（化学工艺专业论文）D101树脂法分离银杏黄酮类物质的研究.pdf

郑州大学硕士学位论文 摘要 银杏在我国中药应用中有悠久的历史，它的药用范围十分广泛，其主要的疗效活 性成分为银杏黄酮类和内酯类。研究表明黄酮类、内酯类主要有清除氧自由基，帮助 延缓衰老、抗炎镇痛、抑菌抗病毒、舒张冠状血管等药理作用。因此，如何更好地从 银杏叶中提取和分离这类活性成分成为近年来研究的热点。 本文研究了银杏黄酮的水一乙醇提取工艺，就不同的提取条件进行工艺优化。通 过正交试验得出影响提取效率的显著性因素为料液比、乙醇浓度、提取温度，由单因 素试验得到较佳工艺条件：料液比l ：l o ，乙醇浓度7 0 ，提取温度7 0 ，粒度4 0 8 0 目，回流提取时间为2 h 。本文研究了银杏叶提取液的分析方法：在分析银杏叶提 取液中总黄酮含量时，加入只与黄酮类物质有特征反应的硝酸铝，采用分光光度法测 定银杏叶提取液中总黄酮含量，检测波长为4 1 5 脚。在6 3 2 1 0 4 - o 4 7 6 m g m l 的浓度 范围内，黄酮含量( c ) 与吸光度( a ) 呈良好的线形关系，该方法简单快速、准确。 本文研究采用了d 1 0 1 大孔吸附树脂分离纯化银杏叶中提取黄酮，分别采用了静 态吸附和动态吸附的方法考察d 1 0 1 大孔吸附树脂吸附银杏黄酮的特性。用静态法测 定了在1 0 、2 5 、4 0 时不同温度下的吸附等温线。结果发现，在所研究的温度范 围内，银杏黄酮的吸附量随着温度的升高而增加，从1 0 变化到2 5 时，吸附量增 加较多，但在温度从2 5 变化到4 0 吸附量增加较少。结果可知银杏黄酮在树脂上 的吸附过程为吸热过程，适当的温度升高有利于吸附，但是温度范围不同升温影响的 效果是不同的。 动态法测定银杏黄酮的吸附流出曲线，建立了相应的模型，根据实验数据进行拟 合，发现和模型方程能很好吻合，回归方程相关系数均在o 9 8 以上。通过流出曲线的 分析可知，低流速，高初始浓度，适当的操作温度和适当的高径比使吸附状况得到改 善。得出较佳条件为：料液初始浓度为0 7 8 0 m 虮i l l ，流速3 l l l l m i n ，树脂柱( 高，径) r ，“i4 2 6 】 为1 2 3 锄，操作温度2 5 ，穿透曲线模型方程为c o 7 8 0 - 1 一e 。叫一( 筹i 。 对解吸过程的研究发现，不同浓度的洗脱液和洗脱流速对解吸率有很大的影响， 对于解吸过程不能只考虑解吸率的大小，而是综合考虑产品的处理过程。得到洗脱过 程较佳操作条件为乙醇浓度为7 0 ，洗脱速度为1 5m l m i n ，温度为室温。 关键词：流出曲线，吸附等温线，大孔吸附树脂，银杏黄酮，分析方法 郑州大学硕士学位论文 a b s t r a c t w i t hb r o a dp h a n n a c o l o 百c a la c t i o n ，出eg i n k g ob i l o b al a sc h i n e s et r a d i t i o n a l m e d i c i n eh a sb e e na p p l i e d 埘t hl o n gh j s t o r yt b ei m p o r t a l l ta c t i v e i 1 1 9 r e d i e n t sj n c l u d e n a v o n o i d sa n d g i n k g o l i d e s p h 蚴a c o l o g i c a lr e s e a r c h e s d e m o n s t r a t e dt h a tt 1 1 e p a c o l o g i ce 脯c t so fn a v o n o i d s 觚dg i n k g o l i d c sa r ce i i m i n a t i n go x y g e n 酗j v e d 疳e e m d i c a l s ，d e l a y i n ga g 抽g ，a 1 1 t i - i n n a n l n l a t i o n ，r e l i e v i n ga c h e ，a n t i _ b a 捌aa n dr e l a x i l l g c o r o n a r yv e s s e l sa i l ds oo n t h ef o c u so fr e c e l l tr e s e a r c h e si sh o wt om a k en l ee x t r a c t i o n a l l ds e p a m t i o np r o c e s so f t l l e 删v e 协g r e d i e n t s b c t t e r 疳o mg i n k g ob i l o b al 1 e a v e s i nt h i sp 印c r ，w a t e ra i l da l c o h o la se x 廿a 棚n gs o l v e n tw e r eu s e dt oe x t r a c tg i r 培k o n a v o n o i d s t h