（应用化学专业论文）基于BODIPY染料的pH和金属离子荧光探针研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 随着生命科学技术的快速发展，多种生物标识方法应运而生。其中，荧光分子探针 是一种重要的标识方法，是现代生物技术和生命科学研究中必不可少的检测手段，已广 泛用于识别和检测生物体的各种物质( 如蛋白质，d n a ，及微量的金属离子，阴离子， 质子，中性分子等) 。 荧光染料性能优劣直接关系到生物标识的性能，b o d i p y ( 氟硼络合- - 咯甲川类) 荧光染料具有优异的光化学光物理性质，例如高的摩尔消光系数、良好的光稳定性、高 的荧光量子产率等优点。因此，基于b o d i p y 类染料的荧光分子探针研究已引起人们越 来越多的关注。 本论文设计合成了五个b o d i p y 类p h 荧光分子探针p s l p s 5 。p s l ( p 辟7 7 1 ) 和 p s 2 ( p 好7 1 1 ) 适用于生理环境的p h 检测；p s 3 ( p k a = 5 0 3 ) 可以应用于检测酸性细胞器 的p h 变化；p s 4 ( p 好2 8 9 ) 和p s 5 ( p k a = 2 3 1 ) 可用于p h 更低的酸性环境。该系列探 针对p h 有高的敏感度，不受金属离子干扰，能专一识别h + ，荧光光谱随p h 的变化可 逆可调。同时，发现增大b o d i p y 染料8 位亚甲基氮原子上取代基可以降低染料的p k a 值，主要是由于该氮原子附近存在的空间张力增加，使得氮原子的质子化变得更困难。 这种通过改变染料上取代基空间位阻，而不是像文献报道的通过改变n 上电子云密度来 调节探针p 墨的方法的发现，为p h 荧光探针的研究开辟了一条新的路径。 基于p e t 原理设计合成了以b o d i p y 为荧光团的金属离子荧光探针m s l 、z s l 和 c s l ，它们在水相或有机相中，分别对h 9 2 十、z n 2 + 、c d 2 + 表现出较好的选择性。其中， m s l 探针在水介质中对h 9 2 + 有良好的专一识别性，在金属离子竞争中几乎不受其它金 属离子干扰；探针z s l 在水介质中对z n 2 + 有较好的选择性：c s l 探针在乙腈中能选择 性识别c d 2 + ，受其它金属离子干扰较小，特别是不受z n 2 + 干扰，为设计专一识别c d 2 + 的荧光探针打下基础。 关键词：荧光；探针；b o d i p y ；p h ；h 9 2 + s t u d yo fb o d i p yf l u o r e s c e n tp r o b e sf o rp ha n dm e t a li o n s a b s 订a c t w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to ft h el i f es c i e n c e s ，m a n yw a y so fb i o m a r k se m e r g e da st h e t i m e sr e q u i r e d m o l e c u l a rf l u o r e s c e n tp r o b ei sa l l i m p o r t a n tw a y ，w h i c hi san e c e s s a r y d e t e c t i o nm e a ni nr e s e a r c ho fm o d e mb i o t e c h n o l o g ya n dl i f es c i e n c e s ，a n di sw i d e l yu s e di n r e c o g n i z i n ga n dd e t e c t i n gt h em a t e r i a l so fo r g a n i s m s ( s u c ha sp r o t e i n ，d n a ，m e t a li o n ，a n i o n ， p r o t o na n dn e u t r a lm o l e c u l a re ta 1 ) t h ep e r f o r m a n c eo ft h eb i o m a r ki s s t r a i g h t l ys u b j e c t e dt ot h ep e r f o r m a n c eo nt h e f l u o r e s c e n td y e s n eb o r o nd i p y r r o m e t h e n e ( b o d i p y ) d y e sh a v ee x c e l l e n tp h o t o p h y s i c sa n d p h o t o c h e m i s t r yp r o p e r t i e ss u c ha sh i g hm o l a re x t i n c t i o nc o e f f i c i e n t ，h i g hs t a b i l i t ya g a