（化学工艺专业论文）lt15gtN标记血管紧张素Ⅱ的合成.pdf

硕十学位论文 摘要 在肽科学发展中，固相合成( s p p s ) 的观念和方法已经广泛用于化学、生物学等领 域，直接导致了多肽和核酸的自动化合成，也催生了组合化学的诞生及其广泛应用。 多肽合成的难点在于氨基酸的不同功能基团易于发生副反应，从而引起副产品增多、 分离纯化困难、合成效率降低等现象，因此用于多肽合成的氨基酸的活性基团必须在 进行肽合成之前暂时保护起来，以保证多肽合成过程按照所需序列顺利进行。本文以 多肽合成方法为指导，确立并优化了组氨酸和半胱氨酸的保护策略，在此基础上用 f m o c s p p s 法合成了非标记和部分1 n 标记的血管紧张素i i ，并对其进行了纯化处理 和相应的分析。 1 通过单因素考察、中心曲面实验设计和正交实验设计主要对h i s 的两步保护 反应条件进行优化，合成了组氨酸( h i s ) 的保护产物f m o c h i s ( t r t ) o h ，最终两步反 应收率分别都达到8 0 以上，产品纯度达到9 5 以上。 2 通过单因素考察确定了较优的半胱氨酸( c y s ) 的侧链保护产物h c y s ( t r t ) - o h 合成的溶剂体系，在f m o c h i s ( t r t ) 一o h 的优化实验条件基础上，合成了c y s 的保护产 物f m o c c y s ( t r t ) o h ，其收率和纯度也都分别达到了8 0 以上和9 5 以上。 3 实验中为合成多肽的需要，还成功合成了非标记和5 n 标记的无侧链保护的 氨基酸衍生物f m o c p h e o h ，f m o c p r o o h ，f m o c l i e o h 和f m o c v a l o h ，并经紫 外扫描，熔点测定，质谱和h p l c 分析得以确证。同时实验还制备了载量适中的氨基 酸与树脂的偶联产物f m o c p h e w a n g 树脂。 4 采用f m o c 固相合成法( s p p s ) 成功合成了非标记和部分1 5 n 标记( 带标记的 氨基酸为p h e 、p r o 、l i e 、v a l ) 的8 肽一血管紧张素i i ( a n gi i ) ，其氨基酸残基序列 为a s p a r g - v a l t y r - i l e h i s p r o p h e 。 5 对非标记a n gi i 合成实验条件做了单因素考察，确定合适的反应时间和反应 物用量配比，最后得到粗产品的收率为8 0 以上，用h p l c 半制备柱纯化处理，经 h p l c 分析、m s 、氨基酸序列分析鉴定合成产物。结果表明：纯化后产品纯度达到 9 8 以上；质谱测得非标记和部分1 5 n 标记产品分子量分别为1 0 4 6 和1 0 5 0 ，与理论 分子量相符；氨基酸序列测定为a s p a r g v a l t y r - l i e 。h i s p r o p h e ，与设计序列一致。 关键词：1 s n 标记氨基酸f m o c 肽合成血管紧张索( a n g i i ) i 硕士学位论文 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fp e p t i d es c i e n c e ，t h ec o n c e p ta n dm e t h o do fs o l i d p e p t i d es y n t h e s i s ( s p p s ) w e r em o r ea n dm o r eu s e di nm a n yk i n d so fa s p e c t sl i k e c h e m i s t r ya n db i o l o g y t h ep e p t i d es y n t h e s i sw a sac o n t r o l l e ds y n t h e s i so fd i f f e r e n t a m i n oa c i d sa c c o r d i n gt oac e r t a i ns e q u e n c e t h ed i f f i c u l t i e sw e r et h a tt h ef u n c t i o n a l g r o u p so fa m i n oa c i d sw e r ep r o n et or e a c tw i t hp e p t i d es y n t h e s i sr e a g e n t s ，w h i c h c a u s et h ei n c r e a s eo fb y - p r o d u c t ，a n dt h et r o u b l eo fs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o