e 玛t l l et e c m c a lo p t i m i 痂go fd i 丘e r e n tf a c t o r so fe x 订a c t i o nw 孵d i s c u s s e d i nt 王l j sw o r k t h eo u t s t a t l 碰n g 盘c t o r so f e x 妇c t i o np r 0 伊e s sw e r et h em a t c h i 置1 9o f f e e d s t o c k 柚ds o l v e m ，a l c o h o lc o n c e n 咖t i o n 柚de x 打a c t i o nt e m p e r a l _ i l r e 、v i 也m eo m l o g o n a lt e s t 1 1 l e m e t l l o do fm es i l l g l ef h c t o rc o m f o lt e s t 、a su t i i i z e dt oo p t i i i l i z et 1 1 ei n l p o n a n ti n n u e n c e f 如t o r s ，a sf o l l o w ：t h em a t c h i n go f f e e d s t o c ka n ds o l v c m1 ：1 0 ，a l c o h o lc o n c e n 乜砒i o n7 0 ， e x t r a c t i o nt c 玎l p 删e7 0 ，g r a n l d a 衄4 8 0 ，也et i m eo fe x 姐c t i n g2 h t h er a t i oo f e x t r a c t i o nw a su pt o8 6 5 t h ea n a l y s i sm e t h o dw a sg 州i c d 血t | l ep a p e r ：a l ( n 0 3 ) 3i ss e l e c 钯da st h eo n l y c h a r a c t e d s t i cr c a c t a m 、v i t l ln a v o n o i d si nt h ee ) ( m w t i o ns o l v e m 0 n l yh a sc h a r a c t e r i s t i c r e a c d o n 埘血n a v o n o i d si i l 也ee x 们c t i o ns o l v e m t h es p c 吐r o p h o t o m e t 巧w a su s e df o r d e t e 玎1 1 i n i n gt h en a v o n o i d si i l 吐屺e x t r a c t i v eo fg i n k g ob i l o b al 1 e a v e s t h ew a v e1 e n g mo f a n a l y s i s i s4 1 5 n i n t h ec o n c e i l 妇t i o n 蛆dt h ea b s o r b 鞠c eh a v eg o o dl i n e 盯r e l a t i o n s l l i p 诫t l l i nt 1 1 ec o n c e n t r a t i o n 啪g eo f 6 3 2 1 0 - 4 - 0 4 7 6 m g ，m 1 ，i km e m o dw a ss i m p l e ，r 印i da n d a c c u r a t e t h es e p a r a t i o na n dp 埘i yo f 丑a v o n o i d si n 拙【ep 鳟) e re l p l o y e dm ea b s o r p t i o n 埘m d 1 0 1 一m a c m p o r o u sa d s o l p t i o nr c s 血n sa b s o r 州o h 仃a i tw a sd i s c u s s e db yt h em e t l l o do f m es t a t i ca d s o i p t i o na i l dm ed y n a 耐ca d s 唧t i o n n ea d s o i p t i o ni s o t h e mo fd i 虢r e n t t e m p e r a n w a sg a i n e di n1 0 ，2 5 ，4 0 b ys 协t i ca d s o 叫o n n er e s u l ts h o w e dt l l a t m ea d s o r b e da m o u mo fn a v o n o i d si 懒e d 、v i t l lt h er a i s eo ft c l n p c 删c u r e ，t 1 1 ea d s o r b e d a m o u n ti n c r e a s e dm o r ef b m1 0 t o2 5 t h a nf