（发育生物学专业论文）过量表达拟南芥win1基因对酵母长链脂肪酸组成的影响.pdf

山东师范大学硕十学位论文 过量表达拟南芥m z 基因对酵母长链脂肪酸组成的影响 摘要 陆生植物气生器官的表面覆盖着一层由蜡质形成的脂膜，主要由特长链疏水 物质组成，这些物质是特长链脂肪酸( c 2 0 _ c 6 0 ) 的衍生物。表皮蜡质的物理化学 性质决定它在植物的生命周期中起着重要的作用，如限制非气孔性失水、防止紫 外线的照射、抵抗细菌、真菌病原菌的入侵等。 在酿酒酵母( 勋 n 阳研y c 甜c e r 删括缸曲中，脂肪酸占酵母菌总重量的5 ，是构 成细胞结构如细胞膜、核膜骨架中脂双分子层( 1 i p i d b i l a y e r ) 的重要组成部分。 酵母中各种脂肪酸的碳链长度从c 8 到c ：6 不等，主要为c 1 6 和c 1 8 的饱和及不饱和 脂肪酸，其中哺乳动物所必需的不饱和脂肪酸亚油酸( 十八碳二烯酸) 和亚麻酸 ( 十八碳三烯酸) 的含量尤高。特长链脂肪酸( v l c f a ，即链长大于c 2 0 的脂肪 酸) 是酵母菌中多种脂类复合体如n 一脂酰鞘氨醇，鞘脂，磷脂酰肌醇等的组成成 分，v l c f a 对生物膜的结构、功能和流动性都有重要的影响。 删z ( w a xi n d u c e r ) 是拟南芥中具有a p 2 结构域的转录因子。过量表达聊m 能明显增加植物表面蜡质的含量，而且蜡质的组成成分也有改变。反之，沉默这 个基因则能引起相反的结果。为了能更深一步的研究彤口w 基因的作用机理，我们 克隆了拟南芥中的耽j 基因并在酵母中进行了过量表达，对转基因酵母的表型及 脂肪酸组成进行了初步分析。主要结果如下： 根据g e i l b a n k 中的序列设计了特异引物，从拟南芥的花序中提取总砌q a 通 过二p c r 的方法得到删，基因的c d n a 全长，测序结果表明与g e f l b a i l k 中的 耽j 序列完全一致。将聊m 基因的c d n a 连入酵母过量表达载体p 4 1 6 哪的 & 出i 和勘，i 位点之间构建成重组质粒( p 4 1 6 t e f l 聊m ) ，并利用l 认c 转化 方法转化野生型酵母k 6 d j 。与对照相比，过量表达聊m 的转基因酵母生长缓慢， 在3 0 下s d 平板上培养4 8 小时形成的菌落明显小于对照k 6 0 1 ( p 4 1 6 t e f ) ：显微 镜下观察发现转基因酵母肺d ，( p 4 1 6 t e f 一聊，) 出现比较明显的成串生长现象， 细胞也比膨d ( p 4 1 6 t e f ) 的酵母细胞小。提取转基因酵母总脂肪酸进行g c m s 分析，发现长链脂肪酸和超长链脂肪酸的相对含量与对照相比发生了一些变化， 山东师范太学硕士学位论文 其中不饱和长链脂肪酸c 1 6 1 减少了1 0 ，而c 1 8 = l 稍有所增加，而饱和的长链脂肪 酸c 1 6 mc 1 8 0 都有增加，特长链脂肪酸中c 2 0 增加了2 0 ，c 2 2 减少了5 0 ，c 2 4 稍有下降，由于条件限制，c 2 6 并没有看出有太大的变化。 通过实验我们初步确定阡删基因在酵母中的过量表达能够影响酵母的生长 和脂肪酸组成，可能是聊a 基因的过量表达调控了酵母中脂肪酸代谢过程中相关 基因从而出现上述表型，具体机制值得更深一步研究分析。 本研究的创新点：首次将删j 基因在酵母中过量表达，并对其脂肪酸图谱进 行了初步分析，为进一步揭示w 玳1 的作用机理提供了线索。 关键词：明t w 酿酒酵母长链脂肪酸g c m s 山东师范大学硕士学位论文 o v e r e x p r e s s i o no fa r a b i d o p s i s j 州ja f f e c t st h ec o n l p o s i t i o no f i o n gf a t 蚵a c i d si n c c 口r d j ，i 吵c 四c p 陀l ，缸胁p a b s t r a c t w a xf b r mac 伽t i n u o u sl i p i dm e m b r a n c ec o v 甜n gt h e 印i d e 珊a lc e l l so fa l la c r i a l p i 勰to 培a j l s nm a i n l yc o m p r i s e do fv e r y 1 0 n y c h a i na l i p h a t i cc o m p o u n d sd e r i v e d 仃o m v e r yl o n gc h a i nf a l 哪a c i d s ( c 2 旷c 6 0 ) t h ec h e m i c a la i l dp h y s i c a lp m p e m e so f c u t i c u l a r w a