na n d t h el o w e rr e a c t i o ne f f i c i e n c y t h e r e f o r e ，i no r d e rt og u a r a n t e et h es a t i s f i e dp r o c e s so f t h ep e p t i d es y n t h e s i s ，a ne s s e n t i a lr e q u i r e m e n ti st h ea p p r o p r i a t es e l e c t i o na n du s eo f t e m p o r a r yp r o t e c t i n gg r o u p sf o rt h ea m i n oa c i d s a c c o r d i n gt op e p t i d e ss y n t h e s i s t h e o r y , t h ep r o t e c t i o ns t r a t e g yo fh i s t i d i n ea n dc y s t e i n ew a se s t a b l i s h e da n do p t i m i z e d t h e nu n l a b e l l e da n dp a r t i a l 15 n l a b e l l ，e da n g i o t e n s i n ( a n gi i ) w a ss y n t h e s i z e db yt h e w a yo ff m o cs o l i dp e p t i d es y n t h e s i s a n df i n a l l y , t h ep r o d u c t sw e r ep u r i f i e da n d a n a l y s e d 1 i nt h ee x p e r i m e n t s ，r e a c t i o nc o n d i t i o n so fh i sw e r em a i n l yi n v e s t i g a t e db y t h ee x p e r i m e n td e s i g n s ，l i k es i n g l e - f a c t o rd e s i g n ，c e n t r a lc o m p o s i t e ( o rr e s p o n s e s u r f a c e ) d e s i g na n do r t h o g o n a ld e s i g n t h ef i n a lo p t i m i z e dc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e d ， a n dt h ey i e l d so ft h et w os t e p sr e a c h e da b o v e8 0 r e s p e c t i v e l y t h ep u r i t yw a sa b o v e 9 5 2 t h r o u g hs i n g l e f a c t o rd e s i g n ，t h er e l a t i v e l ye x c e l l e n ts o l v e n ts y s t e m sf o r s y n t h e s i so fh c y s ( t r t ) 一o hw e r ec o n f i r m e d 。b a s e do nt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n so f s y n t h e s i so ff m o c - h i s ( t r t ) - o h ，f m o c - c y s ( t r t ) 一o hw a ss y n t h e s i z e d a n di t sy i e l d a n dp u r i t yw e r ea b o v e8 0 a n d9 5 r e s p e c t i v e l y 3 f o rt h er e q u i r e m e n to fp e p t i d es y n t h e s i s ，t h eu n l a b e l l e da n dl a b e l l e dn f m o e p r o t e c t i o no fa m i n oa c i d s ，s u c ha sf m o c p h e - o h ，f m o c p r o o h ，f m o c - i l e o h ， f m o c v a l - o h ，w e r