m m2 5 t o4 0 t b e r e f o r e t 王l e i i 郑州火学硕士学位论文 a d s o r p t i o np r o c e s so fn a v o n o i d si sah e a ta b s o r b i n gp r o c e s s ，弧dt 1 1 ep r o p e ri n c r e a s eo f t e m p e m t u i b e n e f i t s 山ei n l p r o v e m e mo fa d s o r p t i o n ，b u tt h ee 岱：c to fd i 行b r e n tt e m p e r a t u r e r a l l g ei sc h a n g e d t h eb r e a k t l l r o u 曲c l 肼e 啪sm e a s u r e db yt 1 ed y l l 锄i cm e m o d t h em o d e lo f b r e a k t l l r o u 曲c u r v e 邯e 咖b l i s h c db ya n a l y z i n ge x p e r i m e n t ，a n dm ee x p e r i m e 删d a t a c o i n c i d e d 喇t 1 1m o d e le q u a t i o nb y 丘n i n gt h e m t h ec o r r c l a t i o nc o e m c i c n to ft h er e g r e s s i o n e q u a t i o na l l i sa b o v eo 9 8 b ya i l a l y z 加gb r e 龇u 曲c u e ，t h cr c s u hd 锄o i l s n a t e dt h a t t h ea d s o r p t i o nw 够i m p r o v e db y1 0 wv e l o c i 劬b i gb e g i n l l i n gc o n c e n 仃a t i o i l ，p r o p e r t em 嘲锄i l r ea 1 1 d p r o p e rr a i l g e 1 m eo p i j 瑚u m 叩e r a t i o ni sg a i n e d ：t h cb e g i n n i l l g c o n c e n 仃a t i o no f 觑d s t o c ko 7 8 0 m g m l ，v e l o c 姆3 m l m i n ，m es i z eo fc o e c t ( 1 l i 曲， d i a m e t c r )1 2 3 c m ，t e m p e f a t u r e2 5 ，t h em o d e le q u a t i o n o fb r e a h h r o u g hc u n ，c s e x 一( 矧1 ”“ n ed c s o r p t i o np m c e s sw a sd i s c l l s s e di nt l l i sp a p c r t h em 牖r e n tc o n c e n n 吼i o n c l e a t l s i n gs o l v e n ta 1 1 dd j m 牝n tv e l o c 酊h a v el a 曙ee 丘b c to n 也em t eo f d 船o r p t i o n n o to n l y i st 量l er a t eo fd e s o r 州o nc o n s i d e r e d ，b u ta l s oi sm ed f b c to nt h el a t t e rp r o c e s sc o n s i d e r e d t h eo p 廿m 啪o p e r a t i o ni sg a i n e d ：a l c o h o lc o n c e n 灯a t i o n7 0 ，v e l o c 畸1 5 1 l m i i l ，r o o m 把m p e r a _ 【u r c k e yw o r d s ：b r e a k ( h r o u g l lc u e ，a d s o 单t i o ni s o t h e 蛳，m a c r o p o 蝌1 sa d s o r p t i o nr e s i n ， n a v o i l o i d ，a 1 1 a l 舛c a lm e 血o d i i i 郑重声明 本人的学位论文是在导师蒋元力教授指导下独立撰写并完成的，学位 论文没有剽窃、抄袭等违反学术道德、学术规范的侵权行为，否则，本人 愿意承担由此产生的一切法律责任和法律后果，特此郑重声明。 学位论文作者( 签名) ：鳓翻 年j ，月3 日 郑州大学硕士学位论文 引言 银杏的银杏f g i l l k g ob i l o b al 又名公孙树，白果) 系裸子植物门银杏科植物，有活 化石之称。