x e si n d i c a t ct h a tt h e yh a v e 啊t a lf i l i l c t i o i l sf o rp l a i l “i f e t h ep m a r yr o l eo fc u t i c u l a r w a x e si st or e s m c tn o n s t o m a t a lw a t e d o s s w a x e sa l s oh a v ei n a n yo t l l e r 血c t i o n s ，s u c h a sp r o t c c t i o na g a i n s tu vr a d i a t i o na i l dr e s i s t i n gb 卸t e r i a la n df 嘶g a lp a t h o g e n e s m a l l y m o d e l sh a v eb e c l lp u to u tt oe l u c i d a t em e s ep r o c e s s e so fw a xb i o s y n t h e s i sa 1 1 dw a x s e c r e t i o n f 8 t t ya c i d o f5 白c 幽加玎鲫韶，研妇缸gi st l l e i m p o n a n tc o m p o n e mo fc e u 蛐m c t l l r em y e a s ts u c ha sm e1 i p i db i l a y e ro fp l a s m am e m b r a c ea n d n c r om e m b r 卸n c e ， a 1 1 dt l l ep r o p o n i o no ff a t t ya c i di sa b o u t5 o f 廿1 et o t a lw e i 曲t l i p i dc o m a i n sm a i l y k i i l d so ff 撕ya c i d ，的mc 8t oc 2 6 ，a n dm a i n l yi n c l u d e ss a t i l 】_ a t i o na n dl l n s a t u r a t i o nf 孤y a c i d so fc 1 6a i l dc 1 8 i nw h i c hs u b o l e i ca c i da n dn a xa c i di sm ei n t e g r a n tt 0m 锄m a l a n dm ec o n t e n ti s l l i 曲1 1 1 ev e r y l o n g c h a i n f a i t y _ a c i d s ( v l c f a ，三2 0 c ) a r c t 1 1 e c o m p o n e n t so fm a i l yl i p i dc o m p l e x e ss u c h 船n s t e a r o y - s p h i n g o s i n ，s p h i g o l i p i d ， p h o s p f a t i d y l i n o s 沁l 姐ds oo n s t u d i e si n d i c a t et h ei i t l p o r t 觚tr 0 1 eo fv l c f a st o 血e s t n l c t i l r e ，矗m c t i o na r l dl i q u i d i t yo fc e um e m b r a n e 耽mg e n ei sat 啪s c r i p t i o n a la c t i v a t o ro fa p 2d o m a i ni n 一m 6 f d 哟 0 v e r e x p r e s s t i o no ff 州jg e n ec o u l di n c r e a s ep l a h tc u t i c u l a rw a x 1 0 a do na e r 主a lo 鹅a n a n d c h a l l g em ec o m p o s i t i o no ft h ec u t i c u l a rw a xi n 仃a n s g c m cp l a n t s w h e r e a s ， d o w i l r c g l l l a t i o no f 聊me x p r e s s i o nc o u l db 血gr e v e r s ee 腩c t f o r 肌h e r 咖d yt h e 如n c t i o no f 助唧，w eo v e r e x p r e s s e d 明mg e n ei n c 幽口阳婵优萝 