es y n t h e s i z e d t h ep r o t e c t i o np r o d u c t sw e r ei d e n t i f i e dw i t h s c a n n i n gu v , m e l t i n gp o i n t ，m sa n dh p l c m o d e r a t e l yl o a d e df m o c p h e - w a n g r e s i nw a ss y n t h e s i z e dt o o 硕十学位论文 4 u n l a b e l l e da n dp a r t i a l 15 n l a b e l e da n gi i ( t h el a b e l l e da m i n oa c i d sw e r ep h e ， p r o ，l i ea n dv a l ) w e r es y n t h e s i z e db yf m o c - s p p s t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo f a n g1 1 w a s a s p a r g - v a l t y r - i l e h i s p r o - p h e 5 s i n g l e f a c t o rd e s i g nw a su s e dt od e t e r m i n et h ee x p e r i m e n tc o n d i t i o n so fa n g i i s y n t h e s i s t h e r e f o r e ，t h ea p p r o p r i a t er e a c t i o nt i m ea n d r e a c t a n t sp r o p o r t i o nw e r e f o u n d t h ey i e l do fc o a r s ep r o d u c tw a sa b o v e8 0 t h ec o a r s ep r o d u c tw a sp u r i f i e d a n di d e n t i f i e db yh p l c ，m sa n da m i n oa c i ds e q u e n c ed e t e r m i n a t i o n t h er e s u l t s w e r ea sf o l l o w s ：t h ep u r i t yo ft h ep u r i f i e dp r o d u c tw a sa b o v e9 8 ：t h em o l e c u l a r m a s s e so fu n l a b e l l e da n dp a r t i a l 15 nl a b e l e da n g i i ( t h el a b e l e da m i n oa c i d sw e r e p h e ，p r o ，l i e ，v a l ) w e r e10 4 6a n d10 5 0r e p e c t i v e l y , w h i c hw e r em a t c h e dw i t h a c a d e m i c m o l e c u l a r m a s s e s ； a n dt h ea m i n oa c i d s e q u e n c e w a s a s p a r g - v a l t y r - i l e - h i s - p r o - p h e i tw a s a l s ot h es a m ea st h ed e s i g n e ds e q u e n c e k e y w o r d s ：1 5 n ；l a b e l l e d ；a m i n oa c i d ；p e p t i d es y n t h e s i s ；a n g i o t e n s i n ( n n gi i ) 硕士学位论文 第一章绪论 1 1 肽合成基础 1 1 1 肽合成的基本原理 合成肽的过程主要是通过一个氨基酸的仅羧基与另一个氨基酸的g t 氨基 通过酰化反应缩合完成的，其反应过程如图l 所示： r ir 2 h 2 n 一占h c o o h + h 2 n 一占h c o o h = 坚! 全 r br z ii h 3 n c h c o n h c h 一o h 图1 - 1 合成肽的基本反应 f i g 1 1t h eg e n e r a lr e a c t i o no f p e p t i d es y n t h e s i s 多肽合成的基本合成方法可分为液相合成和固相合成两大类。