银杏全身都是宝，集果用、叶用、材用、花粉用、防护用和观赏用于一身。 银杏的药用价值，我国古代就有记载。特别是自1 9 6 5 年德国科学家w s c h 础山e 首先 发现了银杏叶中含有降低胆固醇的有效成分以来，尤其是萜内酯这一重要的化学成分 仅为银杏所独有，很快在世界范围内形成了一股对银杏叶化学成分、药理药效与应用 方面研究的热潮。1 9 9 3 年，由中国林业出版社出版的中国果树志银杏卷内，记 载了我国各地已经应用的4 6 个品种，其中至少有1 0 个是已有大批嫁接植株的生产性 优良品种，如天目长籽，九甫长籽，佛指，扁佛指，野佛指，洞庭佛手，早熟大佛指， 鸭尾银杏，海洋皇等。 黄酮的提取有传统的溶剂提取，这种方法存在提取率低，黄酮类物质纯度低，溶 剂残留等问题。近几年研究用酶提取法，超声波、微波提取法，以及超临界提取法 等虽然有利于提取率的增加，但是提取物中的黄铜类物质的含量还有待提高。近来研 究很多的用吸附树脂提纯银杏提取物法，大大提高了提取物中黄酮类物质的纯度，更 多的研究放在了吸附、解吸工艺条件的优化，及其影响吸附解吸的操作因素等。 银杏黄酮采用树脂法精制银杏黄酮提取物提取工艺的研究，文献更多报道精制工 艺、树脂选择等，在探讨各类有效成分在树脂上的吸附模型，拟合必要的数学模型以 指导实际操作方面做的不多：其吸附过程的机理，动态操作过程的传质扩散参数都没 有相应的方法得到，这给树脂法精制银杏黄酮提取物的质量提高、工艺优化、工业化 带来很多的不便。本文通过测定不同条件下的穿透曲线，利用经验模型回归穿透曲线 方程，给吸附设备的设计工艺优化提供理论的基础。通过这些研究，对于优化生产工 艺，提高分离效果，充分利用中药材资源具有重要意义；尤其是为推广吸附纯化法应 用于中药制剂提供应用基础。 郏州大学硕士学位论文 第一章综述 1 1 - 银杏的分布分类及化学成分 1 1 1 银杏的分布分类 银杏( g i n k g ob i l o b al ，又名公孙树，白果) 系裸子植物门银杏科植物，有活化石 之称，是当今地球上最古老的树种之一，为我国特产，我国银杏资源拥有量占世界总 量的7 5 左右，占世界首位。它的生命力极强，从中生代的白垩纪晚期至新生代第 四纪( 距今约0 8 o 1 2 亿年) ，地球上气候发生巨变，1 5 0 余种银杏类植物几乎全部 灭绝，唯独银杏属中的银杏以强大的适应能力得以存活【2 】。银杏全身都是宝，集果用、 叶用、材用、花粉用、防护用和观赏用于一身。银杏的药用价值，我国古代就有记载， 本草纲目记载，白果可“入肺经、益脾气、定咳喘、缩小便、性平味甘苦涩，有 小毒”，可治哮喘、痰咳、白带、遗精、淋病、小便频数等。特别是自1 9 6 5 年德国科 学家w s c h w a b e 首先发现了银杏叶中含有降低胆固醇的有效成分以来，尤其是萜内酯 这一重要的化学成分仅为银杏所独有，很快在世界范围内形成了一股对银杏叶化学成 分、药理药效与应用方面研究的热潮【3 l 。 随着6 0 年代中期国际市场银杏产品的开发利用，我国自8 0 年代末以来，特别是 进入9 0 年代初期，银杏种植区域扩大到全国的2 5 个省市，几乎形成了全国的银杏种 植热。例如位于淮河上中游山丘区的河南新县、光山，安徽金寨、霍丘；沂河两岸的 山东郯城，江苏邳县；里下河地区的江苏泰兴、泰州：太湖流域的江苏吴县：天目山 系两侧的浙江长兴、富阳、临安，安徽宁国、宣城、绩溪、歙县。这些地方银杏分布 比较集中，经济效益较好，一般都呈点片状分布。现在中国特有的银杏已先后在日本、 朝鲜、英国、美国、法国等2 0 多个国家引种栽培，分布区域日益扩大。 银杏虽然在我国生长应用的历史悠久，但对银杏的分类要追溯到1 6 9 0 年欧洲的 植物学家凯普费，他率先提出了g i l l k g o 这个名称【4 】。当1 8 9 6 年h i r 私e 发现了银杏花 粉萌发时能产生具有鞭毛结构的能游动的精子，植物学家们才把银杏从紫杉科分出， 成为独立的科属种吼1 9 3 5 年，曾勉之研究了浙江省诸暨县的银杏，他根据银杏种子 和种核的形态特征，把银杏分为三个变种，每个变种又分为若干式，他除了扼要描述 记载了各个变种及各个式的特征及产地外，并编制了1 0 个的品种检索表1 6 】。何风仁 7 j 在曾勉之分类的基础上于1 9 8 9 年提出按银杏种核的长宽比例和两轴线的正交位置将 郑州大学硕士学位论文 银杏品种划分为长子类、佛指类、马铃类、梅核类、网子类，类下再划分出4 2 个品 种。1 9 9 3 年，由中国林业出版社出版的中国果树志银杏卷内，记载了我国各地 已经应用的4 6 个品种，其中至少有1 0 个是已有大批嫁接植株的生产性优良品种，如 天目长籽，九甫长籽，佛指，扁佛指，野佛指，洞庭佛手，早熟大佛指，鸭尾银杏， 海洋皇等。为了银杏资源的可持续发展，近几年开展银杏的育种工作，利用我国丰富 的银杏资源特别是古树资源开展杂交育种研究，有利于种质资源的保护和利用，有利 于增加森林生态系统的多样性，培育出更多的具有超亲优良性状的叶用、果用、材用、 花粉用和观赏用品种。 1 1 2 银杏叶中所含化学成分 银杏叶中成分很复杂，其主要的生物活性成分是黄酮类和萜内酯类，此外还有聚 戊烯醇类、多糖类、酚类化合物及多种微量元素和氨基酸。