i n s t l i g h ta n dc h e m i c a lr e a c t i o n s ，a n dh i g hf l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d s ，e t c t h e r e f o r e ，t h es t u d i e s o nf l u o r e s c e n c em o l e c u l a rp r o b e sb a s e do i lb o d i p yd y e sa r ea t t r a c t i n gm a n yp e o p l e s a t t e n t i o n s p hf l u o r e s c e n tp r o b e sp s l 一p s 5b a s e do nb o d i p yd y e sh a v eb e e nd e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d p s i ( p 如_ 1 7 71 ) a n dp s 2 ( p k a = 7 1 1 ) a m o n gt h e ma r et h en e a r - n e u t r a lp h f l u o r e s c e n tp r o b e s ，p s 3 ( p k a = 5 0 3 ) c o u l db eu s e di nd e t e c t i n gt h ea c i d i cv e s i c l e ，a n dp s 4 ( 嗡- 2 8 9 ) a n dp s 5 ( p k a = 2 31 ) m a yb ep r e p a r e dt od e t e c tt h ec e l lw i t hl o w e rp h 1 1 1 ep r o b e s s h o we x c e l l e n ts e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t yt op h ，a n dt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r u mi sr e v e r s i b l e a tt h es a l t l et i m e ，i tw a sf o u n dt h a tt h ei n c r e a s eo f a l i p h m i cc h a i nl e n g t ha n dt h ei n t r o d u c t i o n o fa r o m a t i cg r o u po nt h en i g o g e na t o ml i n k e dm e t h e n ea ts i t e8o fb o d i p y d y e sc a l lr e d u c e t h ep k ao ft h e m i ti st h em a i nr e a s o nt h a tt h ea f f i n i t yo fap r o t o nt ot h i sn i t r o g e na t o m b e c o m e sq u i t ed i f f i c u l to w i n gt og r e a t e rs t e r i cr e s t r i c t i o n i ti san e wm e t h o df o rt h ed e s i g no f t h i sk i n do fp hf l u o r e s c e n tp r o b e sb yc h a n g i n gt h ev a r i o u ss u b s t i t u t e so nt h en i t r o g e na t o m 1 i n k e dm e t h e n ea ts i t e8o fb o d i p y c o m p o u n d sm s l z s la n d c s ib a s e do nt h ep r i n c i p l eo fp e th a v eb e e nd e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d ，w h i c hd i s p l a yf i n es e l e c t i v i t yt oh g z + ，z n 2 十a n dc d 2 + i nw a t e ro ro r g a n i cm e d i a r e s p e c t i v e l y m sid i s p l a y ss p e c i f i ci d e n t i f i c a t i o nt ot h eh g + i nw a t e rm e d i aw i t h o u tt h e i n f e c t i o no fo t h e rm e t a li o n s ，z s ls h o w sf