譬熔面pa n d a n a l ”i s e dt h ec h a n g eo ft h ec o m p o s i t i o no f1 0 n gf a t t ya c i d si n 砌c 幽n ，d ，缈唧 i i i 山东师范人学硕士学位论文 c 删s f n p f r i s t ，w ea c q u i r et h ew h o l es e q u 锄c eo f 嬲研c d n a 硒mg b 蛊呔a n dd e s i 印 m es p e c i a lp r i m e r s s e c o n d ，陟孙，g e n ew a sc l o n e db yr e v e r s et r a n s c r i p t a s ep c r 疗啪协en o w e rr n ai n4 m 6 越q 邵捃hc o m p a r i s o nw i 1m es e q u e i l c e 丘o mg e n b a n k ， t l l es e q c n c ei s 1 0 0 c o i l s i s t e n t l y t h i r d ，t h eo v e r e x p r c s s i o nv e c t o r0 4 1 6 t e f 一溯肼) w 勰c 伽s t m c t e d b yl i n k i n gt h eg e n e 聊mi n t 0t h ey e a s tv e c t o r ( p 4 1 6 t e f ) b e 时e e l lm e n ria n d 勋t h e 、i l dt y p ey e 鹅t ( 肺0 ) w 舔打a n s f o m e dw i mp 4 1 6 t e f 一删j a 1 1 dp 4 1 6 t e fb yl 认cm e m o d 确er e s u l t ss h o w e dt h a tm et r a f l s g e n i cy e a s t 蜀卵， 1 6 t e f 一例，) g r e ws l o w c rt t l a i l 崩口，q 4 1 6 t e f ) i ns dm e d i m f o r4 8 ha t3 0 b yp h 0 6 c sm i c r o s c o p e ，t h ec e l lo f 筋d 0 4 1 6 t e f ) c o u l df o m las 缸n ga r l dm e c e l li s s m a l j e rt l mm ey e a s tw h i c hi st r a n s 删i i le m p t yv e c t o r0 4 1 6 t e f ) t h et o t a lf a l t y a c i d sw e r ee x t r a c t 甜m dm ea n a l y s i sw a sp e r f o r n l c db yg c m s 1 1 1 ec o n t 饥to fm c l o n gc h 血蛳a c i d s 锄dv l c f 缸h a v es o m ec h a n g e t h c1 l n s a t i l m t i o nf h t t ya c i dc 1 6 ：l r e d u c e d1o a n dc 1 8 ：li i l c r e a s e ds l i g h t i y t h es a t l l r a t i o nf 矾ya c i d ss u c ha sc 1 6 ：oa i l d c 1 8 ：oi n c r e a s e ds l i g h t l y t h ev l c f a sh a v es o m eo b “0 u sc h a i l g e ，c 2 0i n c r e a s e da b o u t 2 0 ，c z 2r e d u c e da b o u t5 0 a 1 1 dc 2 4r e d u c e ds l i g h t l y b u tn os i 9 1 1 m c a n tc h a i l g e si n c o n t e n to f t l l eo t l l e rv l c f a ss u c ha sc 2 6w e r eo b s e r v e d h lt h i sr e s e a r c h ，w ec o u l db es u r em a to v e r e x p r e s s i o n 胁，f g e n ew o u l d 蜥n gm e a b n o m i t yo fy e a s t 伊o w ma n dt l l ec h a n g eo ff 砒ya c