据不完全统计，从银杏叶 中分离出的化合物有1 7 0 多种。 1 1 2 1 黄酮类化合物 银杏叶中黄酮类化合物的含量因采集期和产地的不同而不同的。在不同的采集 期，总黄酮苷在5 月份含量最高，以后逐月下斛8 一，不同产地的银杏叶中黄酮类成 分也是有很大差异的，王弘等1 1 0 】测定了3 5 个产地银杏叶中3 种主要黄酮苷元即槲皮 素、三奈素、异鼠李素的含量，并以此换算出总黄酮的含量，得知江苏邳州、广西兴 安、贵州正安，湖北安陆等地的银杏叶中黄酮含量较高。 银杏叶中黄酮类化合物的含量较高，用紫外分光光度法测得我国泰兴银杏叶所含 黄酮类物质占5 9 l i l l 】，其中单黄酮主要为山奈素( k a e m p f e r 0 1 ) 和槲皮索( q u e r c e t i n ) 的单、双和三糖苷化合物，糖元多为葡萄糖和鼠李糖；其它的尚有异鼠李糖 ( i s o r h 舢鲥n ) 、杨梅黄素及芸香苷等。双黄酮类有穗花衫双黄酮( m n e n t o n a v o n e ) 、 白果素( b i l o b e t i n ) 、银杏双黄酮( g i l l k g e 曲) 、异银杏双黄酮及金松双黄酮等。此外 尚有儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素和表没食子儿茶素等4 种儿茶素类化合物【1 2 1 。 1 1 2 2 萜内酯类化合物 银杏叶中含有的银杏苦内酯和白果内酯均为其特有成分。银杏苦内酯为二萜类内 酯，现分离出银杏苦内酯a 、b 、c 、j 、m 等5 种，其中银杏苦内酯b ( b n 5 2 0 2 1 ) 的抗 血小板活化因子( p a f ) 活性最强；白果内酯为倍半萜内酯。 郑州大学硕士学位论文 1 1 2 3 聚戊烯醇类( p o l y p r e n 0 1 s ) 聚戊烯醇是指一系列顺式或反式的异戊烯基单元和终端异戊烯醇组成的一类类 脂化合物，以同系物的形式广泛存在于动植物体内，其中哺乳动物体内的聚戊烯醇称为 多萜醇( d o l i c h o l s ) 。在国外研究的基础上，国内有人从银杏叶中分离出7 种聚戊烯醇乙 酸酯，均为桦木聚戊烯醇型结构( b a m 诅p r e n 0 1 ) ，银杏聚戊烯醇的结构单元数为1 5 2 2 ， 认为具有广阔的药用开发前景 1 3 】。 1 1 2 4 多糖类 主要有淀粉、粘液质、葡聚糖等。黄桂宽掣1 4 】从银杏叶水提液中分离出银杏叶多 糖l g b p a 、b ，分子量分别为1 1 1 0 4 、2 x1 0 4 。多糖的单糖组成分别为d 葡萄糖、 l 鼠李糖、d 木糖。 1 1 2 5 酚类化合物 有白果酸等多种，这些成分在银杏果叶中含量较少。 1 1 2 6 其他成分 以确定结构的有聚异戊烯、6 一羟基犬尿喹啉酸、莽草酸、亚麻酸、a 一己烯醛、 b 一谷甾醇、芝麻素及原花色素等类。此外还含有蜡质( o 7 一1 0 ) ，多种微量元 素和氨基酸。 1 2 银杏叶中黄酮类化合物的性质、作用 1 2 1 黄酮类物质的物化性质1 5 1 6 】 黄酮类化合物早期是指具有乙一苯基毗喃酮结构的一类黄色素，现指以有色酮环 与苯环为基本结构的类化合物的总称。可以分类为黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类和 黄烷酮类等。 黄酮类化合物一般能溶于水、稀乙醇、乙酸乙酯等极性溶剂，难溶于乙醚、氯仿 和苯。从银杏叶中黄酮类化合物的特性来看，都是一些极性较大的分子，很易溶于极 性大的溶剂，而且黄酮苷因与糖分子结合而极性明显增大，甚至大到可以溶于水。黄 酮类化合物分子中甲氧基、甲基、不饱和烃基增多时，则降低其在极性溶剂中的溶解 度。分子中含有多个酚性羟基，故一般显弱酸性，在碱性溶液中，类黄酮易开环生成 查儿酮型结构而多呈黄色或橙色、褐色，在酸性条件下，查儿酮又恢复闭环结构，于 是成原色或颜色消失。 郑州大学硕士学位论文 t ) j 【( ) 图1 1 银杏叶中3 种主要单黄酮的结构图 r lr 2分子式 槲皮素q u e r c c t i n 山奈素k a e m p f 酹0 1 异鼠李素i s o r h a m n e t i i l 0 hh hh o c h th c 1 5 h l 0 0 7 c l s h l 0 0 6 c 1 6 h 1 2 0 7 槲皮素又栎精，槲皮黄素，分子式c 1 5 h l 0 0 7 ，二水化合物为黄色针状结晶( 稀乙 醇) ，在9 5 9 7 成为无水物，熔点3 1 4 ( 分解) ，l g 溶于2 9 0 m l 无水乙醇，2 3 m 1 沸乙醇，溶于冰醋酸，碱性水溶液呈黄色，几乎不溶于水，乙醇溶液味很苦。 h 。o ( ) i 、 图1 2 银杏叶中4 种主要双黄酮结构图 双黄酮r l r 2r 3 阿曼托黄素a r n 锄幻n a v o n c o h0 h0 h 白果黄素b i l o 砌no m e o h o h 银杏黄素g i n k g e t i n 0 m eo m eo h 异银杏黄素i s o g i n k g e t i n 0 m e0 ho m e 白果黄素( b i l o b e t i n ) 分子式为c 3 l h 2 0 0 】0 ，黄色针状结晶，2 4 5 2 5 0 软化， 约2 7 8 重新固化，最后在3 2 0 熔化分解，1 0 0 0 5 m m h g 加热两小时后，n l p ：3 4 5 3 4 7 。 