（法医学专业论文）自噬对脑外伤引起的神经细胞死亡及神经功能障碍的影响.pdf

自噬对脑外伤引起的神经细胞死亡及神经功能障碍的影响中文摘要中文摘要目的：研究自噬溶酶体途径对脑外伤后神经细胞死亡和神经功能障碍的影响并探讨其相关机制。方法：建立小鼠定量脑外伤( t r a u m a t i cb r a i ni n j u r y , t b i ) 动物模型，运用影响自噬体成熟的工具药3 甲基腺嘌呤( 3 - m e t h y l a d e n i n e ，3 - m a ) 、布雷菲德菌素( b r e f e l d i n a ，b f a ) 侧脑室( 1 a t e r a lc e r e b r a lv e n t r i c l e ) 注射给药，对3 - m a 组、b f a组及生理盐水对照组用p i 标记和体视学方法观测损伤区及其周边区( 皮层与海马)神经细胞死亡情况，通过连续切片苏木精染色和体视学软件测量脑缺损体积( 1 e s i o nv o l u m e ，l v ) ，并通过行为学试验方法( m o t o rt e s t 和m o m sw a t e rm a z e ) 检测t b i引起的神经功能障碍，研究自噬对t b i 引起的神经细胞死亡和神经功能障碍的影响；同时应用免疫组织化学和免疫印记法检测损伤侧的脑皮质与海马中自噬溶酶体途径及凋亡信号通路相关蛋白c a t h e p s i n - b ，l c 3 ，b e c l i n - 1 ，c a s p a s e - 3 ，b c l - 2 ，b a x 的表达情况，研究自噬溶酶体途径影响t b i 引起的神经细胞死亡和神经功能障碍的可能机制。结果：( 1 ) p i 阳性细胞计数：t b i 后1h 和6h ，3 - m a 组与生理盐水组p i 阳性细胞数均开始逐渐增加，1 2h 后明显增加，但两组之间无统计学差异，2 4h 阳性细胞数达高峰，且两组的p i 阳性细胞数有统计学差异( p 0 0 5 ) ，t b i 后4 8h组仍有大量的p i 阳性细胞，但3 - m a 组与生理盐水组比较无统计学差异；同样，b f a 组与生理盐水组比较，t b i 后2 4h ，两组的p i 阳性细胞数有统计学差异( p 0 0 5 ) 。( 2 ) l v 检测：与生理盐水组比较，3 - m a 组、b f a 组脑外伤后l v 显著减小( p 0 0 5 ) ；( 3 ) 行为学检测：与生理盐水组比较，3 - m a 组和b f a 组在t b i后2 4h 均能改善运动功能( p o 0 5 ) ，4 8h 以后差异不显著；3 - m a 组在t b i 后7d到1 0d 能改善学习记忆能力( p 0 0 5 ) ；( 4 ) 蛋白表达检测：t b i 后2 4h 和4 8h ，3 - m a 组相对与生理盐水组c a t h e p s i n - b ，c a s p a s e 3 表达减少( p o 0 5 ) ，b e c l i n - 1 b c l 2 的比值减小( p o 0 5 ) ，b c l 2 b a x 的比值增大( p o 0 5 ) ；与生理盐水对照组比较，t b i 后2 4h 和4 8hb f a 组l c 3i i l c 3i 的比值减小( p o 0 5 ) 。结论：1 自噬溶酶体途径参与了t b i 后的病理生理过程。阻滞自噬体形成可以减少自噬对脑外伤引起的神经细胞死亡及神经功能障碍的影响中文摘要t b i 引起的神经细胞死亡和脑组织缺损体积，并改善运动和学习记忆功能。2 自噬溶酶体途径通过影响细胞凋亡信号通路来调节t b i 引起的神经细胞死亡和神经功能障碍。关键词：脑外伤；自噬；调亡；3 - m a ；b f a ；神经功能障碍l i作者：张运阁指导老师：陶陆阳教授自噬对脑外伤引起的神经细胞死亡及神经功能障碍的影响英文摘要t h ec o n t r i b u t i o no fa u t o p h a g yp a t h w a yt on e u r o n a lc e l ld e a t ha n dn e u r o n a ld y s f u n c t i o n si nm i c ea f t e rt r a u m a t i cb r a i ni n ju r ya b s t r a c to b j e c t i v e ：t h ep r e s e n ts t u d yw a ss o u g h tt os t u d yt h ec o n t r i b u t i o n ：o fa u t o p h a g y l y s o s o m a lp a t h w a yt on e u r o n a lc e l ld e a t ha n da n dn e u r o n a ld y s f u n c t i o n sa f t e rt r a u m a t i cb r a i ni n j u r y , a n dt oe x p l o r ei t sr e l e v a n tm e c h a n i s m s m e t h o d s ：t r a u m a t i cb r a i ni n