（化学工程专业论文）蛋白质酶促水解过程集总动力学研究.pdfVIP

摘要 蛋白酶促水解是在酶的催化作用下使蛋白水解生成胨、肽等低分子量产物的 生化过程。因过程具有产物多样性和反应复杂性的特点，而使其动力学研究较 为困难。本文将石化中研究复杂反应体系动力学的集总方法引入生化工程领域， 建立蛋白酶促水解通用集总动力学模型，并以牛血清白蛋白一胰蛋白酶 ( b s a t r y p s i n ) 反应体系为研究对象，进行了模型的参数估算与实验验证。具 体研究内容如下： 水解工艺研究：考察操作条件对水解速度的影响，表现为：温度升高水解速 度加快，但水解速度下降趋势更明显；p h 8 一p h 9 范围内水解速度较快：高底物 浓度下表现出底物抑制；底物浓度一定时，提高酶浓度可增加水解速度。 水解过程渡相色谱分析：用体积排阻液相色谱定量分析了蛋白酶促水解过 程。分子量最大吸收峰所对应的多肽不断水解，而其它分子量范围的多肽生成 速度大于水解速度，质量浓度不断上升。将理论肽的分子量与实验中得到各吸 收峰对应肽的分子量对比，可推断出在胰蛋白酶作用下b s a 的断裂位点。 蛋白酶促水解通用集总动力学模型的建立：根据蛋白酶促水解机理，对水解 过程做出合理假设，推导出描述微观反应的本征动力学方程。在确定集总划分 的基本原则与依据后，构建出蛋白酶促水解过程的集总反应网络，并用本征动 力学方程对基元反应进行数学描述，建立了通用集总动力学模型。 牛血清白蛋白一胰蛋白酶四集总动力学模型：以b s a - t r y p s i n 体系为具体研 究对象，根据水解产物的液相色谱数据将反应体系分为四个集总，建立了四集 总动力学模型。测定各集总的本征动力学常数后，采用自下而上分层估算的方 法，计算出反应网络的六个速率常数，并分析了影响速率常数的主要因素。为 验证模型的可靠性，在不同的原料组成和反应条件下进行实验，实验值与模型 计算值较为吻合。结果表明，该模型具有良好的拟合性和外推性。 牛血清白蛋白一胰蛋白酶体系拟一级集总模型：将本征动力学方程简化为拟 一级方程，得到拟一级集总动力学模型。模型实验验证中，计算值误差大小与 机理模型相近。与机理模型相比，拟一级模型具有形式简单、实验工作量小等 优点，但不能对水解机理做出反映，动力学常数不具有明确物理意义。 结果表明，对蛋白酶促水解复杂反应体系，集总是一种有效的动力学研究方 法，并可望用于其它生化复杂反应体系。但其不足之处亦需进一步研究解决。 关键词：集总，动力学模型，牛血清白蛋白，胰蛋白酶，水解，色谱分析 a b s t r a c t e n z y m a t i ch y d r o l y s i so fp r o t e i ni sak i n do fb l o c h c m i c a lp r o c e s st oy i e l ds m a l l m o l e c u l a r p r o d u c t ss u c h a sp e 口t o n e sa n d p e p t i d e s ，b u tj ti sd i 珩c u l tt oi n v e s t i g a t et h e k i n e t i cm o d e lo ft h i s p r o c e s sb e c a u s eo ft h ed i v e r s i t yo fh y d r o l y s a t e sa n dt h e c o m p l e x i t yo fr e a c t i o n t h i st h e s i st r i e dt oi n t r o d u e et h el u m p i n gm e t h o d w h i c hh a s b e e ns u c c e s s f u l l yu s e di nt h ek i n e t i cm o d e lo f c o m p l i e a t c ds y s t e mi np e t r o c h e m i c a l i n d u s t r y , i n t ob i o c h e m i e a lr e a c t i o nf i e l d t h e nau n i v e r s a ll u m p i n gm o d e lf o rp r o t e i n e n z y m a t i ch y d r o l y s i sw a se s t a b l i s h e d ，a n dw a sa p p l i e dt ob s a t r y p s i nr e a c t i o n i n v e s t i g a t i o no nt h eo p e r a t i n gp a r a m e t e r s ：t h cr i s eo f t e m p e r a t u r ec a ni n c r e a s e t h er e a c t i o nr a t ea tt h eb e g i n n i n g , b u tt h er a t ed e c r e a s e sf a s t e rw i t