银杏素( g i i l k g e t i n ) 又白果双黄酮，银杏黄素，分子式为c 3 l h 2 2 0 l o ，m p ：3 4 4 u v 8 o “。n m ( ) 2 1 2 f 7 6 0 0 0 ) ，2 7 1 5 ( 4 2 2 0 0 ) ，3 3 5 ( 4 0 0 0 0 ) 。 郑州大学硕士学位论文 异银杏黄素( i s o g i n k g e i i n ) 又异银杏双黄酮，分子式为c 3 2 h 2 2 0 4 ，黄色结晶，m p ： 3 4 9 3 5 1 ( 分解) 。 1 2 2 黄酮类物质的药理作用研究 近年来研究表明，银杏叶中存在着一种重要的生理活性物质。即黄酮类化合物 ( f l a v o n o i d s ) ，它们具有捕获游离基、抑制血小板活化因子( p a f ) 、促进血液循环及 脑代谢等功能。可用于治疗冠心病、心绞痛、增强记忆功能、治疗老年痴呆症和防止 皮肤病、脱发等多种疾病，同时还可用于研制口服液、保健品和化妆品等，应用范围 日益广泛。目前，用银杏叶提取物配制的护肤、护发等方面的产品达5 0 余种。此外， 利用银杏叶研制的银杏叶饮料、银杏桃果汁、银杏啤酒、银杏茶等保健品已在市场上 流通，并取得了良好效果。 1 2 2 1 清除氧自由基，帮助延缓衰老 银杏叶中的萜类和双黄酮类化合物在体外可抗小鼠肝细胞脂质过氧化、抗细胞坏 死和清除自由基。临床研究表明，给患者注射或口服银杏叶中的黄酮昔，血浆的抗自 由基容量均可增加。孙保亮等用总黄酮治疗蛛网膜下腔出血大鼠模型，发现血清 n o 含量升高，而脑组织中却明显的降低。该试验认为，总黄酮可改变血管内细胞源性 n o 合成和释放，通过清除自由基，增加脑血流量，阻止因缺血引起的n o 的过度释放。 1 2 2 2 抗炎镇痛作用 黄酮类化合物具有抗炎镇痛作用，在临床可用来治疗脓肿溃疡以及病原微生物引 起的炎症性疾病等，目前我国开发的新药中已有此类产品。 1 2 2 - 3 抑菌抗病毒作用 黄酮类物质的抑菌抗病毒作用已经得到医药界的肯定，关于这方面进行的研究较 多，如银杏黄酮、槲皮素、桑色素、山奈酚、木犀草素和杨梅黄酮等均有抗病原微生 物生长和抗病毒的作用。 1 2 2 4 舒张冠状血管，增加冠脉血流，防止心肌缺血，改善心脏功能 槲皮素、山奈酚及异鼠李素三种化合物具有扩张血管和解除痉挛作用。此外能扩 张血管，增加冠脉血液流量。k u b o t a 掣1 8 1 试验证实了银杏黄酮类物质导致血管舒张 的主要成分是槲皮素，它可以通过促进血管内皮细胞内钙离子浓度的升高，促进n o 的合成和释放，导致血管舒张。 6 郑州大学硕上学位论文 1 2 2 5 抗肿瘤作用 银杏黄酮可防护环磷酰胺的致畸作用，对体内外肿瘤细胞的增生均有抑制作用 【l9 1 。 1 - 2 2 6 抗辐射作用 电辐射作用于生物体引起产生的自由基容易使细胞结构损坏和功能的丧失，黄酮 类化合物因为具有抗自由基的作用因而具有抗辐射的能力。赵雪英等2 0 1 在研究槲皮素 抗辐射损伤试验中观测了5 0 c oy 射线照射人外周淋巴细胞的增殖以及小鼠骨髓d n a 和脾l p o 的含量，结果表明槲皮素可提高人外周淋巴细胞的辐射抗性，使受照小鼠 骨髓d n a 含量增加和脾l p o 含量降低，证明槲皮素具有一定的抗辐射作用。 1 2 2 7 黄酮类物质的其它作用 近几年的研究发现，槲皮素对影响人类健康的糖尿病有一定的作用。大量的试验 结果表明，糖尿病患者体内自由基升高与血糖有密切的关系，自由基升高，脂质过氧 化和低密度脂蛋白的氧化性改变，生物膜的稳定性降低，内容物释放攻击蛋白质，糖 化变性因素都参与糖尿病的进一步发展。采用炼尿佐菌素糖尿病大鼠每日腹腔注射槲 皮素2 0 0 m g k g 。能显著降低腹腔血糖水平，减少胰岛素用量，而且随着治疗时间的 延长，它的降糖作用逐渐增强，同时，它能显著降低糖尿病大鼠血清总胆固醇、甘油 三酯、脂质过氧化物含量【2 讲。 国外报道，银杏黄酮可作为雌激素受体调节器的部分，成为绝经后妇女雌激素 替代疗法的一种选择j ；另外g o l l i lk 等f 2 4 】研究了银杏黄酮在人膀胱癌细胞索给予 银杏黄酮后孵育，然后应用基因芯片研究m 砌q a 的表达，发现银杏黄酮影响了细胞 内转录，结果表现为增强了细胞的抗氧化能力，阻断d n a 的受损。 1 3 银杏叶中萜内酯的性质和作用 目前，从银杏叶中分离、鉴定出的萜内酯类化合物包括银杏内酯( g i n k 9 0 1 i d e a 、 b 、c 、j 、m ，属二萜类化合物) 和白果内酯( b i l o b a l i c l e ，属倍斗萜内酯) 两类口扎， 其中银杏内酯b 的生物学活性最强f 2 6 j 。 银杏内酯主要是二萜，首先由日本学者中香希尔于1 9 3 2 年从银杏叶中分离出来， 并确定了四种结构即银杏虑酯a 、b 、c 、m ；银杏内酯j 于1 9 8 7 年分离得到。