i n es e l e c t i v i t yt oz n 2 十i nw a t e rm e d i a ；c s ls h o w s f i n es e l e c t i v i t yt oc d 2 + ，a n di ti ss i g n i f i c a n tt h a tc s ic o u l ds e p a r a t et b 【cc d 2 + f r o mz n 2 十 k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n c e ；p r o b e ；b o d i p y ；p h ；h g “ 一工i 一 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：塑鱼赴日期：趁垒纽! ! 亟 大连理工大学硕士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位 论文版权使用规定，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送 交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理 工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也 可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 作者签名：銎暨茗b 聊繇塞埤。 适茇年胃j l 墨 大连理工大学硕士学位论文 l绪论 生命科学技术的发展日新月异，从d n a 双螺旋结构的发现到现在人类基因组计划 的完成，以及已经启动的后基因组计划蛋白质工程，人类正从分子水平认识生命。 对生命的研究就是研究这些物质的活动形式，在人体内起的作用，以及衰变代谢等，这 就要求我们能对其进行准确的检测和识别。在诸多的检测识别方法中，荧光检测灵敏度 高、选择性好、成本低、易操作、适用面广、对亚微粒可以实现可视的亚纳米空间分辨 和亚毫秒时间分辨，是现在研究和应用最多的一种方法。 荧光分子探针( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rp r o b e ) 是在荧光分子识别中经常使用的概念， 当某种物质或体系的某一物理性质发生变化时该分子的荧光信号能发生相应改变的分 子就可称为某一物质或物理性质的荧光分子探针。荧光分子探针是建立在分子识别和荧 光技术两者有机结合的基础上，通过特定的受体结合目标实现分子识别，并随之通过相 应的荧光信号传导机制将这些分子识别到的信息转换为易于检测的荧光信号，从而实现 单分子水平上的原位、实时检测i l 圳。 1 1概述 荧光分子在信息传递过程中，由于受到不同的环境刺激如异构体互变、离子配位、 氧化还原、光电控制的电子能量转移、质子化、弱键的形成与断裂等而发生荧光变化， 可以实现荧光的开、关转换，更适合于生物微观结构的识别和标记，因而近年来荧光分 子作为探针在生命科学、环境科学、材料科学、信息科学等领域得到了广泛的应用。 1 1 1 荧光产生的理论基础 分子中具有不同的能级，电子处于不同的能级中，当光照射到分子上，电子被激发， 由低能级跃迁到高能级。含有处于较高能级电子的分子为激发态分子，不稳定。电子通 过辐射跃迁和非辐射跃迁失去能量返回基态，荧光是处在激发态的分子和原子返回基态 的过程中伴随着放射出来的一种光能。当然也能通过分子内的作用过程使激发态分子失 去活性。受光照射激发的分子，发出的是分子荧光。 荧光产生过程见示意图1 1 。一般来讲，荧光试剂分子为基态，吸收光后，试剂分 子处于电子激发态，基态和激发态都有单重态和三重态两类，多重态用2 s + 1 表示。s 为电子自旋量子数的代数和，其数值为0 或1 。s 为o 时，分子内轨道中的所有电子自 旋配对，自旋方向相反，此时分子处于单重态，大多数有机物分子的基态是处于单重态。 分子吸收光能后，电子跃迁到高能级，电子自旋方向不变，此时分子处于激发单重态。 s o 、s 1 、s 2 、表示分子的基态和第一、第二、激发单重态，能量由低到高。如果处 予基态单重态的有机物分子的电子在跃迁过程中伴随有电子离旋方向的变化，那么在激 发态分子轨道中就有两个自旋不配对的电子，此对s = l ，表明分子处于激发态的三重 态，用t 表示，t l 、t 2 分别表示三重态的第一第二激发态。分子中的电子从基态s o 跃 迁到激发态s l 、s 2 比较容易发生，进行很快( 约1 0 4 s ) ，而从基态单重态到激发态三 重态不易发生。高能量的单重态激发态分子( 如s 2 ) 可以与其它同类分子或溶剂分子碰 撞通过内转换( 无辐射跃迁) 回到激发态的最低能级，这一过程为1 0 q 2 s ，处于激发态 最低能级的分子寿命一般为1 0 4 1 0 堪s ，它们会放出光子返回基态，这时产生的光就是荧 光。即最低激发态( s i ) 分予回到基态( s o ) 会产生荧光。从s l 到t l 能量转化是体系 间跨越。从t l 回到s o 有两种过程，一个是体系间跨越，无能量释放；另一个是放出光 子，即磷光。 