j u r y ( t b i ) m o d e li nm i c ew a se s t a b l i s h e dq u a n t i t a t i v e l y m i c ew e r ep r e t r e a t e d 、i 廿1l a t e r a lc e r e b r a lv e n t r i c l ei n f u s i o no ft w oa u t o p h a g i ci n h i b i t o r3 - m e t h y l a d e n i n e ( 3 - m a ) a n db r e f e l d i na ( b f a ) t b i i n d u c e dc o r t i c a la n dh i p p o c a m p a ln e u r o n a lc e l ld e a t hw a se v a l u a t e db yi n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o no fp r o p i d i u mi o d i d e l e s i o nv o l u m ew a se s t i m a t e db yc a m p e a c h yd y e i n ga n ds t e r e o l o g ym i c r o s c o p i co b s e r v a t i o n ，a n das u b s e to fm i c ew e r cs t u d i e db e h a v i o r a l l y( m o t o rt e s ta n dm o r r i sw a t e rm a z e ) i no u rs t u d yt od e t e c tm o t o ra n dc o g n i t i v ef u n c t i o no ft h ei n j u r e da n i m a l sp o s t - t b i b yi m m u n o f l u o r e s c e n c e ，s t e r e o l o g ym i c r o s c o p i co b s e r v a t i o na n dw e s t e r nb l o ta n a l y s i s ，c h a n g e so fp r o t e i ne x p r e s s i o ni na u t o p h a g y l y s o s o m a lp a t h w a ya n da p o p t o s i ss i g n a lp a t h w a yw e r ed e t e c t e d ：c a t h e p s i n - b ，l c 3 ，b e c l i n - 1 ，c a s p a s e - 3 ，b c l 一2 ，a n db a xi ni n j u r i e dc o r t e xa n dh i p p o c a m p u sa f t e rt b i ，a n dt r yt os t u d yt h ep o s s i b l ec o n t r i b u t i o no fa u t o p h a g y l y s o s o m a lp a t h w a yt on e u r o n a lc e l ld e a t ha n da n dn e u r o n a ld y s f u n c t i o n sa f t e rt b i r e s u l t s ：( 1 ) p ip o s i t i v ec e l lc o u n t s ：p i - p o s i t i v ec e l l sw e r ef o u n ds t a r t i n gf r o m1ha n d6ha f t e rt b ia n di n c r e a s e dr a p i d l ya t12h ，p e a k e da t2 4l l ，b u td e c r e a s e df r o m4 8h t h en u m b e ro fp ip o s i t i v ec e l l si n3 - m ao rb f ag r o u pw a ss i g n i f c a n t l yd i f f e r e n tf r o mt h a ti ns a l i n eg r o u pa t2 4hr e s p e c t i v e l y 口 0 0 5 ) ( 2 ) l e s i o nv o l u m em e a s u r e m e n t s ：t h el e s i o nv o l u m ew a so b v i o u s l yr e d u c e di n3 - m ao rb f at r e a t e dg r o u p sc o m p a r e dw i t ht h es a l i n eg r o u p 口 0 0 5 ) ( 3 ) p r a x i o l o