（生物物理学专业论文）耐辐射球菌recq及相关基因的生化和突变分析.pdf

耐辐射球菌r e c q 及相关基因的生化和突变分析 论文作者签名： 指导教师签名： 论文评阅人1 ： 评阅人2 ： 评阅人3 ： 评阅人4 ： 评阅人5 ： 答辩委员会主席：周雪垩数援逝匹太堂壅堂医 委员1 ：昱筮教援浙江太堂生金抖堂院 委员2 ：拯卫至数援逝江太堂生金型堂院 委员3 ：吐麽宜数拯逝婆盔堂壅堂院 委员4 ：盒亟松圭廷医! ! 巫堑江太堂匡堂瞳 委员5 ：堡题迸麴援浙鎏太堂壅堂暄 答辩日期：2 0 1 0 0 6 0 5 bi o c h e m i c a lc h ar a c t e r i z a t i o n r e c qa n di t sr e l a t e dg e n ei n a n dm u t a t i o n a la n a l y s i so f d e i n c o c c u sr a d i o d u r a n s a u t h o r ss i g n a t u r e ： 一 s u p e r v i s o r 7 ss i g n a t u r e ： e x t e r n a lr e v i e w e r s ：! f 选q 毅蛩! q 望墨曼y i 曼巡曼! e x a m i n i n gc o m m i t t e ec h a i r p e r s o n ： x u e p i n gz h o u , p r o f e s s o r , c o l l e g eo f a g r i c u l t u r e & b i o t e c h n o l o g y , z h e ji a n gu n i v e r s i t y 。 e x a m i n i n gc o m m i t t e em e m b e r s ： q ! ! 曼g 曼q l i 鱼i 曼n 鳇& 圣b 自i 垫g 堕坠i y 曼墨i 鲤 q ! ! 曼g 曼q l i 鱼墼缝n 盟垒圣b 自i 垫g 堕匹y 曼望i 鲤 q i n g f uy e , p r o f e s s o r , c o l l e g eo f a g r i c u l t u r e & b i o t e c h n o l o g y , z h e j i a n gu n i v e r s i t y 墨坌h q q ! q 丛曼垒i 曼i n 曼，圣h 自i 垒n g 型垒i y 曼墨i ! y y u e j i nh u a , p r o f e s s o r , c o l l e g eo f a g r i c u l t u r e & b i o t e c h n o l o g y , z h e j i a n gu n i v e r s i t y d a t eo f o r a ld e f e n c e ： 坠n5 ，2 q ! q 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝婆苤堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝耋三盘堂 有权保留并向国家有关部门或 机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权丝 盍生可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月日签字日期： 年月日 致谢 本论文是在导师华跃进教授悉心指导和亲切关怀下完成的。导师渊博的 学识和把握学科前沿的洞察力、严谨的治学态度、以诚待人的品格和宽广的 胸怀、献身科学的精神均使我终身受益。值此论文完成之际，谨向华老师表 示最真诚的感谢和最崇高的敬意! 感谢浙江大学原子核农业研究所陈子元院士、徐步进教授、叶庆富教授、 傅俊杰副教授、田兵副教授、王梁燕助理研究员、陆辉明助理研究员、许光 治助理研究员等老师给予的关心和指点! 感谢浙江大学农学院平台实验室张 宪银老师热心指导和无私帮助。 进实验室五年来，我得到了许多师兄、师姐的亲切关怀和热心帮助。在 此特别要感谢师姐黄丽芬博士。在实验期间，师姐黄丽芬博士在实验上给了 我热情的帮助和耐心的指导，每当遇到问题时总是细致回答，使我在最大程 度得锻炼了分子生物学的实验基本技能。此外还要特别感谢王超硕士和汪虎 博士在生活和实验中给予的诸多无私的帮助。在此向你们表示深深的谢意! 在实验五年中，我深刻体会到了在一个团结上进富有创新精神的实验室 是多么幸运的事情，相信这将为我今后的工作提供良好的基础。在此感谢胡 沂淮博士、应南娇博士、尹龙飞博士、孙宗涛博士、徐虹博士、赵烨博士， 范陆硕士、马辰宇硕士、沈绍传博士、焦建东博士、李铭峰博士等同学在生 活和实验过程中给予的诸多帮助! 最后，我要感谢的是我的父母，或许是大恩不言谢，如果没有他们的支 持，很难想象我还会坐在实验室里，写着致谢。只是希望，远在它方的父母 能够平平安安，健健康康。 华孝挺于华家池 2 0 】0 3 - 2 5 项目支持 本研究为国家重点基础研究发展计划( 课题编号： 2 0 0 4 c b 7 19 6 0 4 ) 、国家高技术研究发展项目 ( 2 0 0 7 a a 0 2 1 3 0 5 ) 、国家自然科学基金重点项目( 批准号： 3 0 8 3 0 0 0 6 ) 和农业部专项“核技术农业应用 ( 批准号： 2 0 0 8 0 3 0 3 4 ) 资助项目。 