通过采 用h - n m r 、c d 即其他物理手段和大量的化学反应，阐明了银杏内酯结构( 如图1 3 ) ， 这是一类含一叔丁基侧链，6 个五元环和螺 4 、4 】壬烷碳骨架化合物。研究表明，银 7 郑卅i 大学硕上学位论文 杏内酯结构中的羟基数目和位置对其抑制p a f 作用影响较大。 白果苦内酯a ( g i i l i 【9 0 l i d e a ) 又银杏内酯a ，分子式c 2 0 h 2 4 0 9 ，白色结晶，m p ： 3 0 0 。 白果苦内酯b ( g i n k g o l i d eb ) 又银杏内酯b ，分子式c 2 批4 0 1 0 ，白色结晶，m p ： 2 9 5 2 9 8 ，【b 】d = - 5 2 u ( e t o h ，c = 1 ) 。 白果苦内酯c ( g i r l 埏o l i d ec ) 又银杏内酯c ，分子式c 2 0 h 2 4 0 1 1 ，白色针晶 ( c h c l 3 一m e o h ) m p 3 0 0 ，【d 】d - 1 2 5 0 ( e t o h ，c = 1 ) ，味苦，溶于m e o h 。 白果苦内酯m ( g i n k g o l i d e m ) 又银杏内酯m ，分子式为c 2 0 h 2 4 0 1 0 ，n l p 2 8 0 ， 【d 】d - 3 9 0 ( d i o h ，c = 1 ) 。 图1 3 银杏内酯结构图 g i n k 9 0 l i d ea r 1 = r 2 = hr 3 = 0 h g i n k g o l i d eb r l = o hr 2 。hr 3 = o h g i l l l ( g o l i d ec r l = r 2 = r 3 = o h g i r l k g o l i d ej r l = hr 2 = i b = o h g i n k g o l i d emr l = r 2 = o h r 3 = h 银杏内酯是目前天然p a f 受体抗剂最有临床应用前景的药物，因其专属性，抗 血小板活化因子( p a f ) 作用倍受关注。 目前研究表明银杏内酯具有抗过敏、抗炎、抗休克作用，对缺血损伤和器官移植 排斥反应有保护作用，能够作用于血液循环系统、中枢神经系统、消化系统、泌尿系 统、生殖系统等。 1 4国内外提取精制银杏黄酮类物质方法状况 1 4 1 溶剂萃取法 关于银杏黄酮的提取溶剂有水，醇溶液、酮溶液等。水提取成本低，没有任何环 境污染，产品安全性高，但是水对有效成分的选择性差，提取率低。 丙酮提取法，用扯6 个碳原子的酮或酯反复萃取，得到g b e ，工艺采用中等温 r 郑州大学硕士学位论文 度5 0 6 0 浸泡，杂质较少，经浓缩、水析可除去烷基酚等脂溶性物质，用c c l 4 等非极性 溶剂萃取除去蜡质、叶绿素等脂溶性杂质，调节p h 8 9 或p b ( 0 h ) 2 沉降，可除去原花青 素、蛋白、高分子单宁等杂质，增加( n h 4 ) 2 s 0 4 等盐，增加相密度，有利于c 4 c 6 酮和醇 萃取有效成分和减少乳化现象，改善分层，提高有效成分的萃取率刚。谢慧明等闼根据 黄酮苷的物性选择丙酮，正丁醇，正丙醇，乙酸乙酯为萃取剂。单因素实验优选出正 丙醇为萃取黄酮苷的主萃取剂。对其进行改性，通过单因素实验和正交实验优化出： 水：正丙醇= 1 ：2 5 为萃取黄酮苷的较佳萃取剂。温度2 5 ，时间为l o m i n ，固液比= 1 5 ： 1 也1 0 0 m l ) 为其最佳萃取工艺参数。最后得到纯度 5 0 ，得率 8 0 的总黄酮苷产品。 田呈瑞等研究了乙醇浸提银杏叶黄酮的方法。通过单因素试验和正交试验，确定乙 醇提取银杏叶黄酮的最佳条件为：银杏叶粉碎至5 6 0 目，以7 0 乙醇按照液固比6 ： 1 的比例，于8 0 条件下提取2 次，1 h 次，银杏叶中总黄酮提取率可达8 7 6 。 1 4 2 醇( 酮) 提一铅化物沉淀法。 张永恒等f 3 田研究了乙醇回流提取银杏叶，浓缩液经蒸馏水提取，再经乙醚萃取，饱 和醋酸铅沉淀法，制备银杏叶黄酮苷原。 1 4 3 醇( 酮) 浸提一酮铵盐萃取法 梁红等【3 1 1 比较了不同溶剂提取银杏叶黄酮类化合物的效率，用7 0 的乙醇作为提 取溶剂，结合用3 的( n 风) 2 s 0 4 进行二次提取，提取液用饱和的( n h 4 ) 2 s 0 4 溶液两次浓 缩，黄酮的提纯效果非常明显。 1 4 4 醇( 酮) 提取一硅藻土过滤法 熊远福等i 弛1 对银杏叶总黄酮提取精制技术进行了研究。试验结果表明，在最佳浸 提条件：浸提剂乙醇7 0 ，银杏叶与浸提剂用量比l ：5 ，浸提时间3 5 h ，6 0 下浸提2 次，最佳精制条件为：每1 0 0 9 银杏叶用硅藻土2 5 9 ，丙烯酸树脂8 0 9 ，洗脱剂乙醇浓 度7 0 ，应用该工艺条件进行浸提与精制，精品收率 2 2 5 ，总黄酮含量达2 8 8 。 以上方法获得的银杏叶提取物精品虽然总黄酮( 或黄酮苷) 含量较高，但由于使用了卤 代烃、甲苯和铅化物等有毒物质，残留在产品中，影响产品质量，安全性低。 