g ye x p e r i m e n t ：3 - m aa n db f ac o u l di i i自噬对脑外伤引起的神经细胞死亡及神经功能障碍的影响英文摘要s i g n i f i c a n t l ya 牡e n u m e dm o t o rd y s f u n c t i o n sr e s p e c t i v e l yi n2 4hp o s t - t b ip o 0 5 ) ，b u ti tw a sn o to b v i o u s l yd i f f e r e n tf r o mt h a ta tl a t e rt i m es t a g e s ；3 - m ac o u l ds i g n i f i c a n t l ya n e n u a t e dl e a r n i n ga n dm e m o r yd y s f u n c t i o n sf r o m7dt o10dp o s t - s u r g e r yc a m p a r e dw i lt h a ti ns a l i n eg r o u p ( p 0 j 0 5 ) ( 4 ) p r o t e i ne x p r e s s i o n ：i n3 - m ag r o u p ，t h em e a nr a t i o so ft h eb a n di n t e n s i t i e so fc a t h e p s i n - b ，c a s p a s e - 3 ，b e c l i n 一1 b c l - 2s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d 0 0 5 ) a n das i g n i f i c a n tr e c o v e r yo fb c l - 2 b a x ( p 0 0 5 ) w a so b s e r v e da t2 4ha n d4 8 h p r e t r e a t m e n tw i t hb f ar e s u l t e di nas i g n i f i c a n td e c r e a s eo fl c 3 - i i l c 3 - il e v e l sf r o m2 4ht o4 8h ( p 0 0 5 ) c o n e l u s i o n s ：1 & u t o p i a a g y l y s o s o m a lp a t h w a yi n v o l v e di nt h ep h y s i o p a t h o l o g i cc o u r s eo fp o s t - t b i b l o c k a g eo fa u t o p h a g y l y s o s o m a lp a t h w a ya t t e n u a t e dt b i - i n d u c e dn e u r o n a lc e l ld e a t h , d e c r e a s e dl e s i o nv o l u m e ，a n di m p r o v e dm o t o ra n dc o g n i t i v ef u n c t i o n s 2 a u t o p h a g y l y s o s o m a lp a t h w a yr e g u l a t e dt h et b i - i n d u c e dn e u r o n a lc e l ld e a t ha n dn e u r o n a ld y s f u n c t i o nb yi n f l u e n c i n ga p o p t o s i ss i g n a l i n gp a t h w a y k e yw o r d s ：t r a u m a t i cb r a i ni n j u r y ；a u t o p h a g y ；a p o p t o s i s ；3 - m a ；b f a ；n e u r o n a ld y s f u n c t i o n si vw r i t t e nb yz h a n gy u n g es u p e r v i s e db yt a ol u y a n gp r o f e s s o r自噬对脑外伤引起的神经细胞死亡及种经功能障碍的影响缩略词寝t b l3 m ab 弧鹏轻l c 3。