i dc o m p o s i t i o ni ny c a s t b e s i d e s ， m ee x p r e s s i o l l so fs o m eg e n e so ff a n ya c i dm e 协o l i s m 盯er c g u l a t e db y l e 眈m g e n e s o w e w i l l h o l d o ns t u d y t l ”m e c h a n i s mo f h 删yi n t h e f i l t l l r c t h em a i ni n n o v a t i o np o i m ：t h e 仃a n s g e n i cy e 鹪to v e r c x p r c s s i l l g 陟刀ww a s g e n e m t c d i tw a st h ef i r s tt i m et oi n d i c a t e l a to v e r e x p r e s s i o no f 朋mi ny e 硒ta 腩c t t h e 璺驯ma 1 1 df h t t ya c i dc o m p o s i t i o no f m ey e 船t k e yw o r d s ：形w j勋c c 加盱咿酷c 删v 妇f d 8l o n g c h a i n f a t t y - a c i d g c m s 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 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结构域的转录因子的基因，但其产物并不是转录因子 而是作为一种位点特异的核酸内切酶而发挥作用【6 1 。从低等生物的特异性核酸内 切酶到高等植物的转录因子而且高等动物中没有存在，在进化上这是一种基因的 入侵现象。 在开花植物中大概有几百个a p 2 家族的转录因子，大致可分为四类亚家族： a p 2 类、e r e b p 类、d r e b 2 类、r a v 类亚家族。 山东师范人学硕士学位论文 1 具有a p 2 结构域的转录因子的分子结构和功能 a p 2 转录因子家族成员的主要特征是含有由6 0 到7 0 个左右的氨基酸组成的 高度保守的、具有三个b 折叠结构的d n a 结合区，称作a p 2 结构域( a p 2d o m a i i l ) 。 在a p 2 结构域中有两个保守区段，一个是碱性的y r g 区( y r ge l e m e m ) ，由保 守的1 9 2 2 个氨基酸组成，其中t g 区高度保守，y r g 区参与与d n a 的结合； 另一个保守区是m 、y d 区( 黜、y de l e m e m ) ，由4 2 4 3 个氨基酸组成，核心结构 是一个由1 8 个氨基酸组成的高度保守的双亲性的a 一螺旋结卡勾1 7 1 ，y d 元件可 能参与蛋白与蛋白之间的相互作用。在y r g 和r 蜗d 保守区中，有几个氨基酸残 基是极度保守的，比如m w d 保守区中第4 0 个氨基酸甘氨酸，存在于所有的 a p 2 蛋白，它对于a p 2 蛋白发挥其生理功能作用重要1 3 1 。序列分析显示，a p 2 蛋 白至少含有一个a p 2 结构域，其它氨基酸序列则高度不同。 1 1a p 2 亚家族 a p 2 亚家族成员最主要i 均特征是在其蛋白结构中含有两个a p 2 结构域，这两 个a p 2 结构域由一个2 5 2 6 个氨基酸组成的铰链区连接，铰链区的氨基酸序列也 是高度保守的。a p 2 亚家族的另一个特征是，在其t g 保守区中均含有 、v e a r w e s h 这样段高度保守的氨基酸序列。在拟南芥中有1 4 个a p 2 亚家族 的成员如4 尸2 、胂和g f d 啊一5 掣2 1 ，主要在植物发育过程中起作用。如4 力蛋 白参与调控花分生组织的建立、花器官的分化，同时还调控其它与花发育有关的 同源异型基因的表达，在拟南芥花发育过程中起重要作用：另外它还参与拟南芥 子房发育和种子发育过程的调节1 3 】、调控种子的数量和产量等【8 】。且r 在拟南芥的 子房发育和雌配子体的发育过程中起关键作用9 ，”】，它结合的d n a 序列是5 g c a c g ) n ( t ) t c c c ( a g ) a n g ( c 广r ) 3 ，蛋白分子中的任何一个a p 2 ，e r e b p 结 构域都不能单独完成与该顺式作用元件的结合，需要两个结构域的协同作用】。 1 2e i 也b p 亚家族 含有一个a p 2 结构域保守区，与乙烯应答基因启动子中的g c cb o x 结合。 目前大约有1 5 0 个存在于拟南芥中，开花植物中存在几百个。