ht i m ed u et ot h e i n a c t i v a t i o no fe n z y m e m h y d r o l y s i sr a t ei st h ef a s t e s tb e t w e e np h 8 t op h 9 h i 曲 c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t ew i l ir e s u i ti ns u b s t r a t ei n h i b i t i o n 1 1 1 er e a c t i o nr a t e i n c r e a s e sw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f e n z y m er i s e s a n a l y s i so fh y d r o l y s i sw i t hh p s e c ：t h et r y p t i ch y d r o l y s i so fb s a w a sa n a l y z e d w i t hh p s e c t h em a s sc o n c e n t r a t i o no fp o l y p e p t i d e s c o r r e s p o n d i n gt o t h ep e a k w h o s em o l e c u l a rw e i g h ti st h eb i g g e s td e c l i n e d ，w h i l et h o s eo fo t h e rp e p t i d e sr o s e c o m p a r i n g t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h e o r e t i c a lp e p t i d e sw i t ht h a tf r o m e x p e r i m e n t s ， t h ep o s s i b l ec l e a v a g ep o s i t i o no f b s ac a l lb ed e d u c e d r o u g h l y e s t a b l i s h m e n to fu n i v e r s a ll u m p i n gk i n e t i cm o d e l ：o nt h eb a s i so f h y d r o l y s i s m e c h a n i s m ，h y p o t h e s e sa b o u tt h eh y d r o l y s i sp r o c e s sw e r em a d e ，a n dt h ei n t r i n s i c k i n e t i ce q u a l l o nw a sd e d u c e d ，t h e nt h el u m p i n gr e a c t i o nn e t w o r kw a sb u i l tu pa n d t h em i c r o c o s m i cr e a c t i o n sw e l ed e s e r i b e db yi n t r i n s i ck i n e t i ce q u a t i o n s 1 1 1 u st h e u n i v e r s a l l m n p i n gm o d e l f o r p r o t e i ne n z y m a t i ch y d r o l y s i sw a se s t a b l i s h e d ， f o u rl u m p sk i n e t i cm o d e lf o r b s a - t r y p s i ns y s t e m ：t h ec o m p o n e n t s o f b s a t r y p s i nr e a c t i o ns y s t e mw e r eg r o u p e di n t of o u rl u m p sa e c o r d i n gt ot h ed a t ao f h p s e c a n dt h en e t w o r kf o rr e a c t i o nw a sb u i l tu p t h es i xr e a c t i o nr a t ec o n s t a n t s w e r ee s t i m a t e db ym a r q u a r d tm e t h o di nt w os t e p sf r o ml o w e rl e v e lt ou p p e rl e v e l a f t e rt h ei n t r i n s i ck i n e t i cc o n s t a n t so fe a c hl u m ph a db e e nm e a s u r e d t h ea b i l i t