a c k n o w l e dg e m e n ts t h i sw o r kw a s p 1 = , r t e db yg r a n tf r o mt h en a t i o n a lbasicillsw o r l ( w a ss u p p o r t e d ag r a n to mt i l e _ i na t l o n al j a s l c i r e s e a r c hp r o g r a mo fc h i n a ( 2 0 0 4c b19 6 0 4 ) ；ag r a n tf r o m t h en a t i o n a lh i t e c h d e v e l o p m e n tp r o g r a m ( 2 0 0 7 a a 0 2 13 0 5 ) ；ak e yp r o j e c tf r o mt h en a t i o n a ln a t u r a l s c i e n c ef o u n d a t i o no fc h i n a ( 3 0 8 3 0 0 0 6 ) ；a n dt h ep r o j e c t a p p l i c a t i o no f n u c l e a rt e c h n i q u e si na g r i c u l t u r e f r o mt h e c h i n e s em i n i s t r yo f a g r i c u l t u r e ( 2 0 0 8 0 3 0 3 4 ) t oy j h 浙江大学博士学位论文 摘要 摘要 耐辐射球菌能在电离紫外辐射、化学毒剂、热、干燥等极端环境下存活。 这得益于它不同寻常的d n a 修复能力，特别是对电离辐射导致的双链断裂的 重组修复。这种难以置信的d n a 修复能力令dr a d i o d u r a n s 成为很好的模式 生物。尽管如此，该细菌的修复机理至今仍知之甚少，需要进一步研究。 r e c q 家族的d n a 解旋酶对基因组稳定性的维持起到必要的作用。耐辐 射球菌中的r e c q 是r e c q 家族中特别的一员，不同于其他物种来源r e c q 的 是，它在c 端有着三个串联h r d c 结构域。而与r e e q 蛋白互作的单链d n a 结合蛋白( s s b ) 在所有的d n a 代谢进程中非常重要，包括d n a 复制，重 组和修复。与其他细菌s s b 蛋白均以同源四聚体行使功能不同，耐辐射球菌 s s b 是同源二聚体的，每个单体含有两个o bf o l d 。本文主要系统研究耐辐射 球菌r e c q 和s s b 蛋白的生化活性及突变分析系统分析。具体结果如下： 1 首先构建了r e c q 突变株。r e c q 突变株对辐照、u v 、过氧化氢和丝 裂霉素c 均非常敏感。通过补偿突变株以r e c q 的不同部分，发现解旋酶和 三个h r d c 结构域对d n a 损伤抗性均为不可缺少。解旋酶结构域对解旋酶 活性和a t p 酶活性均为必需，而三个串联h r d c 结构域则促进了这些活性。 2 基于其晶体结构构建四个s s b 截断突变体。凝胶过滤结果表明d r s s b 、 d s c t 和d s c c 是同源二聚体，而d s n 和d s n c 是单体。这支持了n 端在 二聚体形成过程中起主要作用的假设。我们使用e m s a 和f r e t 对每个o b f o l d 在d n a 结合中的作用进行了探索。 3 在u v s eu v r a lu v r a 2 的基础上，敲除t r e c q 构建了四突变株。用 r p o b i p d f 系统测量了野生株、突变株r e c q ( m q ) 、u v s eu v r a lu v r a 2 ( t n k 0 0 6 ) ， 和u v s eu v r a lu v r a 2r e c q ( t q ) 的突变频率和突变率。然后分离r i f 的突变体， 并对，p 胡基因进行了测序。结果表明，r e c q 通过与u v s eu v r a lu v r a 2 的互作参 与了紫外损伤修复途径。 4 测定在不同利福平浓度下( 从5 到5 0l a g m l 的浓度梯度) 的突变率。 t g m l 和 仅表现在 辐射球菌 突变是如 何通过调控其他基因转录来改变生长速度的。可从这些结果中分析b 亚基中 突变是如何调控其他基因转录的分子机制。 综上所述，r e c q 解旋酶的三个h r d c 结构域不仅对d n a 损伤抗性不可 缺少，对解旋酶和a t p a s e 活性也很重要。其互作蛋白s s b 的s s d n a 结合活 性需要两个o bf o l d 的互作。突变分析系统的研究表明了r e c q 与紫外损伤修 复系统的互作关系。耐辐射球菌突变的利福平浓度依赖效应，不仅表现在突 变率上，也表现在突变谱上。芯片分析则展示了1 3 亚基中突变是如何调控其 他基因转录。 关键词耐辐射球菌；r e e q ；s s b ；突变率；突变谱；，p 柏 s p e c i a lm e m b e ro fr e c qf a m i l yw i n lu n i q u ea r r a n g e m e n to ft h r e et a n d e mh r d c d o m a i n si nt h ec - t e r m i n u s m o r e o v e r , s i n g l es t r a n d e db i n d i n gp r o t e i n ( ss b ) t h a t i n t e r a c t e dw i t hr e c qp l a y sc r u c i a li na l lk i n do fd n am e t a b o l i cp r o c e s s e si n c l u d e i n g d n a r e p l i c a