根据a p 2 结构域中 氨基酸序列的不同，e r e b p 亚家族又可以进一步分为6 个不同的亚族：b 一1 、b - 2 、 b 3 、b 一4 、b 一5 和b 一6 亚族，其中b - 1 、b 一2 、b 3 亚族包括e 足f j 、a 坦阱、4 压r f ，、 2 山东师范丈学碗上学位论立 爿e 妲2 、4 艘丹、爿压r 和爿t e 肼巧等成员，它们所结合的顺式作用元件是g c c b o x ( 5 ：= 鱼鱼：! ：) ，g c cb o x 存在于植物中被乙烯诱导的、与抗性相关的基 因启动子中，它对于乙烯诱导的p 足基因( p a i h o g c l l e s i s r e l a _ t e dg e n e s ) 的表达是必 须的 1 2 】。而b 一4 、b 一5 和b 一6 亚族的蛋白所结合的顺式作用元件目前还不清楚。所 有的亚族成员，除了b 5 和b 一6 亚族中的五个成员即a c 0 1 6 9 7 2 、r a p 2 1 l 、 a c 0 0 6 2 5 8 、a c 3 6 0 3 1 4 、a c 3 0 0 7 5 9 l 所编码的蛋白以外，其它成员的蛋白分子中 的a p 2 结构域的第十四位均为丙氨酸( a 1 4 ) 。e r f 类转录因子在植物体中主要 参与植物对病原侵害、机械伤害等的胁迫应答反应【1 2 1 4 ，1 9 t2 0 1 ，受乙烯、水杨酸、 茉莉酮酸的调节【1 2 。引。苜蓿中的脱杼，与拟南芥中的明m 愿h m 转录因子在植物 中参与植物蜡质代谢【4 ，5 1 。 1 3d i 冱b 亚家族成员 此类蛋白分子中仅含有一个a _ p 2 保守区，在拟南芥中有5 5 个成员。这些成员 根据其d n a 结合区的不同又可以分为6 个亚族：a 1 、a - 2 、a - 3 、a _ 4 、a - 5 和 a - 6 亚族。a - 1 亚族包括d r e 8 j f 类转录因子，a - 2 亚族包括d 足e 8 2 类转录因 子，它们所结合的顺式作用元件是d r 聃r t ( d e h y d r a t i o nr e s p o n s i v e e l e m e 州c r e p e a t ) ( 5 ：! 型q 堂! = 3 ：) ，核心序列是笪暨g ：丛。d r e c r t 顺式作用元件存在于很多与植物干旱、高盐和低温等抗性相关基因的启动予中。 a - 3 亚族在拟南芥中只有一个成员爿b ，参与植物a b a 的信号传导过程，与种子 发育及糖代谢有判2 1 ，2 2 1 。a - 4 亚族包括删y 等1 6 个成员。a 5 亚族在拟南芥中 也有1 6 个成员；a 6 亚族有9 个成员。a 3 、a 一4 、a 一5 和a 一6 亚族的转录因子所 结合的顺式作用元件目前还不清楚。a _ 1 、a 2 、a 一3 亚族的所有成员和a 4 、a - 5 、 a 6 亚族的部分成员的a p 2 结构域中，第十四位和第十九位的氨基酸非常保守， 分别是缬氨酸( v 1 4 ) 和谷氨酸( e 1 9 ) ，尤其是第十四位缬氨酸( v 1 4 ) ，在所 有的d r e b 亚家族成员中都是不变的，它对于转录因子与相应的顺式作用元件的 结合是必须的【2 】：而在e r f 亚家族中，对应位置上的氨基酸是丙氨酸( a 1 4 ) 和精 氨酸( d 1 4 ) ，这两个氨基酸对于e r e b p 转录因子与g c cb o x 的特异性结合也是 必须的。此外，e 王疆亚家族和d 砌疆亚家族成员蛋白的a p 2 结构域中均含有保守 的w l g 基序( w l g m o t i f ) 。 d r e b l 獒基j 强包括c b f l ，1 ) r e b l b 、c b f 2 ，d r e b i c 、c b f 3 f d r e b l a 、 山东师范人学硕士学位论文 c b f 4 d r e b l d 、d r e b l e 莉d r e b i f 六个成员。其邙c b f l f d r e b l b 、 c 曰勰e b ，c 、c 8 f ；，d 足e 8 ，4 位于拟南芥第四条染色体上，目前研究得比较深 入1 1 l ，2 3 1 ，c ：刚、舰和侧受低温诱导表达，而不受干旱和高盐诱导： c 8 ( d re ：日j d 位于第五条染色体上，受n a c l 处理、干旱胁迫的诱导表达而不受 低温胁迫诱导；瑚占8 ，e 和瑚j ，于第一条染色体上【“，锨船，f 受n a c i 处理 的诱导表达，但其受诱导表达的强度都不如c 口用仍兄e 口曰、黝e 8 ，c 、 c b f 3 7 d r e b i a ，动。 d r e b 2 砻转褐子包括d r e b 2 a 、d r e b 2 b 、d r e b 2 c 、d r e 8 2 d 秘d r e b 2 f 五个成员 2 l ，其中脚刎、d r e 8 船研究的较为深入，脚别的基因位于拟南 芥第五染色体上，d 旭日勿的基因位于第三染色体上，这两个成员除了均含有a p 2 结构域和核定位信号外，在序列上与d 翘口，类转录因子没有明显的同源性。 