yo f p r e d i c t i o na n de x t r a d o l a t i o no ft h ek i n e t i c m o d e lw a st e s t e db yc o m p a r i n gt h e c o m p u t e dv a l u e sw i t ht h ee x p e r i m e n t a lv a l u e s b s a - t r y p s i nv i r t u a lf i r s t , o r d e rr e a c t i o nl u m p i n gk i n e t i cm o d e l ：t h ei n t r i n s i c k i n e t i ce q u a t i o nw a s s i m p l i f i e da s av i r t u a lf i r s t - o r d e re q u a t i o n ，a n das i m p l el u m p i n g k i n e t i cm o d e lw a so b t a i n e d t h ed e v i a t i o nb e t w e e nc o m p u t e dv a l u e sa n do b s e r v e d v a l u e si ss i m i l a rt ot h a ti nt h em e c h a n i s mm o d e l i na d d i t i o n ，t h i sm o d e lh a st h e a d v a n t a g eo f s i m p l ef o i t na n ds t o a t lw o r k l o a d i ns u m 1 u m p i n gm e t l l o di sa l le r i e c t i v ew a yt os t u d yt h ec o m p l i c a t e dr e a c t i o no f p r o t e i ne n z y m a t i ch y d r o l y s i s i t c a nb e a p p l i e d t ot h ei n v e s t i g a t i o no fs i m i l a r c o m p l i c a t e dr e a c t i o ns y s t e m ss u c ha sp o l y s a c c h a r i d e s ，l i p i d so rn u c l e i ca c i d s b u t t h e r ea r es o m ep r o b l e m st ob es o l v e db yf u r t h e rr e s e a r c hi nt h i sm e t h o d k e y w o r d s ：l u m p i n g ，k i n e t i cm o d e l ，b s a ，t r y p s i n ，h y d r o l y s i s ，c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫盗盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：雯簟嚆 签字日期：弦d年f 月f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘生盘生有关保留、使用学位论文的规定。 特授权蠢洼盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：j 之j 藩酋 导师签名 签字日期：3 年f 月日签字日期：年 月 前言 蛋白质酶促水解是在水溶液中通过酶的催化作用，使蛋白质中的肽键断裂， 生成胨、肽等低分子量产物的生化反应过程。产物在肽链长短和空间结构上与 底物蛋白有较大不同，其理化性质与功能特性也发生一定程度的变化。蛋白酶 促反应及其水解产物在食品、臼用化工、轻化工和生化基础研究等领域都有较 为广泛的应用。近年来的研究表明，蛋白水解得到的某些多肽具有生物活性， 对人体健康十分有益，可作为保健食品甚至药品，因此，国内外对蛋白水解的 研究十分活跃，已成为研究热点之一。 在众多相关研究中，有关蛋白酶促水解动力学的研究始终是一个重要方面。 首先，反应动力学是蛋白酶评价与筛选的重要依据之一；其次，反应动力学是 反应机理研究的常用手段；再其次，为解决工业反应器的选型及设计计算提供 必需的理论依据：最后，为工业装置的优化操作提供理论指导。 目前，对蛋白质酶促水解的研究主要集中在产品和工艺开发上，在动力学 方面的研究较为滞后。传统的米氏方程及其修正形式描述的是单底物酶促反应 过程，适用于底物结构、反应过程及产物种类都较为简单的情况。由于蛋白水 解体系的产物多样性，各组分之间在动力学性质上存在较大差异，用一个动力 学常数来描述所有组分的动力学行为必将产生较大的偏差。