t i o n , r e c o m b i n a t i o na n dr e p a i r i nc o n t r a s tt oo t h e rb a c t e r i a ls s bp r o t e i n s ， w h i c ha r ef u n c t i o n a l l ya c t i v ei nh o m o t e t r a m e r s ，d e i n o c o c c u ss s b l i k ep r o t e i n sa r e h o m o d i m e r si nn a t u r ea n dc o n t a i nt w oo bf o l dp e rm o n o m e r i nt h i ss t u d y , w e i n v e s t i g a t e db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o na n dm u t a t i o n a lp a t t e r no fr e c qa n d i t s r e l a t e dg e n ei nd r a d i o d u r a n s t h er e s u l t sw e r el i s t e da sb e l o w ： 1 r e c qm u t a n tw a sc o n s t r u c t e da tf i r s t ad r l 2 8 9m u t a n ti sh y p e r s e n s i t i v et o y - i r r a d i a t i o n , u vh 2 0 2a n dm i t o m y c i nc b yc o m p l e m e n t i n gt h ed r l 2 8 9m u t a n tw i t l l v a r i o u sd o m a i n so f d r l 2 8 9i nv i v o ，w eh a v ed e t e r m i n e dt h a tt h eh e l i c a s ea n da l lt h r e e h r d cd o m a i n sa r ei n d i s p e n s a b l ef o rc o m p l e t ed n ad a m a g er e s i s t a n c e w ea l s o f o u n dt h a tt h eh e l i c a s ed o m a i ni sn e c e s s a r yf o rt h eu n w i n d i n ga n da t p a s ea c t i v i t y , a n dt h et h r e et a n d e mh r d cd o m a i n si n c r e a s et h ee f f i c i e n c yo ft h e s ea c t i v i t i e s 2 f o u rt r u n c a t e dv a r i a n t so fd r s s bp r o t e i n sw e r eg e n e r a t e db a s e do nt h e i r c r y s t a l s t r u c t u r e s g e lf i l t r a t i o ns h o w e dt h a td r s s b ，d s c ta n dd s c cw e r e h o m o d i m e r s ，a n dd s na n dd s n cw e r em o n o m e r s t h eg e l f i l t r a t i o na n a l y s i s s u p p o r t e dt h eh y p o t h e s i st h a tt h en t e r m i n a ld o m a i np l a y e dap r e d o m i n a n tr o l ei n a l m e r l s a t l o n b 1 0 c h e r o i c a lc h a r a c t e r i z a t i o nw a su s e dt od e t e r m i n e t h er o l eo fe a c h0 b f o l dmd n ab i n d i n g , b y e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f t a s s a y ( e m s a ) a n d n u o 陀e n c er e s o n a n c e e n e r g yt r a n s f e ra n a l y s i s ( f r e t ) q a 士0 u r - g e n em u r a n ts t r a i nw a sc r e a t e db yc o n s t r u c t i n gr e c qk n o c k o u t m u t a n t 1 n 。删，删r a 2 - a n du v s ek n o c k o u tb a c k g r o u n d s u s i n gt h e 印腓i f r s y s t e m ，w e m e a s u r e dt h em u t a t i o nf i e q u e n c i e sa n dr a t e si nw i l d t y p e ，您c q ( m q ) ，u v s el 册啊j u v r a 2 ( t n k 0 0 6 ) ，a n du v s eu v r a1u v r a 2r e c q ( t q ) w et h e ni s o l a t e dr i fm 咖t s o f m e s es 仃a l n 5a n d8 。