d r e 口2 类蛋白中含有一段富含丝氨酸苏氨酸的保守序列，表达模式与d r 皿j 不 同，它们受干旱和高盐诱导口，2 3 】，而不受低温诱导表达。由此推测，d r e b ，和删2 在胁迫诱导条件下的信号传导途径可能不同。 d r e b 类转录因子能够与d r e c r t 顺式作用元件结合，诱导启动子中含有 d r e c r t 顺式作用元件( ：丑堑鳗鱼! ：! ：) 的基因的表达，d r e c r t 的核 心序列是! x 璺，普遍存在于植物对干旱、高盐或低温胁迫应答基因的启动子 中，如耽鲥、加j 、c d 砸6 ，如、刎7 和p 埘，d 等，对这些胁迫条件下的基 因诱导表达起调控作用。所以在植物对干早、高盐或低温胁迫的分子应答中，一 个d r e b 转录因子可以调控一群启动子中含有d r e c r t 元件的、与胁迫耐性相 关基因的表达，此调控过程不依赖于a b a 。 在植物中过量表达d 砌强类转录因子能够显著增强植物对干旱、高盐或低温 等胁迫环境的抗性。如在拟南芥中过量表达c 口剧，转基因植物比对照植株对低温 具有更强的耐受性2 4 】；过量表达c 8 丹，转基因拟南芥获得了对干旱、高盐和低温 胁迫更强的抵抗能力，2 5 26 1 ，但同时也引起转基因植物的高度矮化，而用诱导型 启动子如加鲥的启动子代替组成型启动子就可以克服这个负面效应，在提高植 物耐逆性能的同时不会造成植物其它性状的改变。 水稻中也存在能够识别d r e c t r 顺式作用元件的d r e b 类转录因子。2 0 0 3 年，d u b o u z e t 等从水稻中分离得到了五个与拟南芥d r e b 类转录因子同源的c d n a 4 山东师范大学硕士学位论文 薄尹n ，并命铬为o s d r e b j a ，o s d r e b i b 、o s d & e b j c o s d r e b l l ) ，o s d r e b 2 a ， 其中，伪d 足e b 埘、仉d 尼嘧j b 受低温、高盐和机械损伤诱导；执d 见船别受干旱、 高盐和低温诱导表达。过量表达伍d r 居曰朋和伪d 胄皿刎的拟南芥转基因植株表 现了较高的耐干旱、高盐和低温的性能1 8 。s h n n e r 等( 2 0 0 5 ) 预测水稻中至少有 1 4 个a 琅d 尼凹类转录因子，并将a y 7 8 5 8 9 7 、a p 0 0 5 7 7 5 、a a a a 0 1 0 0 1 9 5 7 、 a p 0 0 4 6 3 2 编码的几个蛋白因子命名为0 s d r e b l f 、o s d r e b l g 、0 s d r e b l h 、 o s d r e b l i 和o s d r e b l j ，对其中仉d 尬日j f 基因进行了克隆并测序。而基因 伪d 屁z g 、伪d r 8 j 日、蕊d 足e 8 j ，和蕊d 腿8 j 了则来源于g e i l b a n k 中的b a c 或e s t 【2 7 j 。 近年来已经从大麦、黑麦、番茄和油菜里得到了与拟南芥中的d m 转录因 子序列上同源、功能上相同或相似的基因。这些研究结果表明d r e b 类转录因子 在植物界是广泛存在的，并且在不同的植物体中执行着相似或相同的功能【8 8 】。 1 4 r a v 亚家族 分子中含有两个不同的d n a 结合区：一个a p 2 e r e b p 结构域和一个b 3 结构 域。b 3 结构域存在于很多受a b a 、生长素和光敏色素诱导表达的转录因子蛋白结 构中【2 8 】。刚亚家族在拟南芥中有6 个成员，包括见i w 、r a 比等。冗4 纠中的 a p 2 ，e r e b p 结构域和b 3 结构域分别与：丛垒3 ：和5 ：缱! 鱼：3 ：结合 2 9 】 r a v 类转录因子参与植物对低温胁迫的信号传导过程及植物的防御反应过程，此 外见4 w 还参与植物油菜素内酯所介导的植物发育的调控过程【3 0 3 2 】。 2 植物中a p 2 结构域的进化 1 9 9 4 年发现在高等植物中也存在含有a p 2 结构域的基因【8 6 1 ，其基因产物是一 种转录因子，在植物开花过程以及抗逆的过程中起作用，植物中此类基因缺乏内 含予( 1 2 2 1 4 5 ) 。2 0 0 4 年在纤毛四膜虫中发现含有a p 2 结构域基因是编码位点特 异性核酸内切酶鲫，这种位点特异性核酸内切酶是纤毛四膜虫这种原始的真核细 胞中有丝分裂从小核产生大核( 滋养核) 时，去除一些插入序列( 内在去除序列 ( i e s s ) ) 时所需要的，富含g 和c 的a p 2 结构域是结合在d n a 上的。后来在蓝 藻和噬菌体中也发现了彳心结构域基因 8 5 】，也是编码核酸内切酶。