2 l e 能量，f 荧光，p 磷光，i s c 体系间跨越，i e 内转换 图1 1 分子荧光的产生过程 f i g ，1 1 t h ep r o c e s so f t h ef l u o r e s c e n t 1 1 2 荧光激发光谱和荧光发射光谱 激发光谱是使激发光豹波长连续变化时，表示菜一荧光强度变化的曲线。测定激发 光谱时，把荧光物质试液置于荧光光度计光路中，固定荧光发射波长和狭缝宽度，扫描 得到荧光激发波长和相应荧光强度的关系曲线，即荧光激发光谱。荧光发射光谱的获得 的过程，类似于激发光谱。固定激发波长和狭缝宽度，扫描得到荧光发射波长和相应荧 光强度的关系蓝线，馨荧光发射光谱。 荧光物质的荧光激发光谱和发射光谱形状相似且成镜像对称。根据荧光产生的原理 不难理解这一现象，荧光光谱所反映的是电子从激发态的最低能级回到基态的情形。一 般请况下，荧光光谱的波长( ) 大于荧光激发波长( k ) ，两者制约斯托克斯位移 一2 一 大连理工大学硕士学位论文 ( k k ) ，斯托克斯位移值越大越有利于选择性。在高温的稀薄气体中，可能发现 相反现象，此时的荧光称反斯托克斯荧光。与激发光相同波长的荧光称为共振荧光。 1 1 3 荧光强度、荧光量子产率和荧光寿命 荧光强度是指在一定条件下仪器所测得荧光物质发射荧光大小的一种量度，荧光物 质所发射的荧光无固定方向，实际上所测量的是某一方向的荧光，它除与物质本身的荧 光量子产率有关，还与介质、环境、仪器性能等因素有关。物质吸收光越多，处于激发 态的分子数越多，发出的荧光强度就越大。 f = 2 3 f i o g r b c 式中：f 为荧光强度；驴f 为荧光量子产率；i o 为照射到被测物质上的光强度；亭为该物 质的摩尔吸光系数；b 为检测池厚度：c 为物质浓度。 荧光量子产率也称为荧光效率，是物质的固有属性，理论上定义为荧光物质吸收光 后所发射的荧光光子数与吸收的激发光光子数之比。在同一浓度下，产率越大，荧光强 度也大。可用下式计算： ( o f t 一6 p f 2 f i a i f 2 幸a 2 = 绺2 木f l 磊b l c l f 2 9 ，2 b 2 c 2 ( 1 2 ) 式中：莎n 多砣分别表示待测物质和参比物质的荧光量子产率；f l ，f 2 分别表示待测物质 和参比物质的积分荧光强度；a l 和a 2 分别表示待侧物质和参比物质在激发波长下的吸 光度。 荧光寿命( r ) 可以用下式计算： hf o hf 。一一t f( 1 。3 ) f 。和f t 分别代表t = 0 和t = f 时的荧光强度，通过实验测量不同时间的f t 值，确定 i 1 1f 。t 关系曲线，其斜率就是荧光寿命。 1 1 4 荧光分子探针识别原理 荧光分子经过特殊设计引入到待测体系中，能够将分子识别的信息转换成荧光信号 传递给外界，从而侵入与分子间的对话成为可能，架起宏观世界和微观世界联系的桥梁， 具有这种功能的分子称之为荧光探针分子。1 5 - 8 1 基于b o d i p y 染料的p h 和金属离子荧光探针研究 e 鲤2 馨 2 签2 2 譬2 堡l i 而商丽嗣 避塑麓謦叫f 卵删隧燃裟整静。一| 口) 两而；i 网 扪一圈l 皤n a l “i 崦m o i e t y r e c o g n i t i o nm o i e t y 莎氇 p h o t o p h y s i c a l i s e l e c t i v i 丁y c h a n g e s r 一- 1c o m p if xs t a b i l i t y 会 c a t i o nc o n t r o lo f p h o t o i n d u c e d 甜o c 蠹扛秘s ： 耐o c l r o nt l r l t r “f e r 确a 0 t r c n s f ( r 0 n 咿目yt 糟n t 甜 e x c t m c wo re x c l 蹦e x f o f 叮日“0 rd i s d 蟊0 r a n c 口 心 众 t i g a n dt o p o l o g y c h a r a c t e r i s t i t s o f t h ec a “o n 5 0 1 v e n t ，p h ： l o n i cs t ，e n 口t h 台 图1 2 识别阳离子的分子探针的主要组成 f i g1 2 m a i na s p e c t so ff l u o r e s c e n tm o l e c u l a rs e n s o rf o rc a t i o nr e c o g n i t i o n 荧光探针一般由一个荧光团连接一个载体组成，以识别阳离子的探针为例如图1 2 ， 在设计这种探针时，识别部分和信号部位都应加以关注。信号部位起着信号发送器的作 用。例如，它将信息( 识别事件) 转换成一个光学信号以发色体的光物理特性的改变表 现出来。作为识别部分，它要求有离子络合的选择性和高效性。这种络合取决于配体的 空间拓扑结构，阳离子本身的性质( 离子的半径、电荷、同位键数目、键能等等) 和溶 剂的性质( p h 值，在水溶液中的离子强度) 。