q u e n c e dt h er p o b g e n e t h er e s u l t si n d i c a t et h a t 膨c ai si n v 0 1 v e d mt h eu l t r a v l o l e td a m a g e r e p a i rp a t h w a yv i at h ei n t e r a c t i o nb e 帆e n 坨c q a n du v r a j 。 u v r a 2 ，a n du v s ei nd 砒幽阳凇 5 t h em u t a t i o nf r e q u e n c i e sa n dr a t e so fd r a d i d 如嗍w e r em e 嬲眦d a ta w i d ec o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m5t o5 0 i t g m lo fr i f a m p i n w ef o u n dt h a tt h em u t a t i o n r a t e0 ft 1 1 eb a c t e r i 啪i nt h ep r e s e n c eo f 5i - t g m lo fr i f a m p i nw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nmt h e p r e s e n c eo f2 5 g t g m la n d5 0 p g m l r i f a m p i n 黜f ；u n p i n h a d c o n c e n 仃a t i o n - d e n p e n d e n te f f e c tn o to n l yo nt h em u t a t i o nr a t e ，b u t a j s oo nt h e m u t a t i o ns p e c t r u m i t i s s p e c u l a t e dt h a t s u b s t i t u t i o nm u t a t i o na tl o wc o n c e n 仃a t i o n o x i d a t i v eb a s ed a m a g e d r a d i o d u r a n sm a i n l yp r e v e n t s b a s e o fr i f a m p i n ，s i n c er o si n d u c e dm a i n l y 6 d n a m i c r o a r r a y sa n db i o c h e m i c a la s s a y sw e r eu s e dt oi d e n t i f yt h em o l e c u l a r d e t a l l so fh o wt h er i fm u t a t i o ni nt h e1 3 - s u b u n i tl e dt o c h a n g e si ng r o w t hr a t cv i a 引t e r e dr e g u l a t l o no fm u l t i p l e g e n e si nnr a d i o d u r a n s - n l cr e s u l t s p r o v i d e da m o l e c u l a r1 n s l g h “n t ot h em e c h a n i s mo f r i fm u t a t i o ni nt h e 肛s u b u n i t0 n a l t e r i n 2t h e r e g u l a t i o no fm u l t i p l eg e n e s t a k e nt o g e t h e r ，t h et h r e eh r d c d o m a i n so fr e c qh e l i c a s ei si m p o r a n tn o to n i v f o rr a d l a t l o nr e s i s t a n c e ，b u ta l s of o rh e l i c a s e a c t i v i t ya n da t p a s ea c t i v i 锣o fr e c o s s bt h a tm t e r a c t e d w i t hr e c qn e e d e dt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nt w 0o bf o l d s m u t a t l o n a l 锄a i y s i ss u g g e s t e dt h a t 地c qi si n v o l v e di nt h eu l t r a v i o l e td 锄a g er e p a i r p a t h w a y r 1 胁p i nh a dc o n c e n t r a t i o n - d e n p e n d e n te f f e c tn o t o n l yo nt h em u t a t i o nr a t e b u ta j s oo nt h em u t a t i o n s p e c t r u mi