p b st b sc v tm 即s d sp 1 3 kp c d感sa p a f - 1t o rc m ap eb h l缩略词表t r a u m a t i cb r a i ni n j u r y3 - m e t h y l a d e n i n eb r e f e l d i naa u t o p h a g y - r a l a t e dm i c r o t u b u l e - a s s o c i a t e dp r o t e i n1l i g h tc h a i n3p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n et r i e t h a n o l a m i n e b u f f e r e ds a l i n es o l u t i o nc y t o s o lt ov a c u o l et a r g e t i n gp a t h w a ym i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r ep h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 3 k i n a s ep r o g r a m m e dc e l ld e a t ha u t o p h a g i ev a c u o l e sa p o p t o s i sp r o t e i n - a c t i v a t i o nf a c t o r1t a r g e to fr a p a m y c i nc h a p e ro n e - m e d i a t e da u t o p h a g yh o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n eb c l 一2h o m o l o g yd o m a i n 一17 4苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个入或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的爵究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。研究生签名：童趱。篷1 e t期：三z ：生! 王学位论文使用授权声明苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括谢登) 授权苏州大学学位办办理。研究生签名：导师签名：代仉|i期：自噬对脑外伤引起的神经细胞死亡及神经功能障碍的影响前言皇上j 一月| j吾一、本课题研究的理论基础及国内外研究现状1 研究自噬与凋亡在脑外伤中作用的重要性脑外伤( t r a u m a t i cb r a i ni i l j u r y ，t b i ) 后受损组织细胞及其产生的自由基引发许多基因表达，一些基因产物作为特定的信号通路介导炎症反应或使某些细胞游向受损部位而产生一系列效应，这些效应导致二次损伤以及神经元死亡，进而导致脑功能的丧失。当今公认的细胞死亡方式分为坏死和程序性细胞死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ) ，而程序性细胞死亡又可分为两种，i 型为细胞凋亡( a p o p t o s i s ) ，i i 型是自噬性细胞死亡( a u t o p h a g y ) 【1 1 ，后者是主要有溶酶体酶( 1 y s o s o m a le n z y m e s ) 激活来执行的，程序性细胞死亡的两种方式在脑外伤后均可发生已经被确证 2 - r l ，但两者之间相互存在的关系还不清楚。最新研究证明，凋亡和自噬相互依赖，在成鼠的外周神经细胞破坏之后，树突细胞显示出凋亡性细胞死亡的超微结构特征，而膜结合细胞质细胞器自噬的典型特征，也是在这些细胞的细胞质中被发现的【8 】。另据报道，酵母中b a x 的表达诱导的细胞死亡，同时具有凋亡和自噬的特征，类固醇的c 嬲p m e 依赖的运动神经元细胞死亡，也展现出自噬和凋亡的混合特征【9 1 0 1 。因此，抑制白噬溶酶体可能对凋亡也会产生影响，保护神经元是临床治疗脑外伤的重要措施，应用药物作用于细胞死亡程序中的上游靶位或多个靶点，对程序性死亡的双途径都产生作用，才有希望纠正脑外伤后引起的多种病理机制对神经细胞的破坏，使之恢复正常，从而产生综合治疗效应。自噬与凋亡的关系在脑外伤中的研究意义非常重大，一是在于它本身诱导自噬性细胞死亡方面和与凋亡信号之间的交互作用方面；二是自噬可能在受损神经细胞中激活一些凋亡的启动因子，诱导细胞凋亡程序的启动。自噬与调亡的关系涉及有关脑外伤后细胞死亡生存机制的调节，因此它在脑外伤后神经细胞损伤和修复过程中的作用是值得研究的重要课题。2 程序性细胞死亡程序性细胞死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，p c d ) 是有机体在漫长的进化过程中发展起来的细胞自杀机制，在清除无用的、多余的或癌变的细胞，维持机体内环自噬对脑外伤引起的神经细胞死亡及神经功能障碍的影响前宦境稳态方面发挥重要作用。程序性细胞死亡调控机制的失调与多种疾病的发生发展相关，如神经变性性疾病、自身免疫病、恶性肿瘤、衰老、病原微生物感染、肌细胞功能失调等。1 9 9 0 年，c l a r k e 将细胞死亡分为四类( 图1 ) ：第一类是凋亡性的程序性细胞死亡( t y p eip r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，a p o p t o s i s ) ，典型特征是细胞皱缩，染色质聚集，核d n a 降解，细胞形成凋亡小体，c a s p a s e 被活化，残余的细胞被吞噬细胞的溶酶体消化。