固相合成即 在固相载体上的肽合成方法，是在液相合成之后发展起来的，最初是由r b m e 一矗e l d 【1 1 在1 9 6 3 年提出的，现在称之为固相肽合成( s p p s ) ，是肽化学的一 个重大突破，为此，m e r r i f i e l d 赢得了1 9 8 4 年的诺贝尔化学奖。此法更优于液 相合成，它既克服了液相合成的费时和烦琐，又降低了由操作带来的损失，具 有方便、快捷、操作简单、产率高的优势，为自动合成多肽奠定了基础。 在固相合成中，先从c 端开始组装肽链，即将目标肽的第一个氨基酸经其 羧基连接到载体上，这种载体应该很容易从试剂或溶解的产品中过滤而分离出 来，合成过程如图1 - 2 所示【2 】：首先，在聚合物载体上引入连接臂( 步骤1 ) ； 其次，n 端保护的氨基酸与连接臂的官能团反应( 步骤2 ) ，然后脱除临时保护 基( 步骤3 ) ，与下一个氨基酸缩合( 步骤4 ) ，然后重复第3 步和第4 步( 步骤 5 ) ，直至合成所需的序列；再次，裂解连接臂与肽链之间的共价键，在许多情 况下，半永久性侧链保护基同时脱除( 步骤6 ) ；最后，将不溶性的载体从溶解 的产品中过滤除去。 硕十学位论文 i：圈， y 、n i h o h o h 图1 - 2 多肽的l 占| 相合成过程 f i g 1 - 2t h ep r o c e s s e so fs p p s 在温和反应条件下，肽合成过程是通过活化一个氨基酸的羧基部分，第二 个氨基酸则亲核进攻活化的羧基部分而形成二肽，如果羧基组分的氨基未保护， 肽键的形成则不可控制，可能形成线形肽和环肽等副产物，与目标化合物混在 上 i 硕士学位论文 一起。所以在肽合成过程中，为了得到理想的目的肽，首先需要对其中一个氨 基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基进行封闭或保护，同样的，如果所用氨基酸 的侧链( r 1 和r 2 中) 上有影响反应的活性官能团，也需要对这些活性基团加以 封闭或保护。根据氨基酸保护基的不同，多肽固相合成方法可以分为两大类： b o e 方法和f m o c 方法。这两种方法的合成原理基本相同，但由于保护基有差 异，后面所应用的一系列试剂、条件等都发生了相应的改变。 1 1 1 1b o c ( 叔丁氧羰基) 多肽固相合成法 b o c 合成法是经典的多肽固相合成法，b m e r r i f l e l d 在合成血管舒缓激肽 时，就是应用b o c 作为a 氨基酸的保护基。b o c 合成法是采用t f a ( - 一氟乙酸) 可脱除的b o c 为a 氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。合成时将一个b o c 氨基 酸衍生物共价交联到树脂上，用t f a 脱除b o c ，用三乙胺中和游离的氨基末端， 然后通过d c c 活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用h f 法或t f m s a ( 三 氟甲磺酸) 法。到目前为止，用b o c 法已成功地合成了许多生物大分子，如活性 酶、生长因子、人工蛋白等。 在b o c 合成法中，反复地用酸来脱保护，这种处理带来了一些问题：如在 肽与树脂的接头处，当每次用5 0 t f a 脱b o c 基时，有约1 4 的肽从树脂上 脱落，因此，合成的肽越大，这样的丢失越严重；此外，酸催化会引起侧链的 一些副反应。b o c 合成法尤其不适于合成含有色氨酸等对酸不稳定的肽类。 经过查阅大量的资料发现，现在b o c 合成法的使用率不高，正逐渐被f m o c 方法 所替代，但是b o c 法本身的优点还是不容忽视，有些方面值得我们借鉴和应用。 如澳大利亚科学家l m i r a n d a t 3 】等在利用“化学选择连接”法合成蛋白质时，选 择b o c 方法合成组成蛋白质的各个片段。与f m o c 方法相比，他们认为b o c 方法更 干净、更可靠，更能快速去除仅一氨基保护基。f m o c 合成法则过度依赖于肽序列， 并且不易完全去除a 一氨基的保护基。 1 1 1 2f m o c ( 9 一芴甲氧羰基) 多肽固相合成法 r b m e r r i f i e l d 曾报道，固相多肽合成由于反应的不完全，导致副反应产物 的积剥4 1 ，他期待固相多肽合成法的进一步完善。不负他所望，经过四十年的历 程，固相多肽合成法已经得到了很大程度的改善。1 9 7 8 年，c h a n g 、m e i e n 1 0 f e r ；f - t l a t h e r t o n 等人采用c a r p i n o 【5 】报道的f m o c ( 9 芴甲氧羰基) 基团作为0 【氨基保护 3 硕+ 学位论文 基，成功地进行了多肽的f m o c 固相合成。