用水解度描述宏观 反应过程，也是将整个体系作为一个反应物来研究，其动力学只能反映出宏观 水解速度的快慢和水解进行的程度而难以表征各组分反应性质的差异，也不能 定量表征目标产品的生成趋势。总之，目前的动力学研究尚不能有效描述蛋自 酶促水解过程。究其原因，蛋白水解是一个集产物多样性和反应复杂性于一体 的耦联体系。由于蛋白多肽链上可发生水解的断裂位点较多，体系中产物常以 百计，表现出产物的多样性。水解过程中，某一反应的产物，可能同时又是另 一反应的底物，同一底物又可生成不同产物，平行反应与连串反应并存，各反 应之间相互耦联、相互制约，表现出反应的复杂性。因此，用常规的动力学研 究方法来处理这种产物多样性和反应复杂性的体系是极为困难的。 蛋白酶促水解反应体系在产物多样性与反应复杂性方面与石化中催化裂化 体系十分相似，因此本文拟借鉴石油化工中的集总思想来处理生化工程中复杂 反应体系的动力学问题。所谓集总，就是将复杂反应体系中动力学性质相近的 多种组分视为一个虚拟组分，由此将复杂体系简化，建立集总动力学模型。要 求该模型在描述体系的动力学行为时不失真，又便于用合理的数学形式表达和 易于进行计算。 基于以上研究背景，本文将集总方法引入蛋白酶促水解反应过程中，以水 解产物液相色谱数据为依据，将反应体系按分子量大小分段集总，建立蛋白质 酶促水解过程的集总动力学模型。具体研究内容如下： 选择结构明确的牛血清白蛋白为模型底物，作用机理清晰的胰蛋白酶为催 化剂，研究了反应时间、反应温度、底物浓度、酶用量与p h 值等水解工艺条件 对蛋白水解反应速度的影响规律。用体积排阻高效液相色谱对水解过程进行分 析，并初步推断出牛血清白蛋白在胰蛋白酶作用下的断裂位点。 在动力学研究方面，将集总方法引入蛋白酶促水解反应，根据反应机理， 对水解过程做出合理假设，根据液相色谱数据，将水解体系中各组分按分子量 分段集总，用包含底物抑制、产物抑制和酶失活的本征动力学方程描述基元反 应，建立了蛋白酶促水解通用集总动力学模型。 以牛血清白蛋白胰蛋白酶体系为具体研究对象，建立此体系的四集总模型， 并按从下向上分层估算的原则，使用非线性微分方程组的阻尼最4 , - 乘法计算 得到此体系的反应动力学常数，并对模型进行了实验验证，结果表明，集总模 型可以较好地预测水解产物的质量分布情况。通过分析反应动力学常数，可对 反应机理进行印证，并推断出集总组分大小对水解反应的影响规律。 最后尝试了将本征动力学方程简化为拟一级反应，将此拟一级集总模型的 计算结果与机理模型相对照，得到两种模型的优劣对比。 总之，将集总方法引入蛋白酶促水解反应可以较为有效地解决产物多样性 与反应复杂性给动力学研究带来的困难，该模型的建立在理论上将对揭示蛋白 酶促水解过程中的微观机理提供帮助，在实践上有助于优化反应条件以得到所 需的产物。此建模型思想也将适用于多糖、核酸及脂肪等多组分生化反应的动 力学研究。 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 蛋白酶促水解研究进展 蛋白质是一类复杂的高分子含氮化合物，是细胞的首要结构物质，生物体 一切生命现象无不与蛋白质的活动相关。人类从食物中摄取蛋白质，在胃和肠 中由各种消化酶将其依次水解成多肽、寡肽及氨基酸，以消除其特异性，然后 才能合成人类自身所特有的蛋白质。 近年来，人们发现在体外将蛋白质酶促水解，可得到某些活性多肽。营养 学实验证明，这些活性多肽在人体内消化吸收明显优于单个氨基酸，并且与氨 基酸在人体内转移、输送有不同的体系。但对人体内蛋白质合成无任何不良影 响，且对改善人的体质，促进人的健康，治疗某些疾病起着重要作用。随着高 效液相色谱、氨基酸序列分析等技术的发展，大量具有生物活性多肽的结构已 被分折鉴定。由于蛋自资源十分丰富和廉价，通过水解蛋白质所获得的生物活 性肽不仅价格便宜、安全性好、工艺简单，而且容易进行工业化生产，所以这 类研究越来越受到科学工作者和各国政府的关注。 1 1 1 水解蛋白的来源 1 ，1 1 1 植物蛋白 随着科技的进步，植物蛋白的优异功能不断被揭示。为便于人体对植物蛋白 的消化吸收，并适应生产不同食品的要求，要将植物蛋白进行适当水解。这是 因为植物蛋白的结构大都十分紧密，分子量很大，人体摄入后，不易消化吸收， 吸收率往往低于动物蛋白。但植物蛋白经过水解后，蛋白质分解成分子量相对 较小的多肽和氨基酸，结构变的疏松，便于人体内各种消化酶的进攻，吸收率 大大提高。通过水解改性，控制水解条件还可改变多肽分子的空间构象，并将 分子量降到一个适当的范围，获得表面活性较为理想的水解蛋白产物【l j 。 大豆是我国主要农产品之一，大豆蛋白来源极为丰富。大豆中含有4 0 左 右营养价值高的大豆蛋白，大豆蛋白中必需氨基酸平衡良好，其中赖氨酸含量 丰富，这是其它植物蛋白难以比拟的。但由于大豆蛋白分子结构复杂，8 0 蛋 第章文献综述 白的分子量在1 0 万以上，大多数分子内部结构呈反行d 螺旋非有序结构，分子 高度压缩、折叠，从而使得大豆蛋白消化率和生物效价远不及牛奶、蛋等动物 性蛋白。而大豆水解生成的多肽可以克服大豆蛋白在营养学上的弱点。经水解 后等电分离得到的大豆蛋白水解物具有一些良好的性能，如在不同p h 值时具有 高溶解度、更优越的乳化性、粘度特性等。