第二类是自噬性程序性细胞死亡( a u t o p h a g i ec e l ld e a t h ，t y p ei ip r o g r a m m e dc e l ld e a t h ) ，典型特征是出现双层膜的自噬小泡，自噬小泡中包裹细胞内蛋白质或细胞器。另外两类为坏死( n e c r o s i s ) 和细胞质型降解性死亡( c y t o p l a s m i cd e g r a d a t i o n ) 。近年来有研究者发现坏死也可以是程序性的，称为程序性坏死( n e c r o p o p t o s i s ) j u n y i n gy u a n 。凋亡和坏死经过多年研究，其发生过程及通路较为清楚，而自噬性细胞死亡是近几年的研究热点。程序性坏死和细胞质型降解性死亡还没有研究工具开展机制性研究。所以，我们将研究内容聚焦在自噬在t b i 后神经细胞死亡修复的功能上。c e t l d e a t hf i g 1 细胞死亡方式示意图2 1 自噬体的起源及发生过程自噬是真核细胞中的降解再循环系统1 1 。1 3 1 ，是广泛存在于所有真核细胞内的一种生理现象，早在1 9 6 2 年a s h f o r d 和p o r t e n 就提出了自噬现象的存在【1 4 】，但直至近十年，随着酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 模型的建立和基因技术的发展，有关自噬的研究才逐渐深入开展起来。在形态学上，即将发生自噬的细胞胞浆中出现大量游离的膜性结构，称为前自噬泡( p r e a u t o p h a g o s o m e ) 。前自噬泡逐渐发展，成为由双层膜结构形成的空泡，其中包裹着变性坏死的细胞器和部分细胞浆，这种双层膜被称为自噬泡2自噬对脑外伤引起的神经细胞死亡及神经功能障碍的影响前言( a u t o p h a g o s o m e ) 。自噬体双层膜的起源尚不清楚，有人认为其来源于粗面内质网，也有观点认为来源于晚期高尔基体及其膜囊泡体，也有可能是重新合成的。自噬泡的外膜与溶酶体膜融合，内膜及其包裹的物质进入溶酶体腔，被溶酶体中的酶水解。此过程使进入溶酶体中的物质分解为其组成成分( 如蛋白质分解为氨基酸，核酸分解为核苷酸) ，并被细胞再利用，这种吞噬了细胞内成分的溶酶体被称为自噬溶酶体( a u t o p h a g o l y s o s o m e 或a u t o l y s o s o m e ) 。尽管在进化过程中，底物运送到溶酶体的机制发生了变化，自噬本身却是一个进化保守的过程。与其它蛋白水解系统相似，溶酶体参与了细胞内组成成分的持续性转运和翻新( 尤其是长半衰期蛋白质的分解和再利用) 。在自噬过程中，除可溶性胞浆蛋白之外，像线粒体、过氧化物酶体等，细胞器或细胞器的一部分，如高尔基体和内质网的某些部分都可被溶酶体所降解；最近，有研究发现，酵母细胞核的某些区域也可通过自噬途径被清除【1 5 。1 8 1 。一般认为细胞中的短寿命蛋白质通常通过泛素一蛋白酶体途径消化，而大多数组成细胞物质的长寿命蛋白质必须通过后一种途径形成自噬体，将待降解物质运输到溶酶体内消化。根据细胞物质到达溶酶体腔的途径不同，自噬可分为三种形式：大自噬( m a c r o a u t o p h a g y ) ，小自噬( m i c r o a u t o p h a g y ) 和分子伴侣介导的自噬( e h a p e ro n e - m e d i a t e da u t o p h a g y , c m a ) 【1 9 1 。大自噬是自噬发生的最普遍的形式，它首先形成一个包含部分细胞质或细胞器的双层膜囊泡( 即自噬体) ，然后自噬体靶向到达溶酶体或酵母空泡，其外层膜与它们的膜融合，释放内部的单层膜囊泡( 即自噬小体) 进入溶酶体或空泡内发生降解，使自噬小体所包含的成分得以循环【2 0 】。小自噬是特征较少的过程，主要是通过溶酶体或空泡的膜内陷来分隔一小部分细胞质，最终进入溶酶体或空泡内发生降解，此过程中细胞质在溶酶体或空泡的表面直接被摄取【2 l 】。c m a 与大自噬和小自噬不同，它并不发生囊泡转运，胞质内的某些特定蛋白先被一个分子伴侣复合物识别，如热休克蛋白7 0 ( h e a ts h o c kc o g n a t ep r o t e i no f 7 0 k d ，h s p 7 0 ) ，再识别溶酶体膜上受体( 1 y s o s o m ea s s o c i a t e dm e m b r a n ep r o t e i nt y p e2 ，l a m p 2 ) 后，被转运到溶酶体腔中被溶酶体酶消化。c m a 的底物都是可溶的蛋白质分子。胞质中有3 0 的蛋白质有一个识， u h s p 7 0 的五肽序列，它们可由c m a 形式被降解圈。2 2 自噬过程的分子机制目前至少已经鉴定出2 7 种参与酵母自噬的特异性基因，另外还有5 0 多种相自噬对脑外伤引起的神经细胞死亡及神经功能障碍的影响前言关基因。其命名从最初称为a p g ，a u t 和c v t ，现已被统一命名为酵母自噬相关基因a t g ( a u _ t o p h a o _ y r e l a t e d ) 。