需要注意的是信号部分能直接或经过一 个空间间隔与离子部分连接在一起。甚至在近来的研究中，荧光基团的许多原子可能参 与耦合。因此，对离子络合的选择性往往是由整个结构引起的，包括信号部分与识别部 分。以下是几种常见的荧光分子探针机理： ( 1 ) 光诱导电子转移p e t ( p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ) v j 通常典型的荧光探针由两部分组成，用来识别和绑定客体的受体部分( r e c e p t o r ) 和 发射信号的荧光团部分( f l u o r o p h o r e ) ，中间通过间隔基团( s p a c e r ) 有效地将它们连在 一起。其作用原理如图1 3 所示，当荧光团受光激发后，受体最高占有轨道( h o m o ) 电子便向荧光团的h o m o 转移，使得荧光团的激发态电子不能回到原来的基态，从而 阻止了荧光团的荧光发射，导致荧光淬灭。相反，当受体结合客体后，氧化电位升高， 大连理工大学硕士学位论文 受体的h o m o 能级低于荧光团的h o m o 能级，上述p e t 过程在热力学上变为不可能， 因此荧光得到了恢复。另一种情况则是当受体未结合客体时，并没有发生p e t ，荧光保 持不变，但当受体结合客体后，探针受光激发导致了荧光团到受体部分的电子转移，荧 光被淬灭。 u ：支斗一 u 艄黼f 羹蠹同素鲐番墅体藏光目 圈1 3 p e t 原理 f i g1 3p r i n c i p l eo fp e t ( 2 ) 分子内电荷转移i c t ( i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) 【“ 典型的i c t 荧光分子探针是荧光团上分别连接有强的推电子基和吸电子基，是一个 强的摊一拉电子体系，基f 通常所说的d - a 型分子，共扼体系的供电子部分或者是拉电子 部分是受体的一部分，当分子被光激发后会产生从电子给体向电子受体的电荷转移 ( i c t ) 。在受体与客体结合后，作为受体的供电子部分或拉电子部分的供拉电子能力发生 了改变，整个发色体系的兀电子结构重新分布，形成前后不同的基态，从而导致了吸收 光谱、激发光谱的荧光光谱变化，如发生蓝移或是红移。一般情况下，i c t 荧光探针对 荧光强度的影响不像p e t 荧光探针那样显著。 ( 3 ) 单体激基缔合物( m o n o m e r - e x c i m e r ) 激基缔合物是激发态的荧光母体和基态豹荧光母体相互作用形成的缔合物峰母j 。即 两个以上相同的荧光圈( 主要是多环芳烃) 彼此之间的位置合适，当其中一个发色团被激 发以后就会和另外一个处于基态的发色团形成激基缔合物，其荧光发射光谱的特征表现 是原有的单体的发射峰减弱或者消失，待之而起的是一个新的、强而宽的、长波长的无 结构发射峰。在很多情况下，存在激基缔台物的体系，既能观测到单体的荧光也能观测 茔u 激基缔合物的荧光。易形成激基缔合物的分子一般是芘或蒽之类的具有冗电子平面共 轭的荧光团，同样激基缔合物的发生也需要很近的距离。形成这两种激基复合物的主要 条件是需要激发态分子和基态分子达到碰撞距离( 约3 5a ) ，因此可以通过改变两个 基于b o d i p y 染料的p h 和金属离子荧光探针研蜜 发色团之问的距离来调控荧光的“开”和“关”。这类荧光开关已经广泛的被用于生物 体系来研究核酸、磷脂以及小肽等在生理条件下的构型和活性变化。 在化合物7 中，金属离子与的醚链配位形成类冠醚状，改变了两个芘荧光团的位置， 导致单体和激基复合物荧光发生改变【1 0 】。化合物8 e 1 1 j 是通过酞胺连接了四个萘分子， 在乙睛中以质子化的形式存在并表现出激基缔合物荧光光谱。当络合c d 2 + 或p b 2 + 后，荧 光强度降低。而化合物9 【l2 j 则是第一个利用调控静态及动态缔合物荧光原理设计的氟 离子荧光探针。结构如图1 4 所示。 789 图1 4 基于激基缔合物原理的探针 f 4 ) 荧光共振能量转移( 1 u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) 荧光共振能量转移是指能量给体荧光团( d o n o r ) 的发射光谱和另一个能量受体荧光 团( a c c e p t o r ) 的吸收光谱有一定的重叠，当两个荧光团间的距离合适时( 一般小于 1 0 0 a ) ，就可以可以发生从d 到a 的非辐射能量转移，又称为长距离能量转移。当受 体荧光量子产率为零时，则发生能量转移导致荧光淬灭；如果受体也是一种荧光发射体， 则呈现出受体的荧光。实际上d a 发生能量转移的条件是很苛刻的，两者除了光谱重叠 外，还必须振动能级间的能量差相互适应，距离足够近。在识别过程中如果能改变供体 和受体之间的距离，那么两个波长的荧光强度就会发生变化，从而可以用它们的比值来 表达识别事件。 f r e t 类型荧光分子探针近年来广泛的应用在生物大分子的动态分析中。生物大分 子不仅结构复杂，而且多变。如图1 5 所示，化合物1 0 是一个检测磷酸二酯酶活性的荧 光探针，其能量供体和受体分别是香豆素和荧光素类荧光染料。化合物本身发生能量共 振转移，主要发射荧光素的荧光。