f m o c 法与b o c 法的根本区别在于采用 了碱( 常用哌啶) 可脱除的f m o c 为a 氨基的保护基，侧链的保护采用t f a 可脱除 的叔丁氧基等，树脂采用9 0 t f a 可切除的对烷氧苄醇型树脂和i t f a 可切除的 二烷氧苄醇型树脂，最终的脱保护避免了强酸处理，如图1 3 所示。同时，f m o c 基团有特征性的紫外吸收( k 戤= 2 6 7 m ) ，易于检测控制反应的进行【3 ，6 1 ，因此， 越来越受到人们的青睐。 i * 够a夥媛 ： ：，燃绉影锈僦绷绣鳓肇 嚣猫9 蟛 l 露珏 每纠。一办p 。弋 嘶鳓懒r 鲇磁貉勃锄嬲蜥删槔锄媳黔 图1 3f m o c 法二肽合成中氨基酸保护和脱保护 f i g 1 - 3t h ef m o cs t r a t e g yi l l u s t r a t e df o rt h es y n t h e s i so fad i p e p t i d e 在合成具体蛋白质时，根据蛋白质所含有的具体的氨基酸，应该选择与之相 适应的树脂，第一个氨基酸与树脂结合率的高低将直接影响目的肽的最终合成 量。因此在合成结构较复杂的蛋白质时，可以将b o c 方法和f m o c 方法结合使用。 1 1 2氨基酸的保护与脱保护策略 1 1 2 1a 氨基的保护 在选择氨基酸保护基时，要充分考虑反应选择性的问题，即a 氨基保护基 团和c 羧基保护基团是暂时性保护基团，当一个氨基酸结合到肽链上后，暂时 性保护基要能立刻脱除。因此，暂时性保护基必须符合下列要求：1 ) 引入保护 基后的氨基酸衍生物不再保持两性离子结构状态；2 ) 脱保护时，不能破坏半永 久性保护基或肽键的稳定性；3 ) 在所有必要的操作过程中，不能发生消旋；4 ) 必须有利于保护中间体的稳定性和表征；5 ) 必须有利于保护氨基酸的溶解性。 而侧链保护基团是“永久性 保护基团，在肽的合成过程中不会受到反应物的 影响，不发生反应，当肽合成结束后，所有保护基都要脱除并且脱除过程不会 影响目的肽的结构和性能，所以侧链保护基团的稳定性要大于q 氨基保护基团 和q 羧基保护基团。氨基酸保护基的选择直接关系到合成产物的得率与纯度， 反应中形成的副产物和消旋化为纯化带来很大的困难，因而开发新型的保护氨 4 硕士学位论文 基酸是固相多肽合成的重要组成部分。目前，研发出的氨基酸氨基保护基有将 近二百种，主要有烷氧羰基、酰基和烷基三大类。 同液相合成一样，固相合成中多采用烷氧羰基类型作为0 t 氨基的保护基， 因为这样不易发生消旋。最早是用1 9 3 2 年由b e r g m a n n 和z e n v a s 提出的苄氧羰 基( c b z ) ，由于它需要较强的酸解条件才能脱除，所以后来改为叔丁氧羰基 ( b o o ) 保护，用t f a ( 三氟乙酸) 脱保护，但不适用含有色氨酸等对酸不稳 定的肽类的合成。1 9 7 8 年，c h a n gm e i e n l o f e r 和a t h e r t o n 等人采用c a r p i n o t 5 】报 道的f m o e ( 9 芴甲氧羰基) 作为伐氨基保护基，f m o c 基对酸很稳定，但能用哌啶 c h 2 c 1 2 或哌啶d m f 脱去。 f m o c ( 9 芴甲氧羰基) 的几个特性使它在固相合成中几尽完美。它具有特别 的酸稳定性；有高的紫外吸收( k 觚= 2 6 7 n m ) ，这使酰化和去保护反应能够被 检测；同基于叔丁基( t b u ) 的侧链保护完全兼容。并且，f m o c 氨基酸通常容 易制备，产量高，性质稳定。f m o c 基团对有机碱不稳定，特别对二级胺，如哌 啶。表1 - 1 列出了几种常见的氨基保护基。 5 硕士学位论文 表1 1 几种代表性的氨基保护基及其稳定条件【7 1 t a b l el - ls e v e r a lr e p r e s e n t a t i v en op r o t e c t i n gg r o u p sa n dt h e i rs t a b l ec o n d i t i o n s _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ - - _ _ _ _ 一。一一 _ p r o t e c t i n gg r o u p ( a b b r e v i a t i o n )s t r u c t u r e c l e a v a g ea g e n t s s t a b i l i t y t r i f l u o r o a c c t y lm 潮 f i c c 0 一溉 a c i d s 。