nd r a d i o d u r a n a n em i c r 0 删r e s u l t s p r o v i d e d a 嘲曲2i n t 0t h em e c h a n i s mt h a tr i fm u t a t i o ni n ps u b u n i ta r e rt h er e g u l a t i o n0 f a b s t r a c t 目录 致谢 摘要 目录 j i 1 i i la b s t r a c t 第l 章文献综述l 1 1 耐辐射球菌研究进展l 1 1 1 形态特征1 1 1 2 名称起源1 1 1 3 基因组测序3 1 1 4 耐辐射球菌的d n a 损伤抗性一3 1 2 突变分析研究进展1 2 1 2 1 检测突变子1 2 1 1 2 2 突变率和突变谱测定1 3 1 3 参考文献：1 5 第2 章耐辐射球菌r e c q 蛋白的体外活性研究 2 1 引言2 6 2 2 材料与方法2 8 2 2 1 菌种，质粒和培养基2 8 2 2 2r e e q 突变株的构建一2 8 2 z 3d r l 2 8 9 补偿质粒的构建2 9 2 2 4m q 和m q l - 5 的表型实验2 9 2 2 5w e s t e r nb l o t 分析3 0 2 2 6 表达质粒构建和蛋白纯化3 0 2 2 7 解螺旋酶( h e l i c a s e ) 活性测试3 0 2 2 8a t p a s e 活性测试实验一3 1 2 3 结果一3 l 2 3 1m q 及补偿株的表型3 l 2 3 2d r l 2 8 9 解旋酶活性的生化分析3 3 2 3 3h r d c 结构域截短体和d r a d i o d u r a n ss s b 蛋白对d r l 2 8 9 解旋酶活性的作用一3 6 2 3 4h r d c 结构域也提高d r l 2 8 9 的依赖于d n a 的a t p a s e 活性3 8 2 4 讨论3 8 2 5 小结4 0 2 6 参考文献一4 l 第3 章耐辐射球菌单链结合蛋白及截短体的生化分析 3 1 引言4 5 3 2 材料与方法一4 6 3 2 1 菌种，培养基和抗生素4 6 3 2 2d r a d i o d u r a n ss s b 蛋白及其截短体的表达和纯化4 6 3 2 - 3 凝胶过滤法测定d r s s b 及其截短体的自然分子量一4 6 3 2 4 蛋白序列分析4 7 3 2 5 用于凝胶迁移滞后实验( e m s a ) 和荧光共振能量转移( f r m 3 的寡聚核苷酸4 7 3 2 6e m s a 4 8 目录 3 2 7f r e 汀4 8 3 3 结果4 9 3 3 1d r s s b 及截短体的表达纯化和比对4 9 3 3 2d r s s b 及截短体的亚基组织4 9 3 3 33 - o v e r h a n g ，5 - o v e r h a n g 和钝端双链d n a 底物的e m s a 实验一4 9 3 3 4 使用f r e t 检测s s d n a 结合活性5 3 3 3 5 单链d n a 长链的e m s a 实验5 3 3 3 6 气泡结构的e m s a 实验5 6 3 4 讨论5 6 3 5 小结一5 8 3 6 参考文献5 9 第4 章耐辐射球菌r e c q 参与紫外损伤修复途径 4 1 引言6 2 4 2 材料与方法。6 3 4 2 1 菌株与质粒6 3 4 2 2 突变株构建6 4 4 2 3 突变率的测定“ 4 2 4d n a 分离和测序6 4 4 3 结果与分析一6 5 4 3 1 突变频率和突变率6 5 4 3 2 四个菌种中利福平抗性突变位点分布6 6 4 3 3 野生株中的自发突变6 6 4 3 4d r a d i o d u r a n s 突变株的自发突变热点一6 7 4 3 5 印胡中菌种特异性的突变热点6 8 4 4 讨论6 8 4 5 小结7 1 4 6 参考文献7 1 第5 章不同利福平浓度下耐辐射球菌的自发突变率与突变谱研究 7 5 5 1 引言一7 5 5 2 材料与方法一7 6 5 2 1 菌种，培养基，和抗生素7 6 5 2 2 突变频率和突变率的测定7 6 5 2 3d n a 的分离和测序7 6 5 2 4 耐辐射球菌最小抑菌浓度( m i c ) 的测定7 6 5 3 结果与分析7 7 5 3 1 突变频率和突变速率7 7 5 3 2 不同利福平浓度下的黜f 突变位点分析7 7 5 3 - 3r p o b 的利福平浓度特异性突变热点7 9 5 3 4 耐辐射球菌野生株和黜f 突变株的m i c 值的测定7 9 5 4 讨论8 0 5 5 小结8 3 5 6 参考文献8 3 第6 章耐辐射球菌印谚在基因调控中的作用 6 1 引言8 6 6 2 材料与方法8 7 n 浙江大学博士学位论文目录 6 2 1 菌种，培养基和抗生素8 7 6 2 2 生长特性测定8 7 6 2 3r n a 提取，探针制备，芯片杂交和数据分析8 7 6 2 4 实时定量p c r 8 8 6 2 5m o t i f 分析8 8 6 2 6 体内活性氧( r o s ) 水平测定8 8 6 3 结果一8 9 6 3 1 突变株生长较野生株迟缓8 9 6 3 29 b p d e l e t i o n 伊以突变株的表达谱与野生株差异较大9 0 6 4 讨论9 6 6 5 小结一9 8 6 6 参考文献9 8 个人简历 学位期间发表的学术论文( 含待发表) i i i 1 0 4 1 0 6 d y e d i s p l a c e m e n th e l i c a s ea s s a y 3 5 图7 ：t h ef l u o r e s c e n c ed y e d i s p l