物载体用于肝癌治疗受到许多学者广泛兴趣，最早将磁性聚合物应用于临 床试验的是l i i b b e 等【_ 7 9 】，他们使用粒径为1 0 0 n m 的载有表柔比星( 一种抗肿瘤药) 的磁性微球应用于1 4 例晚期实体瘤病人的治疗，结果表明这种给药方式大大降 低了药物的毒副作用，同时实现了在外加磁场作用下微球在靶区的大量积累，然 1 2 而，m r i 观察表明由于粒子尺寸很小以及较弱的顺磁性，很大一部分微球滞留 在肺部。国内张阳德等开展了载阿霉素磁性白蛋白微球的用于治疗肝癌的研究， 研究内容包括磁性阿霉素白蛋白纳米粒在正常肝的磁靶向性、在大鼠体内的分布 及对大鼠移植性肝癌的治疗效果等。结果表明，磁性阿霉素白蛋白纳米粒具有高 效磁靶向性，在大鼠移植肝肿瘤中的聚集明显增加，而且对移植性肿瘤有很好的 疗效。 h i i f e l i 认为，磁性微球应用于动物体内首先微球必须是水性的，即必须是分 散在水中，同时必须满足以下条件8 0 1 ：( 1 ) 载体的骨架物质同在体内能代谢，代 谢产物应无毒性，并在一定时间内排出体外；( 2 ) 微球中所含的不能生物降解的 铁磁性粒粒子直径一般应低于2 0 l a i n ，( 供注用者的粒径应在1 3 1 x r n 以下，其间 保持一定相斥力，不聚集成堆，不堵塞血管。在毛细血管能均匀分布并扩散到靶 区，产生疗效) ；( 3 ) 具有最大的生物相容性和最小的抗原性；( 4 ) 所含铁磁性物 质，在一定强度的体外磁场作用下，在大血管中停留，而在靶区毛细血管中滞留； ( 5 ) 具有运转足够量药物能力，而且有一定的机械强度和生物降解速度。释药速 度适宜，保证在停靶区释放出大量药物。 目前，尽管国内外在磁性聚合物微球方面开展了大量工作，但磁性聚合物微 球用于靶向给药的大多数研究尚处起步阶段。 1 5 本文研究目的及研究内容 本文针对发酵工业关注的如何消除产物对细胞生长代谢的抑制作用、保护发 酵过程中的细胞活性、简化发酵产物的分离操作并降低分离过程能耗、解决因染 菌引起的倒罐损失等问题，以生物相容性优良的天然多糖海藻酸盐、壳聚糖为载 体材料，采用脉冲电场微球制备工艺，制备微尺度固定化细胞载体。工艺特色为： 载体尺寸在微米级范围，传质路径短、比表面积大，在确保载体在发酵系统中 稳定悬浮的基础上，维持载体内细胞与培养环境之间的良好传质状态；载体在 生理条件下制备( 中性、常温、常压) ，无