h z p d p h t h a l o y l ( p l l l ) r a , c o h y d r 幽h z p d , c f ，c o o h u c o b e n z y l o x y c a r b o n y l ( z ) 4 - m e t h o x y b e t 坦 y l o x y e a r b o n y l m o 萄 4 - d l h y d r 锨y b o r o 触矧b c i 埘l o x y 德r b o n y l ( d o b z ) 9 - f l u o r e n y l r a c t h o x y 龃t b o n y l ( f m o c ) 邓5 - d i m e t h y l o x y p h e n y l ) p m p y l 2 o x y c a r b o n y l ( z ) c l z ) 2 - n i t r o p b c n y l s u l f e n y l n 嘲 s c o l s c o 一 加，一。一c o l k o l l 拜删，h 8 r c h s c o o h h z j p d c f s c o o h ，b a s e c f ) c o o h ，h 2 p d b a s e h z 伊d , h 2 0 z ，h b r c h ) c o o h c f ) c o o h 。确睇 c f ) c o o h h s e h 删 h 2 烈b a s e 8 c i d l s c f 3 c o o h ，c h 3 a z ，矗，h 护d b a s e 瞻a j ca c l 出 f m o c 的引入通常是在弱碱条件下，用f m o c c 1 与氨基酸反应【8 】，如图l 一4 。 然而，有些氨基酸，特别是g l y ，a l a ，p h e 等，能被f m o c 二肽和三肽污染， 杂质含量可达2 - 2 0 9 1 。这些杂质需要通过严格的重结晶来去除，从而减少了 总产量。为此，f m o c - c i 已经很大程度上被活性更低的羟基琥珀酰亚胺酯 f m o c o s u 代替【1 0 , 11 】。 6 、q ，“琴g h 酚鼢嘎辫 硕士学位论文 文。滞h r “肼一一 p - , 。，j ：洲点“删川扣魄 因为溶解度问题，反应体系的溶剂选择很重要，常用二氧杂坏已烷 ( d i o x a n e ) ，其它溶剂有丙酮 12 1 ，乙腈【1 3 , 1 4 】，二甲氧乙烷( d m e ) 1 5 , 1 6 】。 1 1 2 2 侧链的保护和脱保护 超过一半的氨基酸其侧链包含有反应活性的官能团，因为肽合成采用了相 当剧烈的反应条件，同时要求各步反应有尽量高的效率，因此，在固相合成中， 通常要求封闭所有这些有潜在活性的基团。常规的合成通常要求肽在从树脂上 剪切的同时也完全脱去所有侧链保护基。在固相合成中也有许多保护基团可以 被选择性的脱出，这样可以对其中单个残基进行选择性的修饰，这一点可以应 用于环肽、磷肽的合成。 下面对各含有活性官能团的侧链保护策略进行归类： 1 ) 天冬氨酸( a s p ) 和谷氨酸( g l u ) 天冬氨酸( a s p ) 和谷氨酸( g l u ) 具有两个羧基，在碱或者强酸的作用下，侧链 上羧基容易发生副反应，如天冬氨酸在活化时形成的侧链酯经相应的琥珀酰 亚胺中间态生成异天冬酰胺肽。a s p 和g l u 的侧链羧基的保护在f m o c 策略中 常用叔丁基酯( t b u ) 1 7 】，在b o c 策略中使用d 环己基酯( o c h e x ) 。可用t f a 、 t m s b r 等脱除。这两种保护基团通常可以抑制上述副反应的发生，但是当a s p 与g l y 、t h r ( t b u ) 、c y s ( a c m ) 连接时，副反应十分剧烈。近年来，发展了一些 新的保护基如环烷醇酯、金刚烷醇酯等可减轻这一副反应，这些保护基可用 t m s o t f ( 三氟甲磺酸三甲硅烷酯) 除去。 2 ) 丝氨酸( s 哪、苏氨酸( t h r ) 和酪氨酸( t y r ) s e t 、t h r 的羟基及t y r 的酚羟基都是活泼基团，必须在多肽固相合成过程 7 硕+ 学位论文 中加以保护，通常用t b u 保护【18 1 。叔丁基的引入比较麻烦，首先将s e r 制成苄 氧羰基酯，再在酸催化下与异丁烯反应。s e r 和t h r 还可用苄基保护，s e r 用苄 醇引入苄基、t h r 用溴苄引入苄基。t b u 可用t f a ( 室温下反应2 h ) 、h c l t f a 或用浓h c l 在1 0 下反应1 0 r a i n 脱去。 3 ) 门冬酰胺( a s n ) 和谷氨酰胺( g i n ) a s n 和g i n 侧链的酰胺键在肽合成中一般不加以保护。但合成大肽时，a s n 和g i n 的a 羧基活化时可能会发生分子内脱氢反应生成氰基化合物。碱性时g i n 的侧链可以环化生成酰胺。而且不保护的f m o c g i n 和f m o c a s n 在d c m 中溶 解度很差。为了避免这些问题，可以用9 咕吨基，2 ，4 ，6 三甲氧苄基，4 ，4 二甲氧二苯甲基或三苯甲基【1 9 】等保护，这四种基团均可用t f a 脱除。 