当磷酸二酯被磷酸二酯酶水解后，香豆素和荧光素分 大连理工大学硕士学位论文 离，f r e t 停止，以发射香豆素的荧光为主【1 3 】。而化合物1 1 是利用多肽将罗丹明b 和 氨基香豆素相连接。当加入n i 2 + 后，n i 2 + 与氨基酸残基结合，两个荧光团间的距离减小， f r e t 显著。当用激发波长为4 0 9n m 的光激发氨基香豆素时，随着n i 2 + 浓度的增加，在 5 8 3n l n 处罗丹明b 的发射光谱开始逐渐增强【1 4 】。 1 0 图1 5f r e t 荧光探针 f i g1 5 f r e tf l u o r e s c e n tp r o b e 1 2 p h 荧光分子探针的研究进展 p h ( 质子浓度) 的精确测量对化学、生物学研究十分重要【l5 1 。p h 值的测定一般用 玻璃电极，但由于存在电化学干扰、可能的机械损伤等缺陷而不适于活体p h 监测1 1 6 1 。 一些有机化合物的荧光或吸光性质随p h 的变化可用来指示目标介质中酸碱性的改变。 利用荧光探针，通过高分辨的荧光显微技术可以准确地观察分子或离子在空间和时间上 的变化。近年来，人们已经成功报道多种p h 荧光分子探针，p h 荧光探针在分子化学、 生物化学、细胞生物学及药学等学科得到广泛的应用。 s 0 3 h 图1 6p h 荧光探针结构 f i g 1 6 t h es t r u c t u r eo fap hf l u o r e s c e n c tp r o b e 2 0 0 0 年m a r ks b r i g g s 等报道一个基于c y 5 菁染料的p h 荧光分子探针【1 7 】，结构如 图1 6 所示。该探针检测范围在p h6 - 8 ，p k a 值等于7 5 ，未质子化前荧光很弱，结合 一一，一 一后荧光明显增强，表现出较高的敏感性。而且探针的吸收和发射波长均在近红外区， 在细胞及组织环境内不易受到干扰。美中不足的是，虽然质予化后探针的荧光有明显的 增强，但是荧光量子产率依然很低，为应用带来了诸多的不便。 之后p h 荧光探针的报道比较少，一直到2 0 0 4 年x u h o n gq i a n 等合成了一系列基于 奈酰亚胺染料的p h 荧光分子探针h 引，结构如图1 7 所示。其主要是通过形成分子内氢 键来检测p h ，探针在碱性条件下有较强豹荧光，结合矿后有很强的荧光淬灭，表现出 较高的敏感性。通过改变n 原子上的取代基来调节受体的结合能力，得到p k a 值介予 6 4 0 7 5 3 的一系列探针分子。 图1 7p h 荧光探针结构 f i g 。1 7 t h es t r u c t u r eo fp hf l u o r e s c e n c tp r o b e s 2 0 0 4 年j o h nf 。c a l l a n 等报道了双受体双质子化的p h 荧光探锌渊，结构见蚕l 。8 。 该探针的吸收和发射光谱都在可见区，首先苯环上的n h 与矿结合发生i c t ，然后脂 肪链上的n 原子再结合质子发生的是p e t 。在p h 滴定过程中，先后结合两个质子，于 p h6 5 和p h8 5 左右分别出现两个变化平台。 n o n h - n 慨 n n r 2 n o n h - n - , , n m e 2 2 n ， o n h ，n 3 1 a ；r = e t 。n = l l b ；r ，r ：( c h 2 ) 2 0 ( c h 2 ) 2 ，n = l 1c ；r = m e ，n = l l d ；r ，敬= ( c q 2 ) 2 0 e 秘2 ) 2 n = 2 1 e ；r = e t n = 2 图1 8 嘲荧光探针结构 f i g 1 8 t h es t r u c t u r eo fp hf l u o r e s c e n c tp r o b e s 一8 一 鬟一 哑 大连理工大学硕士学位论文 w a n g 等在2 0 0 5 年也合成了一个双质子化的p h 荧光探针【2 0 1 ，结构如图1 9 所示。 所不同的是该探针是用比例法检测p h 变化的，它基于一个开一关开的机理，在中性条 件下探针的最大发射波长为4 0 9n l t l ，随着p h 的降低荧光逐渐淬灭，然而当p h 降低到 4 0 时，突然在3 7 5i l m 和5 2 0n m 处出现两个新的峰，利用两个位置荧光强度的比例变 化可以检测p h 的变化。它不仅可用来检测酸度，同时还可以用来检测吡啶盐阳离子。 n | 。 n | 图1 9 p h 荧光探针结构 f i g 1 9 t h es t r u c t u r eo fap hf l u o r e s c e n c tp r o b e 其实，早在2 0 0 4 年s a n d r i n ec h a r i e r 等就报道了用比例方法检测的p h 探针【2 l 】，结 构如图1 1 0 所示。该探针不仅可以用单光子激发，还可以用双光子激发，当用单光子激 发( 3 3 9n m ) 时，检测范围在p h3 5 6 5 ，用双光子激发( 7 1 2n m ) 时，监测范围在p h 4 5 7 5 ，并且较早地将双光子染料用到了水介质中，为双光子染料在p h 探针中的应用 奠定了基础。 