更重要的是大豆蛋白水解物中多肽 的氨基酸组成与大豆蛋白完全一致，必需氨基酸含量平衡、丰富，且吸收速度 快、吸收率高，可作为肠道营养剂和流体食物应用于病人、老年人和婴幼儿， 所以大豆蛋白水解物的功能特性和营养价值使它广泛应用于食品工业中【2 1 。 螺旋藻是一种古老的低等原核单细胞水生植物，富含各种营养成分。据测定， 1 0 0 9 干燥螺旋藻粉中，含蛋白质5 0 7 0 9 ，相当于大豆的1 6 倍，猪肉的7 倍， 鸡蛋的3 1 倍。全脂奶粉的2 9 倍。它含有1 7 种氨基酸，人体必需的8 种都有， 且含量高于世界粮农组织的标准翻。但提取后的蛋白在加工过程中易变性，很难 将其应用于食品加工过程中。而将螺旋藻蛋白进行一定程度的酶促水解，不仅 可以避免蛋白变性的问题，还可增加其溶解性和在不同环境下的稳定性，且不 影响蛋白的营养价值。水解生成的多肽比未水解蛋白有更多的优点和更广泛的 应用范围，它可用于提高和修饰食物蛋白的功能性、可口性和保健性，且因其 吸收利用率高，并富有一定生理活性，可在某种程度上替代大豆蛋白水解物， 制成适于特殊病人营养需要的保健品或改善产品功能性质的食品添加剂。目前， 螺旋藻多肽已广泛应用于食品、饲料、化妆品及医疗保健品等领域【4 l 。 棉籽是我国仅次于大豆的重要油料资源，年产量达8 0 0 万吨。棉籽蛋白在质 量上近似于豆类蛋白，营养价值比谷类蛋白高。从氨基酸组成上看，除蛋氨酸 稍低外，其余必需氨基酸均达到联合国粮农组织和世界卫生组织推荐的标准【5 j 。 和大豆蛋白相比，它没有大豆蛋白所特有的豆腥味和胀气因子，因而是一种很 好的食用蛋白质和饲用蛋白源。棉籽蛋白酶促水解改性，不仅可获得良好的起 泡性、乳化性等功能特性，而且能提高棉籽蛋白的生物学效价1 6 j 。 玉米蛋白粉是玉米淀粉生产中的主要副产物，其中蛋白含量大于6 0 。玉米 蛋白粉中的蛋白质以醇溶蛋白为主，约为6 0 嘣”。醇溶蛋白是一种结构特殊的蛋 白质，其分子中存在大区域的口一螺旋结构，使之具有很强的疏水性悼j ，这限制 了玉米蛋白粉在食品工业中的应用。为了提高玉米蛋白粉的水溶性，就必须对 其进行修饰，即通过改变其结构，达到改善其功能性质的目的，酶法修饰蛋白 是较常用的手段。通过酶法水解，玉米蛋白粉中大区域的值一螺旋结构被破坏掉， 第一章文献综述 形成分子量相对较小的多肽，其水溶性可显著提高。 此外，菜籽蛋白及小麦面筋蛋白都可用酶法水解来获得这些蛋白功能上的改 性或得到目标产物“。 1 1 1 。2 动物蛋白 与植物蛋白比，动物蛋白在氨基酸组成上与人体更为相似，更易为人体吸收 利用。近年来，在动物蛋白酶促水解方面，各国科学家做了大量工作，研究热 点主要集中在牛乳蛋白和血蛋白的水解方面。 牛乳蛋自是来源最广、产量最大、营养成分最全面的动物蛋白之一。1 9 9 8 年全球产牛奶约5 2 ，0 0 0 万吨，以牛奶含蛋白3 3 计，则牛乳蛋白的年产量高达 1 7 3 0 万吨。我国牛奶的产量也随着人民生活水平的不断提高而大幅上升。 牛奶中主要含有三种蛋白质：酪蛋白、乳清蛋白和乳球蛋白，还有少量的脂 肪球膜蛋白。牛奶蛋自质含有二十多种氨基酸，人体必需的八种都有，这些氨 基酸组成比例均衡，十分适合人体需要。但是牛乳蛋白在被消化吸收时也有不 尽人意之处，主要是由于它在胃中易形成凝块，影响了人体( 特别是婴、幼儿) 对它的吸收利用。研究中发现牛乳蛋白在被酶催化降解以后，其水解物的溶解 性能大大改变，它在等电点或三氯乙酸中的氮溶解指数明显增加，说明了牛乳 蛋白水解生成了一些低肽分子，改变了牛乳蛋白的性质，这将有利于人体对酪 蛋白的消化吸收；此外近来还发现酪蛋白水孵物中的一些多肽分子具有某些重 要的生理作用。因此，系统的研究酪蛋白的酶促降解，在理论上和实际应用中 都具有重要意义【l 2 ”j 。 目前对动物血蛋白的酶促水解研究主要集中在猪血蛋白方面。我国养猪的 数量居世界首位，血资源十分可观，但我国对动物血的利用率很低，每天将大 量的废血排掉，既造成营养物白自流失，又污染环境。而在当今动物蛋白资源 短缺的情况下，开发利用猪血蛋白资源具有巨大的意义。猪血蛋白是一种全价 蛋白，其中含有1 8 种氨基酸，包括人体自身不能合成的全部必需氨基酸。猪血 中的血浆蛋白，经分解后，有消毒和滑肠作用，能与侵入人体肠道的各种粉尘、 有害金属微粒发生化学反应，并使其排出体外【。但由于猪血中含有血红素， 且发出一种特殊的腥味，因此在食品加工中未受到足够的重视。而用酶法处理 猪血，辅以活性碳脱色，可以达到脱色除腥的目的，得到的产品易被人体吸收， 可作为食品添加剂 1 5 2 0 。牛血蛋白是另一重要的动物血蛋白来源，以其为原料 第一章文献综述 获得的牛血清白强白是一种应用广泛的重要生化试剂。目前国外已有用牛血蛋 白为原料水解制备活性肽的报道，其产品广泛应用于婴幼儿乳品，保健和功能 食品。有报道说添加牛血蛋白活性肽于肉制品中可以改善其组织状态和提高风 味。牛血红蛋白还可水解得到用于医药的阿片肽类：h e m o r p h i n s 2 1 彩l 。 另外，有人还研究了动物肉类蛋白酶促水解作为食品添加剂1 2 4 - 2 6 】。 