a c e m e n th e l i c a s ea c t i v i t i e so fd r l 2 8 9 m u t a n t s 3 6 图8 ：d n a d e p e n d e n ta t p a s ea c t i v i t yo f d r l 2 8 9v a r i a n t s 3 8 图9 ：s c h e m a t i c ，a l i g n m e n ta n ds d s p a g ei d e n t i f i c a t i o n o fv a r i o u s c o n s t r u c t so f d r s s b ! ；( ) 图1 0 ：g e lf i l t r a t i o na n a l y s i so f d r s s bp r o t e i n sa n di t sv a r i a n t s 5 1 图1 1 ：e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y s 5 2 图1 2 ：e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y s 5 3 图13 ：a d n ac o n s t r u c tu s e df o rf l u o r e s c e n c em e a s u r e m e n t s 5 4 图1 4 ：e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y s 5 5 图1 5 ：e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y s 5 6 图16 ：c o n s t r u c t i o na n dv e r i f i c a t i o no fd r a d i o d u r a n su v r a1u v r a 2u v s e r e c qf o u r - k n o c k o u tm u t a n t 6 5 图17 ：c o m p a r i s o no fr e l a t i v em u t a t i o nf r e q u e n c i e so b s e r v e da ts p e c i f i cs i t e s i n 甲卯6 8 图18 ：c o m p a r i s o no ft h ep e r c e n t a g eo ft r a n s i t i o n sa n dt r a n v e r s i o n si nr p o b 6 9 图 19 ：c o m p a r i s o no fr e l a t i v em u t a t i o nf r e q u e n c i e si n 伊d 艿i nd r a d i o d u r a n sa td i f f e r e n tr i f a m p i nc o n c e n t r a t i o n s ( 51 t g m l ，2 5p , g m la n d 5 0l x g m 1 ) 8 0 图2 0 ：c o m p a r i s o no fr e l a t i v em u t a t i o nf r e q u e n c i e so fb a s es u b s t i t u t i o ni n r p o bo fd r a d i o d u r a n sa td i f f e r e n tr i f a m p i nc o n c e n t r a t i o n s ( 2 5p m l a n d5 0l t g m 1 ) 8 l 图21 ：g r o w t ho f d r a d i o d u r a n sa n dr p o bm u t a n t si nt g ym e d i u m 8 9 图2 2 ：g l o b mt r a n s c r i p t i o n a lc h a n g e si nr 2 0c o m p a r e dt ow i l dt y p e 9 0 图2 3 ：g e n e sw h i c he x p r e s s i o nl e v e l sc h a n g e d 1 5 f o l da r ec a t e g o r i z e d a c c o r d i n gt og e n e r a lf u n c t i o na sp r o v i d e db yt h en c b ic o g d a t a b a s e 91 图2 4 ：w e b l o g oo ft h ep r o m o t e rs e q u e n c e so fg e n e sw h i c hw e r ei n d u c e di n r 2 0c o m p a r e dt ow i l dt y p ea sd e t e r m i n e db ym e m em o t i f 9 5 i v 表8 ：m u t a t i o nr a t e sa ts i t e si n 印d b 7 1 表9 ：o l i g o n u c l e o t i d e su s e df o rp c ra n ds e q u e n c i n g 7 6 表1 0 ：d r a d i o d u r a n sr p o bm u t a t i o nf r e q u e n c i e s ( ，) a n dr a t e s a ( ) x1 0 一7 7 表