m e 0 n h 2 图1 1 0 双光子p h 荧光探针 f i g 1 10 t h es t r u c t u r eo fat w o p h o t of l u o r e s c e n c tp r o b ef o rp h 2 0 0 5 年v i h o f i af v a l u k 报道了一个宽范围的p h 荧光探针【2 2 1 ，结构如图1 11 所示。 探针基于黄酮醇结构，荧光光谱和吸收光谱在2 - 1 2 范围内对p h 都有很敏感的响应。染 料的最大发射波长在p h2 时为5 0 9n m ，随着p h 增大到9 最大发射波长红移到了5 2 7n m ， 而p h 进一步的增大可使最大发射波长红移到5 3 5 i l m 。 一9 一 一h h 3 c 三 b o d i p y 染料性能良好，一直倍受青睐，在探针中也得到很好的应用。c e r e nn b a k i 以b o d i p y 为母体设计合成一个可以在近中性环境中对p h 敏感的荧光探针【2 3 1 ，该探针 以杯芳烃为接受质子的受体，在p h8 2 - - 5 6 范围内有2 3 荧光强度变化，在近中性环境 中，非常微小的p h 变化就会从荧光发射中灵敏的检测出来。结构如图所示： o h 0 h 1 ：r i = h r 2 = h 石 2 ：r 1 - - - h r 2 = c h 3 3 ：r 1 - h r 2 = c i 4 ：r 1 = h r 2 = p - m e o p h - 5 ：r 1 = c i r 2 = c h 3 图1 1 2 基于b o d i p y 染料的p h 探针 f i g 1 1 2 t h es t r u c t u r eo f b o d i p y - b a s e dp r o b e sf o rp h 2 0 0 5 年又有新的突破，m u k u l e s hb a r u a h 合成了一系列b o d i p y 类p h 荧光探针【2 4 】， 结构如图1 1 2 所示。该系列探针以b o d i p y 荧光染料为荧光团，选择酚类做为识别基 大连理工大学硕士学位论文 团。文中通过改变染料不同位置上的取代基，影响酚羟基上的电子云密度，达到调节p 岛 值的目的，得到陇值介于7 5 9 3 的七个p h i 荧光探针。但是，酚类化合物的化学稳定 性不好，在空气中容易被氧化变质，这使该系列探针的应用受到很大的限制。 氨类化合物的化学稳定性要比酚类好得多，2 0 0 5 年彭孝军研究组设计合成了一个 b o d i p y 类p h 荧光探针j ，该探针具有很好的化学稳定性，检测范围为p h7 6 9 4 ， 荧光强度随p h 变化1 5 倍之多，而且有很好的水溶性，结构如下图： 图1 ，1 3 基于b o d i p y 染料的p h 探针 f i g 1 13 t h es t r u c t u r eo fab o d i p y b a s e dp r o b ef o rp h 在已经报道的p h 荧光探针中，检测范围主要是集中在中性或近中性条件，对酸性 条件p h 荧光探针的研究非常少。直到2 0 0 5 年，f r a n c i s c og a l i n d o 等提出在酸性细胞器 内应用p h 探针1 2 削。该荧光分子以蒽为荧光团，基于p e t 识别机理，通过改变碳链的长 度来调节p 值，得到p 凰值介于5 5 5 的一系列分子探针，使得p h 荧光探针的检测不 再局限于中性条件或近中性条件，可以达到酸性范围，为p h 荧光探针在生物化学、分 子生物学等领域的应用，开辟出了一条新的道路。结构如图1 1 4 所示。 n 图1 1 4 p h 荧光探针结构 f i g 1 14 t h es t r u c t u r eo fp hf l u o r e s c e n c tp r o b e s 之后人们对酸性p h 荧光探针的研究减少，而更关注于传统染料的应用。2 0 0 6 年 n o e l lb o e n s 等报道一个荧光素类p h 荧光探针团】，结构如罄l 。1 5 所示，该探针分子吸 收和发射都在可见光区，p g 值为7 。8 7 ，可用于生理环境的检测。 a n n as v a s y l e v s k a 等报道了一系列香豆素p h 荧光探针1 2 引，探针检测范围也是近 中性环境，荸| 入注意的是该探针能适用于高强度光照条件，有很好的耐光性，这是很多 染料不能做到的，并且该探针可以结合到聚合物上表面作为膜探针使用。结构女爨图所示： 一 6 一乳：c h l l u u 一o 2 c 一0 一。 育 图1 1 5p h 荧光探针的结构 f i g 。1 1 5 t h es t r u c t u r eo f p hf l u o r e s c e n tp r o b e s h 众所周知，正常的核苷荧光是很弱的，不适用于作为荧光探针来应用。但是2 0 0 6 年k e w e nm s u n 等将核酸碱基用于p h 荧光探针i ：和 2 9 1 ，结构如图1 1 6 所示。