1 1 2 蛋白酶促水解工艺研究 蛋白酶促水解工艺研究可分为以下两方面，一方面是水解操作条件的研究， 包括水解底物的预处理、蛋白酶的选择和复配、水解产物的分离纯化及水解温 度、反应时间、p h 、底物和酶用量等水解参数的确定；另一方面是水解反应操 作流程的开发，包括传统的间歇搅拌水解和正在兴起的酶膜反应分离祸合连续 水解，以及固定化蛋白酶参与蛋白水解等。 1 1 2 1 酶促水解反应操作条件开发 水解前对蛋白底物进行预处理如研磨、加热等，可有效提高反应水解速度。 这是因为预处理一方面可增大底物溶解度，另一方面还可部分消除底物抑制， 因为蛋白源中的某些抑制因子，如大豆蛋白中的s t i ，牛乳蛋白中的旷a t 等在 处理过程中将被破坏掉。同时，预处理还可使底物变性，空间折叠结构部分打 开，更易于蛋白酶进攻而利于蛋白的水解。 目前，实际酶促水解过程中所用催化剂多是由几种蛋白酶构成的复合酶制 剂，例如，李雁群等用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和1 3 9 8 中性蛋白酶共同催化水 解牛乳蛋白【2 7 1 。因为酶作用位点的相对专一性，单纯用一种酶水解效果总是有 限的，用多种酶共同水解可更大限度的将蛋白水解成较低分子量的多肽。且复 合酶制剂有时可解决水解产物的风味问题，水解产生的苦味肽有时可通过内、 外肽酶共同作用来去除【2 8 】。根据l a l i 等人的观点，最佳组合的蛋白酶理论上可 将任何纯蛋白质底物水解为理想产物，即所需比例的氨基酸与肽的混合物a 因 此，蛋白酶复配技术在水解工艺设计中具有重要作用。 在水解产物的下游处理中，蛋白水解产物提取分离工艺里。活性炭脱苦脱 色、等电点沉淀、盐析或有机溶剂沉淀为常见传统工艺，例如在酪蛋白磷酸肽 c p p s 的提取精治过程中，首先在水解液中加入c a c l ：，再加入乙醇沉淀，最后进 第一章文献综述 行过滤分离。新分离工艺中离子交换吸附、双水相萃取、反胶团萃取已有相应 文献报道。目前，最有前途的处理方法为膜分离，它用超滤膜除去大分子蛋白 酶、未水解的底物与不溶性肽 2 9 - 3 3 1 。水解产物可用不同截留分子量的超滤膜再 分级分离，可得到不同分子量大小的目标产物。 在水解条件的控制上，针对不同的反应体系，由于所用底物蛋白和酶的性 质不同，反应条件包括温度、p h 、底物用量和酶用量等均有很大的变化，一般 需根据目标产物的产量及生产成本等加以优化。 1 1 2 2 反应操作流程的开发 传统的间歇搅拌仍是蛋白酶促水解领域中应用最广的操作流程之一。其优 点是操作灵活方便，可根据生产需要更换反应体系。但也存在较大的缺点，表 现为产品质量不稳定、酶回收困难、产物后续分离工序复杂和生产成本较高等。 与传统的间歇搅拌水解相比，酶膜反应分离耦合集酶促水解反应、产物分 离纯化和催化剂回收利用于一体，因而成为实现连续化操作的有效模式，同时 也是对酶促水解反应机理进行研究的重要工具。其主要优点包括：酶制剂可以 重复使用，可降低成本：产物可从反应介质中选择性地连续移出，从而移动化 学平衡、消除产物抑制、提高反应转化率与选择性1 3 4 】；低压低温反应，节约能 源；在多组分反应系统中，可以简化后续分离工序，使工艺成本降低；控制产 物多肽组成使分子量分布集中，功能特性相近。缺点是：酶的稳定性除受热失 活影响外，还受其它因素的影响，如酶通过膜孔的泄露，酶在膜上的吸附将使 酶的构象发生变化而导致失活，即膜材料将影响酶的稳定性p 邓6 】；膜上易出现浓 差极化与大分子吸附现象。目前普遍采用的典型组合为连续搅拌釜式反应器超 滤膜( c s t i 趴j f ) ，水解反应在搅拌釜中进行，含有产物的溶液被不断送至膜分 离装置中，分子量小于膜截留分子量值的小肽容易通过膜组件从体系排出，而 底物、蛋白酶及多肽等大分子量物质被膜截留，送回反应器中进行循环反应。 其中，酶的选择以高活性、作用广泛的蛋白酶为宜，以避免未转化的底物在体 系中积累；膜的选择，以目标产物多肽分子量的上限值为膜的截留分子量值。 目前，酶膜反应器己在蛋白酶促水解中有实际应用【l 6 ，”j 。 1 1 2 3 蛋白酶固定化技术的应用 固定化蛋白酶作为第二代酶制剂是酶反应生物技术实现工业化的重要手 燕一举文献综述 段，也是今嚣酶促反应工艺开发的熏要方向。至今门有多种蛋白酶被成功地固 定化在不同裁体上 4 “6 j 。采用固定纯蛋自酶进行水解有许多明显的优点，鲡： ( 1 ) 酶经过阉定化处理后。定间结构更为坚固，并舆有一定的形状和机械强度， 对热、讲稿梳械撬择等豹稳定经鞠驻提高，装填予反应器裔幂 j 予长精、稳定、 彻底的水解，为连续化生产提供了w 能。同时对抑制荆的敏感性降低，有的酶 其有了抗蛋囱酶分解的蒋镶。( 2 ) 殷痘完戒盖经过褥单静邋滤蕺离心，酶魏霹 以回收，而且酶活力降低较少，提高了单使酶的产龋产量。( 3 ) 固定化体系适 用予连续他、自动豫生产，徨纯过程容荔靛瀚，羹产磊审不会蒂避酶蛋岛藏细 胞，改善了后处理过程，提高了酶的利用效率，降低了生产成本。但也存在着 舞强的缺点，麴：爨自酶霞定纯惹，由予酶本身麓构蒙效藏菇及载俸静屏蔽效 应使得催化活性降低，表现为米氏常数l ( i l l 假增大：阉定化酶的引入，使反应体 系戒为多稿，酶解劝力学交褥更兔复杂，褰蕊动力学方程不仅包含镤纯反应速 率，同时还包括物威传递速率，特别是当底物为大分子蛋囱质时，内、外扩散 疆涮影确受为严重，这静扩教隘宓派是弱怒强定依凝自酶镤伍活力下簿豹主要 因素之一；阉定化步骤的繁杂以及栽体本身的成本也将限制其广泛应用。 