4 ) 组氨酸( h i s ) h i s 是多肽合成中问题最大的氨基酸之一，当组氨酸的咪唑坏未被保护时， 主要存在两个问题：n 酰化和消旋化，因此，必须加以保护。对咪唑环的非兀n 开始用苄基( b z l ) 矛n 甲基磺酰基( t o s ) 保护，但这两种保护基均不太理想。t o s 对 亲核试剂不稳定，b z l 需要用氢解或n a n h 3 除去，并且产生很大程度消旋。b o c 基团是一个较理想的保护基，降低了咪唑环的碱性，抑制了消旋，成功地进行 了一些合成。+ 但是当反复地用碱处理时，也表现出一定的不稳定性。哌啶羰基 在碱中稳定，但是没能很好地抑制消旋，而且脱保护时要用很强的亲核试剂。 为了弥补上述基团的不足，对咪唑环7 c n 的保护可以用苄氧甲基( b o m ) 和 叔丁氧甲基( b u m ) 保护，b u m 可以完全屏蔽咪唑基团引起的消旋化的7 【氮原子， 缩合反应条件下也很稳定，用t f a 或t f m s a 脱除。b o r n 更稳定些，需用催化 氢解或强酸脱保护，b u m 是目前很有发展前途的h i s 侧链保护基，其不足之处 在于f m o c h i s ( b u m ) 在d c m 和d m f 中的溶解度较差，不利于多肽合成反应的 进行。 目前得到广泛应用的是t r t 作为其侧链保护基f 18 1 。t r t 屏蔽咪唑基团兀氮原 子，可以有效抑消旋化发生。尽管由于t r t 空间位阻较大，导致反应比较缓慢， 但是t r t 的空问位阻可以有效地减少碱催化的重排作用，减少了副反应的发生。 t r t 在肽合成过程中十分稳定，合成后用9 5 t f a 可以很容易脱去。 5 ) 半胱氨酸( c y s ) 硕+ 学位论文 c y s 的s h 具有强亲核性、易氧化性和酸性等特性，易被酰化成硫醚，也 易被氧化为二硫键，要求在所有合成过程中将s h 选择性屏蔽。常用的保护基 有三类：一类用t f a 可脱除，如对甲苄基、对甲氧苄基和三苯甲基等；第二 类可用( c f 3 c o ) 3 t i t f a 脱除，对t f a 稳定，如t - b u 、b o r n 和乙酰胺甲基等。 第三类对弱酸稳定，如苄基和叔丁硫基( s t b u ) 等，c y s ( s t b u ) 口- t 用巯基试剂和磷 试剂还原，c y s ( b z l ) 可用n a n h 3 脱保护。利用各基团脱保护条件的差别，可以 选择性进行二硫键的形成。 6 ) 精氨酸( a r g ) a r g 的胍基具有强亲核性和碱性，必须加以保护。理想的情况是三个氮都 加以保护，实际上仅保护1 或2 个胍基氮原予。保护基分四类：( 1 ) 硝基：( 2 ) 烷氧羰基：( 3 ) 磺酰基；( 4 ) 三苯甲基。硝基在制备、酰化裂解中产生很多副反应， 应用不广。烷氧羰基主要有b o c 和二金刚烷氧羰基( a d o e ) 2 、f m o c a r g ( b o ) c 的 耦联反效率不高，哌啶处理时不稳定，会发生副反应；a d o c 保护了两个非7 c n ，但有同样的副反应发生。对磺酰基保护，其中t o s 应用最广，但它较难脱 除。近年来2 ，3 ，6 三甲基4 甲氧苯横酰基( m t r ) 较受欢迎，在t f a 作用下，3 0 分钟即可脱除，但是它们都不能完全抑制侧链的酰化发生。三苯甲基保护基可 用t f a 脱除，缺点是反应较慢，侧链仍有酰化反应，且其在d c m 、d m f 中溶 解度不好。而2 ，2 ，5 ，7 ，8 五甲基苯并二氢吡喃一6 磺酰基( p m c ) 以及类似物p b f 作为 新的a r g 保护基得到广泛应用。 7 ) 赖氨酸( l y s ) l y s 的n h 2 碱性很强，同时具有亲核性，必须加以保护，但与0 t - n h 2 的 保护方式应不同，该保护基要到肽链合成后除去。e - n h 2 的保护无消旋问题， 在b o c 策略中，通常用2 一氯苯甲氧羰基 z ( 2 一c 1 ) 保护，对酸稳定性较好，在解 离b o c 基团过程中，可以防止提前脱去侧链保护基团的现象发生。f m o c 策略 中，可以采用酰基保护基，其它常用的保护基有苄氧羰基和b o c 2 2 1 。 8 ) 色氨酸( t r p ) f m o c 策略中t r p 一般不需要侧链保护，但最后其它侧链氨基酸保护基脱除 时，吲哚的叔丁基化和磺化作用会加剧，采用酸不稳定的b o c 基团保护是阻止 上述副反应的一种好方法【2 3 1 。 9 硕+ 学位论文 b o c 策略合成含有t r p 的多肽时，吲哚易发生环化或二聚反应，因此必须 保护吲哚部分。通常用n m 甲酸基( f o o 基团保护，f o r 对反复的t f a 的处理稳 定，可用碱或h f 硫醇除去。但是也带来其它问题，如臭味、硫醇的聚合副反 应。