该探针由 湮石酸和嘌吟组成，p k , 值与掇道的苯酚类探针相近，在8 0 左右。虽然正常的核瞢荧 光是很弱的，但是与苯酚结合后，荧光量子产率可达到o 。5 6 ，当p h 从中性调到碱性条 件后，荧光有明显的淬灭。遗憾的是该系列探针仍然是选择酚类作为识别基团，不稳定 的化学性质阻碍了应用。 一龟或 l ：r - 3 = r - h 2 r t i 麓 ：袁鑫 图1 1 6 p h 荧光探针的结构 f i g 。l 。1 6 t h es t r u c t u r eo f p hf l u o r e s c e n tp r o b e s 大连理工大学硕士学位论文 在p h 荧光探针的研究中，用到了各种染料母体，但是对金属配合物荧光团的选择 较少，而稀土金属配合物早就在其它荧光探针中得到了广泛的应用。真正将稀土金属配 合物应用到p h 荧光探针中的是r o b e r tp a l 等，他们在2 0 0 7 年报道了基于铕配合物的比 率p h 荧光探针，探针可检测的p h 范围在6 8 之间，并且在荧光显微灯下观测到了 细胞内的荧光成像。结构如图1 1 7 所示。 m e 0 2 s h n 图】1 7p h 荧光探针的结构 f i g 1 ，17 t h es t r u c t u r eo fp hf l u o r e s c e n tp r o b e s 虽然2 0 0 5 年f r a n c i s c og a l i n d o 等就报道了p h 荧光探针在酸性条件的应用，但当时 并没有引起人们太多的重视，其后几年内研究进展缓慢。直到2 0 0 8 年h w a nm y u n gk i m 等设计了双光子的p h 荧光探针p ，并应用到酸性细胞器中，才再次引起人们的关注。 该探针在7 8 0 n m 处激发，避开了细胞内自干扰和光漂白等问题。探针的p k a 值最低可以 达到4 5 以下，并且很容易做到在细胞和组织内荧光成像，是一个性能优异的p h 荧光 探针。为p h 荧光探针的研究和发展做出了重大的贡献。结构如图所示： h h ：三巧n 矿l i i r = h r = 0 m e o h v n 矿r 图1 1 8p h 荧光探针的结构 f i g 1 18 t h es t r u c t u r eo fp hf l u o r e s c e n tp r o b e s o 1 3金属离子荧光分子探针的研究进展 对金属离子探针的研究早在2 0 世纪七八十年代就开始，已经报道的探针分子成百 上千，在此不一一累诉，本文着重介绍一下b o d i p y 类金属离子荧光探针的研究进展。 b o d i p y 荧光染料与其它荧光染料相比具有稳定，量子产率高等优点，这使它代替了许 多翠期的荧光染料而应用在生物和化学分析方面。遮包括利用b o d i p y 荧光染料合成形 形色色的金属离子荧光分子探针。 19 9 8 年，m a t t h i a sk o l l m a n n s b e r g e r 和j 6 r gd a u b 等人以带有单氮杂冠醚的苯甲醛 为原料合成了带有冠醚识剐基团的氟硼荧类染料的首个分子探针1 3 2 】，同时合成了两个相 关的氟硼荧染料，对他们的荧光特性加以对比。该分子探针对于m 9 2 + 的识别能力相对 较强，探针系统加入镁离子后可以使整个检测溶液的荧光增大被数超过1 0 0 0 倍，荧光 寿命也相应的变长。探针的分子结构见图1 1 9 所示。 图9 碱土金属和重金属离子探针分子结构 f i g 1 i9 s t r u c t u r eo ft w op r o b e sf o ra l k a l i - e a r t ha n dh e a v ym e t a li o n s 2 0 0 0 年，k n u tr u r a c k 和j 6 r gd a u b 等人又合成了带有单氮杂的硫藉醚氟硼荧分子 探针【3 3 1 。主要目的是利用硫冠醚对重金属离子很好的识别作用来进行重金属离子的荧光 检测。监测的结果证明该探针在乙腈溶液里对重金属离子有很好的选择性，对a g 十具有 很强的响应，使检测溶液的荧光增强，荧光量子产率明显提高，从底物的o 0 0 0 1 升高至 0 2 2 。该探针对h 孑和c 矿也有荧光增强的作用，= 己其是对h 9 2 + 的响应最为强烈， 荧光量子产率升高至o 5 9 。而以前报道的许多阳离子荧光探针的荧光大多都能被h g z + 和c u 2 + 淬灭，而不是像该探针会使荧光增强。探针的结构如图1 1 9 所示。 锌离子是人体内含量第二多的金属离子，仅次于铁，在任何细胞内都有锌离子的 存在，它对人体起蓍很重要的作用。目前锌离子探针很多 3 枷1 ，下面分别予以介绍： 大连理工大学硕士学位论文 2 0 0 2 年，b i l g et u r f a n 和e n g i nu 。a k k a y a 等入合成了一个z n 2 + 探针【4 l j ，探针结 构中以2 ，2 。联毗啶做为z n 2 + 的识别基团，每一个毗啶上连有一个氟硼荧染料，分子设 计的最终识别方式和上两个例子恰好相反，这个探针体系对z n 2 + 的作用是使探针的荧光 极大的淬灭，原因