( 图2 ) 哺乳动物自噬相关基因也已由最初的a t g a p g a u t c v t ，统一命名为a t g 。哺乳动物自噬基因的命名与酵母相似，但也有个别差异，如酵母的a t g 8 在哺乳动物称为l c 3 ，酵母的a t g 6 在哺乳动物则称为b e c l i n - l 。随着研究的深入，许多酵母中自噬相关基因的同源物均已在哺乳动物中找到，并分离鉴定成功，这说明白噬是一个进化保守的过程，其分子机制从酵母到哺乳动物十分相似。1ysosomec l a s s 啪p 1 3k i n a s ef i g 2 ：自噬溶酶体形成过程2 2 1l c 3 与自噬：微管相关蛋白1 轻链3 ( m i c r o t u b u l ea s s o c i a t e dp r o t e i n1l i g h tc h a i n3 ，m a p i - l c 3 ) ，分子量为1 5 k d ，是酵母a t 9 8 ( a p 9 8 a u t 7 c v t 5 ) 在哺乳动物中第一个被鉴别出的类似物，与酵母a t 9 8 有2 8 的氨基酸同源，最初被鉴定为大鼠脑中作为微管相关蛋白1 a 和l b 的一条轻链，它是自噬体形成及胞浆到空泡靶向( c y t o s o lt ov a c u o l et a r g e t i n gp a t h w a y ，c v t ) 囊泡必需的蛋白【2 3 2 6 1 。l c 3 定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是细胞自噬泡膜的通用标记物。目前，已有三种亚蛋白在人的组织中被鉴别出来，即l c 3 a 、l c 3 b 及l c 3 c 2 7 之8 】。同酵母中的a t 9 8系统一样，l c 3 的羧基末端区域被哺乳动物的a t 酣( m a t 9 4 ) 一种半胱氨酸蛋白酶的同系物分开，此加工的形式即l c 3 i ，它在羧基端有甘氨酸残基( 羧基端缺少2 2 个氨基酸) ，存在于胞质溶胶中。经由哺乳动物a t 9 7 ( m a t 9 7 ) 和a t 9 3 ( m a t 9 3 )_ e 1 和e 2 样酶的同系物激活后，l c 3 i 的亚群( s u b p o p u l a t i o n ) 进一步被修饰为另一种形式即l c 3 i i ，l c 3 i i 共价结合在磷脂酰乙醇胺( h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ，p e ) 的羧基端，并且牢固地结合在自噬体膜上，其与a t 9 8 系统中的p e 结合形式极其相似。l c 3 i 到l c 3 i i 的基因转变在有效诱导自4自噬对脑外伤引起的神经细胞死亡及神经功能障碍的影响前言噬的饥饿状态( 没有氨基酸和血清) 的细胞中显著增强。由于l c 3 i i 局限在自噬体膜( 内膜及外膜) 上且l c 3 i i 的量与自噬体的量呈正相关，现在被广泛地用作监测哺乳动物中的自噬活性和检测自噬体形成的关键分子【2 2 1 。2 2 2b e c l i n - 1 与自噬：哺乳动物b e e l i n 1 是酵母a p 9 6 v p s 3 0 基因的同源物，i 型磷脂酰肌醇3 磷酸激酶( p h o s p h a t i d y le t h a n o l a m i n ec l a s s l i i3p h o s p h o k i n a s e ，c l a s s l i ip 1 3 k ) 可与b e c l i n - 1 形成复合物参与自噬体的形成【3 3 】，z h e n y uy u e 等人应用b e e l i n - 1 基因敲除小鼠的胚胎干细胞研究指出：b e c l i n 1 - 小鼠死于胚胎早期，b e c l i n - 1 + 1 - 小鼠虽然表型正常，但其自发性肿瘤发生的频率却很高，说明b e e l i n 1 是一个重要的肿瘤抑制基因，其杂合性缺失是细胞发生恶性转化的原因之一。近一步的研究指出，b e e l i n 1 - - 小鼠自噬缺陷，细胞凋亡正常，说明b e c l i n 1是自噬的调控基因【3 4 】。因此，通过免疫印记检测b e c l i n 1 的表达水平，结合其他生化指标，可对细胞的自噬活性进行动态监测和判断。双杂交筛选试验证明b e e l i n - 1 是b e l 2 相互作用的一个蛋i 兰t 3 5 1 。研究表明b e e l i n - 1 与凋亡抑制蛋白b c l 2一结合可以抑制自噬并诱导肿瘤的发生【3 6 j 。人乳腺癌细胞m c f 7 的b e c l i n - l 表达减少或消失，超表达b e c l i n - 1 可加强血清和氨基酸撤除诱导的自噬，说明b e c l i n 1是自噬重要的正调节因子【韧。由于自噬过程就需要b e e l i n - 1 b c l 2 蛋白复合体的解聚以及游离的b e c l i n - 1 与i i i 型p 1 3 k 结合来启动其他自噬相关蛋白的聚集，因此，b e c l i n = l b c l - 2 的比值才能真正反映对自噬的调节作用。2 2 3 组织蛋白酶与自噬：真核细胞内主要有两种降解途径，即蛋白酶体途径和溶酶体途径。