嚣蘸酶鬻定纯瓣主要磷究方淘为；( 1 ) 开发冤毒、徐撩显牲憩稳定熬麟登 载体材料，如魔芋粉、壳聚糖和海藻酸盐等天然高分子材料等1 4 ”。( 2 ) 研究新 静阉定纯方法缓减少酶翡失活，强纯簧凌，懿大孑l 浆台、溶获一凝获菝零瞧瑾 蛋白酶等 4 8 , 4 9 。 1 1 3 蛋囱水解产物的并发与成用 由蛋自菔永勰秘所麓螽静滔往歉类佟兔食品添麓裁，爨香荔消弦、易吸浚、 抗过敏、治疗低血臌和降低胆圃醇等多种特点和生理功能。目前往日本已有多 种产品上市。雷内落宥酪鬣鑫磷躲产葫供液。蔽下篱奔嚣麓磅究较多麴a 耱蛋 白水解产物。、 1 。3 1 大妪蛋囱水解物 大豆鬣自瘩麓物在钦瓣孛豹皮羯：大露蛋白文孵物在酸性饮料麴蹦( 4 。5 5 0 ) 下可溶，所以w 将其添加到饮料中，提高饮料蛋白质禽量以强化营养。这 秘饮辩甭仗跫运动经晶，墩是婴j k 、老年入移病人豹营养保健品t 在医疗临床 上，对于只能饮流食的病人来说，这种产晶完全可以替代阱往的氨基酸混合物。 第一章文献综述 戮究表明大豆虽蠢零鼹耪孛低聚簸魄氨蘩酸暖羧受莰，受乎餐，艇费霸缀低。 大甄蛋白水解物作为代乳品：作为代乳品，大豆蛋白水解物不仅可用于幼 紊橱养，还可磁寒喂葬娶镄，l 。疆究涯蜜大豆蛋鑫承麓键彝未跫遴熬蛋囱蔟在 舆消化率、生物举效价或净蛋白质利用方面并无多大差昴，所以就其营养来讲， 大豆蛋皇农簿物豹疫弱慰帮些嚣裁晶工效楚于空鑫或薄弱瓣国家爨吴程g | 力。 应用于发酵食品：由于大豆蛋白水解物中多肽具有促进微生物生长发育和 滔跃饯落豹传矮，茸健遨双蚊桴整翦生长发枣，增强嚣镳酵母戆产气熊力。霹 用于酸奶、酱油、火腿镣发酵食品中，以提高产品营养价值，改善产品晶质， 增强产品风味及提寒生产效率。 1 1 3 2 畜血蛋豳水解物 华南理工大学稻a s l 3 9 8 蛋白酶承解猪矗鬣鑫铡取了复合氦基酸营养液， 研究证实该营养滚可以健进人体的生长发育，加速白细胞的恢复及增强体力， 掇高人体免疫力，对舅率瘸放疗暴青辅懿侔藕，还可键迸锌在天钵肉鹣蔽牧 2 0 1 。 长春市动物血应用技术研究所和自求恩医科大学共嗣研究，以牛血蛋白水 解耪秀蒌础原料，采用懿基酸分街琵较法及生耪学方法，按入傣需要8 稀努需 氨基酸擞的配比模式，选当补加色氨酸、异亮氦酸、蛋甄酸及配伍适量的多种 维生素蒋，逢步研裁筏“复方营养要素狰裁”秘“复方牛盘获氨基酸狡囊” 两种药并经多批试验，产品的产髓和质避比较稳定，适合工业化生产【5 0 】。 另外，牛藏清鑫蛋囱酶程承解哥戳褥至l 获岛索裁激歇瑟1 霉l 。a k e m i c h i 等将 牛血清白蛋白胰蛋白酶水解液用色谱柱进行纯化，得到胰岛素刺激肽。研究表 疆，冀零隽并秃耪岛素瓣功能，毽当冀岛获鑫素共存时，霹较大福度豹增热胰 岛素的功效。牛皿清白灏自胰蛋白酶促水解得到的回肠收缩肽【5 引，可促进回肠 缀彝鼠爨带靛毅缝。由牛巍渍鑫豢白拳辩产耪还可分离褥翻毒孛经晦压素耱关默 划 等生物活性肽。牛血清囱蛋白水解产物具有较高的溶解性和良好的生物兼容性， 麓筵寿久磷究蕉其终为薅耪豹罄镶穆，毅提毫承溶注较慧瓣莼麴靛溶簿魅净“。 1 1 3 。3 牛孚l 肽制品 虽然已经裔丈量从备种蛋囱中水解得到生物活性肷的报导。但是目前研究 簸集孛懿还是动物孚l 蛋是。垂从1 9 7 9 冬b r a n t ! 等人首先摄道从啜食了牛巍酪蛋 白酶解产物的脉鼠小肠中发现了具有类吗啡活设的短膝以来，酪蛋白源的生物 第一章文献综述 活性肽方面的研究进展迅速，其生理功能越来越引起人们的重视，并日益成为 乳品领域研究的焦点。到目前为止，已经发现了几十种具有重要生理功能的生 物活性肽，这些肽类，具有非常重要和广泛的生物学功能和调节功能，其中有 些已经通过工业化生产并进入国际市场。表卜l 是动物乳来源的活性肽。 表卜1 动物乳活性肽 注：磷酸丝氨酸 目前国内外研究较为活跃的是酪蛋白磷酸肽。酪蛋白磷酸 j k ( c p p s ) ，是从牛 第一章文献综述 飘酪蛋怠水解物中提取的一秘多默剖晶”7 - 6 1 oc p p s 是多葶申短驮的混合物，其中 丈部分肢中含有成簇的磷酸丝氨酸序列，这一序列也正怒c p p s 的功能基团，其 食量的多少与c p p s 功能特性直接相关。 钙必须以离予的形式才能被动物体吸收，懊它在动物小肠嘏似中性和弱碱 性的环境下易与酸根离子结合，形成不溶性盐而流失。早在4 0 多年前， m e l t a n d 材1 5 2 l 等酋次从酪滋自酶胰蛋自酶永解液巾分离至磷酸膝，并证明这些获 对钙吸收具有促进作用。此后r e e v e 也从酪蛋白的水解产物分离到c p p s ，并发 现它可以防丘磷酸钙形成澄l 。p e t e r s o n 氇觚s 一酪蛋自静胰蛋自酶承解产物孛分 离到一种纯的磷羧肽，并测定了其氨基酸组成 6 4 1 。b r u l e 等发明了采用腆反应器 酶法连绥生产c p p s 豹方法l 蟋。8 a c e l 等糟离子交换屡析簌酪蛋露的酶解液中分 离得到黧少7 种磷酸肽 6 6 1 。和野敏明等发明了用胰蛋白酶水解潞蛋白，然后在 承解液巾稚氯纯锈和乙醇来沉淀分离c p p s 的方法箨”。 