因此推论a p 2 保守区不是垂直的进化产物，而是横向的基因的侵入，从原核生物一纤毛虫一高 等植物，通过过内吞作用，或病毒感染植物细胞，或其他基因转移的方法( 1 a t e r a l 山东师范大学硕士学位论文 g e n et r a i l s f c rc v e n t s ) 进入高等植物，但作为核酸内切酶对于植物是有害的，因此 在长期进化过程中a p 2 结构域的保守区的基因产物进化成转录因子而存在，但 a p 2 结构域的d n a 结合功能却一直被保留了下来【6 】。 三植物蜡质的研究 l 概述： 蜡质是各种脂类化合物组成的一层疏水的屏障，它覆盖在陆生植物地上部大 部分器官的表面，是植物表面的重要结构【3 5 】，另外在受伤的组织和木栓的基质中 也含有蜡质成分p 哪，花粉、种子的外被以及雌蕊的柱头上都有蜡质存在【3 7 3 8 1 。( 图 2 ) 表皮蜡质组成和总量在不同的物种和同一种植物的不同组织和器官间有着十分 显著的差别39 1 。它主要由特长链饱和脂肪酸( v e r y1 0 n gc h a i nf a n ya c i d s 肌c f a s ) 的 衍生物如烃( a l k a l l e s ) 、醛( a l d c h y d e s ) 、酮( k e t o n 船) 、一级醇( 曲m a r ya l c o h o l s ) 、酯 ( e s t e r s ) 、二级醇( s e c o n d a r ya l c o h o l s ) 等组成【35 1 ，碳链长度大多在2 3 4 碳之间，但 酯的碳链要更长一些，表皮蜡质组成中也包括三萜化合物和一小部分次生代谢产 物，如甾醇( s t c r o l s ) 和黄酮类化合物( f l a v o n o i d s ) 【36 1 。这些蜡质成分分泌到植物器 官表面后分为内外两层，内层位于表皮的基质内称为表皮内蜡质：外层位于表皮 外侧称为表皮外蜡质。表皮外蜡质可在表皮上形成不同形状的蜡质晶体结构p 鄹， 如柱状最多，还有棒状、管状、垂直板状、树枝状、伞状等。植物表皮蜡质的化 学组成及晶体结构如此复杂，决定了它在植物的生活过程中起着十分重要的作用， 除了防止非气孔性失水外，现已经证明表皮蜡质能为植物提供其他多方面的保护： ( 1 ) 蜡质晶体可以反射紫外线，防止过量紫外线对植物的伤害2 3 】；( 2 ) 防止机械损 伤；( 3 ) 防止低温冻伤；( 4 ) 抵抗植物病毒的侵害【2 4 】：( 5 ) 防止食草昆虫的伤害； ( 6 ) 花粉表面的蜡质参与花粉与柱头之间的信号识别强3 ”，与植物的育性有关；( 7 ) 使水分不能在植物表面过多的停留，防止水溶性有害物质在植物表面的沉积【4 ”。 6 山东师范大学硕一i ：学位论文 图1 ：植物细胞表皮蜡质的模式图 2 蜡质的合成途径： 植物表皮蜡质在植物表皮细胞中合成，其合成及分泌途径非常复杂，估计有几 百个基因参与这一过程，催化蜡质合成的酶大多都是膜结合蛋白，而且多数以多 酶复合物的形式存在，传统的方法很难分离纯化，再加上酶的底物( 长链的脂类物 质) 不溶于水，不易制成酶反应缓冲液，使得对蜡质合成途径中的酶的研究很难深 入，所以对于蜡质合成、分泌及调节的具体过程仍处于推测阶段【6 8 1 。与蜡质组成 一样，蜡质合成途径在植物中也存在着一致性，目前应用遗传学和分子生物学的 方法对拟南芥及和拟南芥亲缘关系比较近的野甘蓝( b 删f d 如阳c 口口p ) 进行植物 表皮蜡质合成及分泌相关基因的功能研究1 4 3 1 ，对于阐明这一过程有很大的帮助。 植物表皮蜡质是由多酶复合物参与的一系列酶促反应合成的，大体分为三步【6 9 l ： l 、质体内c 1 6 和c 1 8 饱和脂肪酸从头合成途径；2 、质体外脂肪酸延长生成v l c f a s 途径。3 、蜡质各成分的合成。 2 1c 1 6 和c ，。脂酰链的合成途径( 质体内合成) ： 第一步是从头合成c 1 6 和c 1 8 酰基链，也就是植物体内脂肪酸的合成途径，但 此过程是在表皮细胞基质的质体中由可溶性的脂肪酸合成酶复合物( 胁ya c i d s y n t h a s ec o m p l e xf a s ) 催化完成“引。延伸过程中，首先酰基链转移到酰基载体蛋 白一a c p ( a c y lc a r r i e rp r o t e i n ) 上，然后通过四个反应完成：( 1 ) 缩合反应：来自 丙二酸单酰一a c p 的二碳原子实体与酰基a c p ( 最初一个循环中为乙酰一a c p ) 缩 合，形成p - 酮酰- a c p ( p k e t o a c y l a c p ) ，由p 一酮酰一a c p 合成酶催化；( 2 ) 还原 山东师范人学硕士学位论文 反应：p - 酮酰- a c p 还原为p 一羟酰a c p ( p - h y d r o x y a c y l a c p ) ，由p - 酮酰一a c p 还 原酶催化；( 3 ) 脱水反应：6 羟酰a c p 脱水生成反式2 。