超过9 0 的长寿命蛋白和某些细胞质、细胞器都是通过溶酶体途径发生降解的。溶酶体降解途径主要有胞浆空泡靶向途径( t h ec y t o s o lt ov a c u o l et a r g e t i n gp a t h w a y , c v t ) ，空泡内转运降解途径( v a c u o l a ri m p o r ta n dd e g r a d a t i o np a t h w a yt h ev a c u o l a ri m p o r ta n dd e g r a d a t i o np a t h w a y , v i d ) 和自噬途径。如前所述，自噬的发生与溶酶体息息相关。溶酶体蛋白降解系统中有一组参与细胞代谢、肽链合成及蛋白降解的蛋白水解酶，它们被称为组织蛋白酶( c a t h e p s i n s ) p 引。组织蛋白酶分为两大类，一类包括半胱氨酸蛋白酶类，如c a t h e p s i n - b 、l 、h 、k 、s ，另一类包括天冬氨酸蛋白酶类如c a t h e p s i n d ，e 。其中c a t h e p s i n - d 可激活c a h t e p s i n b ，h ，l 的酶原形式1 3 9 。c a t h e p s i n s 在许多生理过程如蛋白降解、抗原呈递、骨的重吸收及激素的加工中均起着重要的作用。f e l b o r 等报道，缺乏c a t h e p s i n b和c a t h e p s i n - l 的小鼠表现出神经元丢失、脑萎缩及皮层神经元溶酶体包涵体的出自噬对脑外伤引起的神经细胞死亡及神经功能障碍的影响前言现，证明c a t h e p s i n - b 和c a t h e p s i n l 在维持中枢神经系统正常功能方面具有重要作用【4 0 1 。目前，已有研究表明c a t h e p s i n s 与多种神经系统疾病有关【4 l - 4 4 。近年发现在某些情况下溶酶体酶可以激活半胱氨酸蛋白酶c a s p a s e s ，而c a s p a s e s 是调控细胞凋亡的关键酶，提示溶酶体在细胞凋亡中也可能有重要作用。2 3 自噬过程的信号调控参与自噬过程的信号转导分子非常复杂，目前尚未完全被我们所了解。当前主要有以下两种途径：2 3 1r o t o r ( m a m m a l i a nt a r g e to f r a p a m y c i nj 信号途径) ：t o r 激酶是氨基酸、a t p 和激素的感受器，对细胞生长具有重要调节作用，抑制自噬的发生，是自噬的负调控分子，并发挥“门卫”作用【4 5 1 。酵母中s e r t h r 蛋白激酶a p g l 与其它a p g 分子结合共定位于自噬前体膜上。饥饿刺激下，a p g l 3 去磷酸化，并与a p g l 结合，导致a p g l 7 依赖性自噬的发生【4 6 1 ，哺乳动物细胞中的核糖体蛋白质s 6 ( p 7 0 s 6 ) 抑制自噬的发生，它位于t o r 信号途径下游，其活性受m t o r 调节。雷帕霉素( r a p a m y c i n ) 通过抑制m t o r 的活性，有助于a p g l 3 去磷酸化和a p g l 活化，发挥抑隹j l j p 7 0 s 6 活性、诱导自噬的发生 4 7 1 ，t o r 激酶抑制自噬的信号通路目前尚未完全明了。在酵母细胞，t o r 激酶可能通过抑制a t g l 激酶的活性来抑制自噬的发生【4 列2 3 2c l a s sip 1 3 k p k b 途径：c l a s sip 1 3 k 是自噬的负调节分子，它可磷酸化p t d l n s 4 p 和p t d l n s ( 4 ，5 ) p 2 ，生成p t d l n s ( 3 ，4 ) p 2 和p t d l n s ( 3 ，4 ，5 ) p 3 ，然后结合a k tp k b 和它的活化分子p d k l ，抑制自噬的发生。结节性硬化复合物1 ( t s c l ) 和t s c 2蛋白位于c l a s sip 1 3 k p k b 途径的下游，可通过抑伟f j d , g 蛋白r h e b ，抑制t o r 激酶的活性，对自噬发挥正向调节作用 4 9 1 。p t e n 磷酸酶也是自噬的正调节分子，它使p t d l n s ( 3 ，4 ，5 ) p 3 去磷酸化，从而解除c l a s s ip 1 3 k p k b 途径对自噬的抑制【5 0 1 。3 - m a 的功能是抑帝o p l 3 k ，从而抑制自噬性死亡的发生【5 l 】。高g 爵1艺一f i g 3 ：自噬信号调控两种途径6自噬对脑外伤引起的神经细胞死亡及神经功能障碍的影响前言2 4 凋亡发生过程细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种方式，以细胞1 为c a s p a s e 激活为起点，细胞凋亡是以细胞核浓缩、染色体d n a 被以核小体为单位切成梯状片段( 1 a d d e r ) 、细胞缩小，最终形成细胞凋亡小体而不引起周围细胞的溶解等形态变化为特征。细胞凋亡是在细胞群中散发，阶段性进行，并且依存于a t p 的供给和r n a 、蛋白质的合成，凋亡通路有一下三种途径。