c p p s 中磷酸丝氨酸结合的钙在肠道p h 条件下具有非常好的溶解状态，无 论是娶j k 还莛鬻镶瘸意卷辩这种形式静镑都舂缀好静蔽收。因诧，它不饺髓够 补钙和促进人和动物对错的吸收，而且逑能有效地改善佝偻病患者的痰状和防 丘，l 童瓣齿病静发生l 秘，硼。 。2 蛋囊及多欺裹效液摆色谱势耩避震 蛋巍矮秘多救鹣分耩蠢法静类缀多，近年来又有毅熬进展。鬻强豹方法煮 凝胶电泳法和商效液相色谱法。 在邀濠法中，s d s 一张g e 是援蔻应翔最广泛弱一秘惑分辨力浆邀泳方法，用 于蛋白质的分离鉴定和分子曩测定，常用的缓冲液系统怒t r i s 。近年来文献报 遂蠲t r i c i n e 系统可以敬善小分子量蛋白覆帮敖熬分离。采霜把蛋自爆从s d s p a g e 电泳凝胶上转移至p v d f 膜，然厝可以在p v d f 膜上进行原位分析，如氨 基酸组成分撩、黪解、化学袈煞鄹蛋白艨多默顺序分辑。毛缨管电泳是近年 来发展的一种新技术，目前已用于多肽、蛋白威以及棱酸的分离分析、遗传工 程产物豹鉴定、剿药工波、食晶工业、农妲、水处理以及去垢刘鄹多聚物化学1 7 “。 在高效液棚色谱分析蛋白殿多肽的研究中，常用的色谱有：反相色谱、离 予交换像谱、紊会色谱秘体积掺阻色落等，羁裁以反撼色谱和体积排飘色谱较 为常用。 第一章文献综述 反相色谱是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立 的一种色谱模式。在生物大分子的反相液褶色谱条件下，流动相多采用酸性的， 低离子强度的水溶液，并加一定比例能与水互溶的异丙醇、乙腈或甲醇等有机 改性剂。大量使用的填料为孔径在3 0 纳米以上的硅胶烷基键合相。由于其柱效 高、分离度好、保留机制清楚，是蛋白和多肽分离、分析纯化和结构阐明广泛 使用的一种方法。p i o t l 7 l j 等人用反相色谱研究了牛血红蛋自的胃蛋白酶水解产 物，m a t a r 7 2 1 等也用此技术分析了牛乳蛋白 a c t o b a c i l l u sh e v e t j c u s 菌发酵 产物中生成的生物活性肽。 体积排阻色谱是一种按照溶质分子在流动相中的体积大小分离的色谱法。 填料具有一定范围的孔尺寸，大分子难以进入面先流出色谱拄，小分子后流出。 因此，体积排阻色谱是测定蛋白和多肽分子量的一种有效方法。因其方法简单、 条件温和、重复性强，在生物大分子的分离分析中起着重要作用 7 3 - 3 s 。它不仅 可用于蛋白质的分离纯化，还可用于测定蛋白质分子量的大小。近年来柱填料 的发展使其具有更高的分辨率，能够在更离的温度下操作，从而为动态地研究 热变性过程中蛋白质分子的细微变化提供了条件。 蛋白水解产物中包括从大到小各种多肽分子直至游离氨基酸，其分子量范 围较广。测定其分子量分布情况也是对水解过程和水解机理的一种表征。传统 的测定方法聚丙烯酰胺凝胶电泳在被测物质分子量小于几千时会出现较大的误 差，而较先进的快原子轰击质谱和电喷雾离子化质谱虽然测定精度较高，但设 备昂贵。与之相比，体积排阻色谱可以较为快速的测定出蛋白和多肽的分子量。 且测定结果与反相色谱一质谱联用技术测得的数据之间的误差一般小于1 0 “。 有人用b i o - g e lt s k1 2 5 柱测定分子量在1 0 0 0 到1 0 ，0 0 0 的多肽样品，误差仅 为5 左右。齐崴等用p r o t e i n - p a k1 2 5 体积排阻色谱柱对酪蛋白胰蛋白酶促水 解的产物进行了分子量分布分析，并由此对水解过程进行了推测1 7 7 1 。王惠珍等 利用高效液相色谱法对两种不同的转移因子类似物产品中多肽组分分子量的分 布进行了分析 7 z 】。马永强等用s e p h a d e x2 5 柱对大豆蛋白水解物中肽分子的分 布进行了研究，计算出不同分子量范围的多肽在水解产物中所占的比例。 但体积排阻色谱也有一个主要缺点，即它的峰容量通常有限( 少于1 2 个峰) ， 所有分离都是填料孔隙内流动相体积的函数，因此对分子量差异较小的蛋白质 分析效果相对较差一些。 第一章文献综述 1 3 酶促水解动力学研究现状 酶促水解动力学主要是研究酶促水解速度与其影响因素之间的内在规律， 这对深入理解酶的作用机制、指导酶促水解工艺开发和优化反应器操作条件都 具有重要意义。 酶促反应中，根据中间产物学说，催化反应可分为两步进行，其反应式为： k l女2 e + s ，e s 寸p + e( 1 1 ) 一i 上式中：e ：游离酶；s ：反应底物；e s ：酶与底物形成的活性中间络合物；p ： 产物。其中第二步为整个反应的限速步骤，由此可推导出描述酶促反应动力学 的著名公式一米氏方程： d c s ：k 2 c e s c s( 1 2 ) m k 。+ c s 上式中，k m ：! = ! ! 生 ( 卜3 ) k l 蛋白酶促水解体系与一般的化学反应相比复杂得多，包括反应的多样性，即 大量平行、连串反应并存；产物的多样性，即生成的产物中包括分子量各异、 长短不同的多种肽链；动力学复杂性，即酶失活、产物抑制和底物抑制现象经 常存在。在反应动力学的研究上，简单的米氏方程中少数几个动力学参量，难 以真实地描述此复杂反应过程。因此，对于酶促水解反应动力学