1 4 5 吸附树脂提纯g b e 法 关于吸附树脂提纯曲e 的报道很多，可用于提纯g b e 物质的主要有聚苯乙烯、 聚酰胺吸附树脂、活性碳、硅胶、大孔树脂以及硅藻土等。麻秀萍等m 人通过对1 0 种树脂的筛选实验发现，弱极性树脂a b - 8 ( 天津南开大学化工厂产品) 对银杏黄酮 郑州大学硕士学位论文 具有良好的吸附性，吸附量达到1 2 8 m g 幢湿树脂，用9 0 乙醇洗脱解吸率可达9 7 9 ( 2 0 度) 。王成章等d 4 1 对黄酮含量较低的银杏叶的提取和纯化进行了研究，研究了不 同的浸提溶剂( 水、甲醇、乙醇、丙酮) 、浸提温度( 室温、4 0 0 5 0 0 、6 0 0 7 0 0 ) 、 浸提时间对黄酮浸出率的影响，在以6 0 一7 0 的乙醇为浸提剂，液固比为8 ：1 6 ： 1 ，6 0 7 0 热浸泡，3 1 h 两次，可以使黄酮的浸出率高达约8 5 ，选用a - l 和a - 2 混合 树脂吸附分离，可以制得高含量的银杏黄酮苷。吉云秀等f 3 5 】用3 5 乙醇热提过滤，氨 水调节p h 8 5 后离心去杂，后用树脂d 1 叭( 天津制胶厂) 吸附，7 0 乙醇洗脱回收 乙醇，浓缩干燥的银杏黄酮类化合物精提物，黄酮类物质的含量为2 6 2 ，黄酮类化 合物的收率为6 4 4 。吴梅林等【3 6 】研究了a b 8 、x 5 、s i p 一1 3 0 0 等三种大孔吸附树脂 分离纯化银杏总黄酮工艺，并讨论了对银杏内酯的影响，以总黄酮和内酯的吸附率和 解吸率为指标，采用静态吸附和动态吸附对银杏总黄酮和内酯分离纯化工艺进行优 化，结果表明a b _ 8 适合银杏总黄酮纯化，工艺条件为p h = 5 ，流速为1 0 m l m i n 1 ， 树脂用量与吸附液之比为l ：i o ，7 0 乙醇作为洗脱剂为理想条件。 大孔吸附树脂在分离、纯化中药提取液方面已日益显示其独特的效果，它有着广 阔的应用前途，不仅为中药制剂质量控制和中药现代化研究提供更有效、可靠的纯化 手段，更重要的是能改善传统中药制剂“粗、大、黑”的外观和服用量过大等缺点， 对中药制剂的革新起积极的推动作用。但由于应用大孔吸附树脂分离、纯化中药有效 成分的时间不长，用来制备中药复方制剂则还刚刚起步，目前对于它的研究还不够深 入，因此，它的应用还有一个不断发展完善的过程，对存在的一些问题需要我们作进 一步探讨和解决。 当前应加强以下几个方面的工作：( 1 ) 大孔吸附树脂纯化不同中药有效部位的特性 研究，寻找具有指导意义的吸附特性参数；( 2 ) 探讨各类有效成分在树脂上的吸附模型 ( 多分子层吸附或单分子层吸附) ，拟合必要的数学模型以指导实际操作；( 3 ) 考察影 响吸附和解吸附的各种可能因素；“) 加强工业生产上的放大试验研究。通过这些研究， 对于优化生产工艺，提高分离效果，充分利用中药材资源具有重要意义；尤其是为推 广吸附纯化法于中药制剂提供应用基础。 1 4 6 超临界流体萃取法 超临界流体是最近几年才发展起来的一种新技术，超临界萃取和传统的溶剂萃取 相比，超l l 每界萃取在3 5 4 0 进行操作，以c 0 2 为萃取介质，具有溶质、溶剂易于分离， l o 郑州大学硕士学位论文 萃取速度高等优点，特别适用于提取或精致热敏性和易氧化的物质。由于所用的萃取剂 是气体，容易除去，所得产品无残留毒性，这种方法适用与医药和食品工业。陈从贵等【3 ” 等研究了银杏叶药用成分的超临界c 0 2 萃取不仅技术可行，而且对银杏总内酯、羟基 酚等药用成分有明显的分离能力。 1 4 7 酶法提取 王晖等 3 8 】研究了银杏黄酮的酶法提取工艺，银杏叶原料经纤维素酶预处理后浸 提，总黄酮得率显著提高，得率达到2 o l 。酶解过程的最优参数为料液中酶浓度为 o 1 2 5 l ，酶与底物配比为l ：2 0 0 0 ，酶解温度4 5 ，自然p h 值，酶解时间2 h 。吴 梅林等圳建立了酶解法与醇提取相结合的提取工艺，获得较好的效果，用酶解预处理 后，再用乙醇提取银杏总黄酮的得率比直接醇提提高了1 8 9 。 1 4 8 超声波、微波提取法 近年来超声技术用于提取植物种的药效成分成为研究的一个方向。研究表明，利用 超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，都可以加速药物 有效成分进入溶剂，从而提高提出率，缩短提取时间，并且免去高温对提出成分的影响。 微波法微波技术是一种新的、有发展前景的新工艺，微波技术在提取植物有效成份 中的应用，近年来得到了很大发展。微波具有穿透力强、选择性高、加热效率高等特点。 微波辐射( m w i ) 可以大大加快反应速度，反应时间以分、秒计。微波技术利用溶质在水 相和胶束相中的分配差异进行分离。王延峰等【帅1 研究银杏黄酮超声提取法，结果表明 比连续回流效果好。曾里等【4 ”研究了以银杏叶为原料用微波加热的方法提取黄酮，与 传统提取法对照，结果表明微波法提取效率高，省时间，提高了提取率。 1 5 国内外银杏黄酮含量分析方法状况 1 5 1 分光光度法 前几年，国内使用较广的是分光光度法，其测定过程是把被测样品用7 0 乙醇 溶解，经n a n 0 2 ，m ( n 0 3 ) 3 络合后，以芦丁为标准溶液，在u v 5 1 0 姗