l 死亡受体通路胞外的死亡信号可通过死亡受体转入胞内。死亡受体为一类跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子( t n f r ) 受体基因超家族，其胞外部分都有一富含半胱氨酸的区域，胞质区有一由同源的氨基酸残基构成的结构，有蛋白水解功能，称为“死亡区域”。“死亡区域”使死亡信号得以进一步传递启动凋亡。已知的死亡受体有五种，t n f r 2 1 ( 又称c d l 2 0 a 或p 5 5 ) ，f a s ( c d 9 5 或a p 0 1 ) ，d r 3 ( 死亡受体3 ，又称a p 0 3 ，w s l l ，t r a m p ，l a r d ) ，d r4 7 h ：i d r 5 ( a p 0 2 ，t r a i l r 2 ，t r i c k 2 ，k i l l e r ) 。前三种受体相应的配体分别为t n f ，f a sl ( c d 9 5 l ) ，a p 0 3 l ，后两种均为a p 0 2 l ( t r a i l ) 。死亡受体与配体结合后使受体胞质区的“死亡区域”相互聚集，并与特异的接头蛋白( a d a p t o rp r o t e i n ) 的“死亡区域”( 与死亡受体的死亡区域类似的结构) 相聚集，在接头蛋白的作用下，c 唧a s e 8 、c a s p a s e 1 0 聚集，最终形成大分子复合物凋亡酶体( a p o p t o s o m e ) 。凋亡酶体中的c a s p a s e 一8 ( c a s p a s e - 1 0 ) 能通过自身切割转变成有活性的c 嬲p 嬲e 2 酶，进而切割c 嬲p a s e 3 酶原产生c a s p a s e 3 ，引起凋亡【5 2 】。死亡受体的接头蛋白不尽相同，f a s 受体的接头蛋白为f a d d ，耵师和d r 3 的为t r a d d 和f a d d 。d r 4 和d r 5 的尚不清楚。2 线粒体通路此通路由仅含b h 3 结构域的b e l 2 家族成员b i d ，b a d ，b i m ，h a r i k a r i ，n o x a 等在受到胞内的死亡信号后激活。这些含b h 3 结构域的b c l 2 家族成员与另外的b c l 2 家族成员( b a x , - i v _ 家族成员b a x 、b a k 等) ，主要松散的结合在线粒体外膜面或存在于胞浆，导致后者的寡聚并插入线粒体膜，引起线粒体通透性的改变，跨膜电位丢失，释放c y e c 和其他蛋白【5 3 】。释放的c y c c 与a p a f l ( 凋亡促进因子) 结合引起a p a f l 寡聚，从而募集并激活c a s p a s e 9 ，i 主l c a s p a s e 9 激活c a s p a s e 3 使细胞进入凋亡【5 4 】。3 内质网通路有证据表明细胞内还存在另一条凋亡通路。n a k a g a w a 等发现c 嬲p a s e 1 2 存7自噬对脑外伤引起的神经细胞死亡及神经功能障碍的影响前言在于内质网，当内质网钙离子动态平衡破坏或过多蛋白积聚于内质网时可激活c a s p a s e 1 2 ，激活的c a s p a s e 1 2 可进一步剪切c a s p a s e 3 而引发细胞凋亡。此过程由内质网失常引起，而非由以膜或线粒体为靶点的凋亡信号触发，因为缺乏c a s p a s e 1 2的小鼠细胞对内质网失常引起的凋亡耐受，但对其他凋亡刺激却仍敏感。2 5c a s p a s e 蛋白酶家族与凋亡凋亡程序的启动及执行过程中，凋亡效应器r c a s p a s e s 蛋白酶家族起了非常重要的作用，直接参与凋亡早期启动，凋亡信号的传递以及凋亡晚期作用于不同凋亡底物，切断与周围细胞的联络、重组细胞骨架、关闭d n a 复制、修复和破坏d n a 及核结构直接参与凋亡的早期启动。其中c a s p a s e 3 作为关键执行分予，在凋亡信号传导的许多途径中发挥着重要功能。通常c 嬲p a s e 3 以酶原形式存在于细胞质中，在凋亡早期被激活，因此常被用作早期细胞凋亡的指标。活化的c 邪p a l s e 3 由2 个大亚基( 1 7k u ) 和2 个小亚基( 1 2k u ) 组成，可裂解相应的底物，尤其是特异性地水解d e v d - x 肽类和d x 肽键的底物，导致细胞凋亡，但在凋亡晚期和死亡细胞中，其活性明显下降p 6 1 。2 6b c l 2 基因家族与凋亡b c l 2 基因家族最先在b c e l ll e u k e m i a 中发现，由此命名。在细胞凋亡过程中，b c l 2 蛋白家族成员起着至关重要的作用，它们具有较高的同源性，而且还有b h lc l 一2h o m o l o g yd o m a i n 一1 ) ，b h 2 ，b h 3 ，b h 4 等保守结构域。b c l 一2 家族可以分为两大类：一是抗凋亡的，主要有b c l 2 ，b c l x l ，b c l w ，m c l 1 ( m y e l o i d c e l ll e u k e m i a 一1 ) ，c e d 9 等；二是促细胞死亡的，主要包括b a x ，