烯酰一a c p ( 抒讼骆0 e n o y l a c p ) ，由b 羟酰a c p 脱水酶催化；( 4 ) 还原反应：反式2 烯酰一a c p 还 原为延长了两个碳原子的酰基- a c p ，由反式2 一烯酰一a c p 还原酶催化。这四个反 应是通过还原酰基链来延伸两个碳原子，合成反应每循环一次，酰基链增加两个 碳原子，直到链长达到c 1 6 或c 1 8 。合成的c 1 6 或c 1 8 酰基一a c p 由酰基一a c p 硫解 酶催化裂解a c p ，释放c 1 6 或c l s 饱和脂肪酸到细胞质中【4 6 】。在质体中有三种不同 形式的脂肪酸合成酶复合体，它们是合成c 1 8 脂肪酸所必需的，它们对脂酰基链的 长度有一定的特异性，如剧s 五矿能合成c 2 c 4 链长的脂肪酸【4 7 】、删s ，能合成 c 4 一c 1 6 链长的脂肪酸以及删s 能合成c 1 6 一c 1 8 链长的脂肪酸【4 引。但是作为这三 个脂肪酸复合体中组成成分的两个还原酶和脱水酶对底物的链长没有特异性，它 们在三个质体脂肪酸合成酶复合物中都存在1 2 2 特长链脂肪酸v l c f a s 的合成( 质体外合成) ： 第二步是把c 1 6 或c 1 8 脂肪酸延伸成特长链脂肪酸( v l c f a ) 用来作为蜡质的直 接前提物质，它是通过质体外和膜结合的多酶复合体完成的，该多酶复合体称为 脂肪酸延伸酶( 涨ya c i de l o n g a s ef a e ) 【5 0 1 ，和脂肪酸合成类似，每延伸2 个碳原子需 要四步反应，但酰基供体不再是丙二酰a c p 而是丙二酰辅酶a 【5 l 】。由于蜡质组成成 分的碳链主要在2 0 3 4 个碳原子之间，因此需要多次反应才能达到相应的链长。在 拟南芥基因组中已经发现了2 1 个可能编码脂肪酸延伸酶的序列，现在还不知道这 些序列编码的酶有多少参与腊质的合成，也不清楚从c 1 8 延伸到c 3 4 脂肪酸需要多 少不同的酶【5 2 】。拟南芥和其它植物的突变体的研究提供了许多证据证明许多脂肪 酸延伸酶参与了特长链脂肪酸的延伸过程，单个基因的失活主要影响单一的延伸 步骤5 4 ，5 5 1 。最新研究认为地进行c 1 6 或c 1 8 脂肪酸延伸成特长链脂肪酸( v l c f a ) 有 三个关键酶：麒嚣( p b t o a c y l c o as y t h a s e ) 、蔚c r ( t h cp k e i oa c y l - c o ar e d u c t a s e ) 和c 戤( 出ee n o y l c o ar e d u c t a s e ) 1 8 卯。 目前，拟南芥中已分离到3 个缩合酶：墨1 【5 6 1 、肋觑f i d d l e h e a d ) 【5 7 】和 c 职6 阢5 8 1 。七j 和 扔突变体并未表现严重的蜡质缺失。c e r 6 在拟南芥地上部 分的整个发育过程中都有很高效的表达，但仅仅是局限于表皮细胞中，c 职6 活性 的丧失则导致茎表皮蜡质的严重缺失及环境依赖性雄性不育【3 5 1 ，这一切都表明 山东师范大学硕士学位论文 c e r 6 是拟南芥茎及花粉表皮蜡质生物合成途径中主要的缩合酶。觚嚣，和肋日不 能互补拟南芥r 6 突变体的表型，说明k c s ，、肋珂与c e 尺6 的功能在拟南芥茎 表皮蜡质和花粉表皮蜡质生物合成途径中并不重叠f 删。另外，还发现了一个和 c 鳅6 蛋白序列有高度同源性的酶r 卯，推测它也是v l c f a s 合成中的缩合 酶。但是，最近的研究发现c 职6 d 与茎及花粉表皮蜡质的合成没有多大的关系【5 8 】， 可能是因为c e 尺6 1 9 在成熟的拟南芥组织中表达量很低 5 9 1 。对于f a e 中的两种还原 酶和一种脱水酶知之甚少，由于突变致死等原因没有办法筛选这三种酶的拟南芥 突变体，说明它们可能是必需基因或功能冗余基因【6 。 2 3 蜡质组成成分的合成途径 脂肪酸延伸酶产生的特长链脂肪酸( v l c f a ) 作为蜡质的直接前体通过四条基 本途径合成蜡质的组成成分：( 如图1 ) 1 ) 特长链脂肪酸的产生【6 1 】：脂肪酸延伸酶产生的不同链长的特长链酯酰辅酶a 通过酰基辅酶a 硫解酶( 盯y l c o a t h i o e s t e r a s e s ) 去掉辅酶a 产生自由的饱和脂肪 酸。 2 ) 酰基还原途径 6 2 l ：特长链脂酰辅a 酯还原成一级醇已经在植物中得到证实， 此过程包过两步不同的反应：由依赖于n a d h 的酰基辅酶a 还原酶 ( n a d h d e p e n d e n t 孔y 1 c o ar e d u c t