此外，z 基团和l ，3 ，5 三甲基苯磺酰基( m t s ) 可用于保护t r p ，但是z 基团用 h f 脱保护方法除去时，反应不完全；而m t s 基团在肽合成过程中，会被t f a 逐渐分解。 1 2 血管紧张素研究进展 t i g e r s t e d tr 等于1 8 9 8 年发现肾素( r e n n i n ) 币 ib r a u n m e n e n d e ze 等于1 9 3 9 年发现血管紧张素( a n g i o t e n s i n ，a n g ) 而开拓了肾素一血管紧张素系统 ( r e n i n - a n g i o t e n s i ns y s t e m ，p j l s ) 的百年研究历史。 1 2 1 a n g l i 的生成及其作用 血管紧张素原( a t o ) 是一种仅2 球蛋白，经蛋白电泳证实为体内糖蛋白之一， 其结构为1 4 肽，分子量为4 7 0 0 0 6 6 0 0 0 ，主要在肝脏合成，但在许多肝外组织 如脑、脊髓、主动脉平滑肌层及外膜、肠系膜、肾、肾上腺、心房、肺等也有 a t o m r n a 表达。雌激素、糖皮质激素、甲状腺激素、a n gi i 、胰岛素等有促 进肝脏合成a t o 的作用。但肝外组织a t o 合成的调节却很复杂且机制各异。 循环中血管紧张素原半衰期长达数小时，其血浆浓度相当稳定。若血浆中血管 紧张素原浓度升高，则必将导致血管紧张素生成率增加；反之则降低。 在循环或局部肾素作用下，a t o 的n 端第l o 位亮氨酸和第1 1 位缬氨酸之 间的肽键断裂，水解出l o 肽的a n gi 。a n gi 在血浆和组织尤其是肺循环血管 内皮表面的a c e 的作用下，水解产生a n g i i ；此外，a n gi 尚可在心脏的胃促 胰酶( 糜蛋白酶) 和组织蛋白酶g 作用下，经非a c e 途径产生a n g l i ；a t o 也可在组织蛋白酶g 、胰蛋白酶及激肽释放酶的作用下直接转化为a n gi i 。a n g i i 在血浆和组织中的血管紧张素酶a 的作用下，转变为a n g l i i 。a n gi 尚可在 中性肽链内切酶和脯氨酰肽链内切酶作用下转变为a n g - ( 1 7 ) 。a n g i i 也可在脯 氨酰肽链内切酶或脯氨酰羧肽酶作用下转变为a n g ( 1 7 ) 。脯氨酰肽链内切酶具 有组织特异性，存在于上皮、血管内皮细胞( v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l ，v e c ) 和血管平滑肌细胞( v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l ，v s m c ) 膜表面。应用a c e 1 0 硕+ 学位论文 抑制剂( a c ei n h i b i t o r ，a c e i ) 和a n g i i 受体拮抗剂后，a n g - ( 1 7 ) 的量将增加 2 5 5 0 倍。上述过程如图1 5 所示。 a s p - a r $ - v e d - t y r - h e - h i s - p r o - p h e - h b - l e u - v a l - i l e - h i s - r a s l r a r g - v a l - t y r - i i e - h i s - p r o - p h e - h i s - l e u a s p - a r g - v e j - t y r - l l e - h i s - p r o - p h e a t 8 v a l - t y r - i l e - h b - p r o - p h e a n g i o t e n s i n o g e n - ( f mk i d i 。，神 a n g i o 坤i l ii i c 0 a v e r t i n g m z y m e ( b l l - n 妒口d d 畴w 晡) a n g i o t e n s i n 。 i i p 印舡d _ a n g i o t e n s i ni i 图l - 5 血管紧张素的结构和形成过程 f i g 1 - 5s t r u c t u r ea n df o r m a t i o no fa n g i o t e n s i o n a n gi i 是肾素一血管紧张素系统在体内调节水、电解质平衡和动脉血压的重 要成分。它是一种八肽化合物，是内源性升压物质中作用最强的激素。它具有： 1 ) 收缩血管作用，其效力为去甲肾上腺素的1 0 4 0 倍，是一个强有力的血管平 滑肌收缩物质；2 ) 参与水盐代谢作用，促使醛固酮分泌，参加贮钠排钾作用， 在低剂量下可使肾血流量、肾小球滤过率下降进而使水盐阻留，高剂量能排水 及钠，维持水盐平衡；3 ) 刺激肾上腺髓质释放儿茶酚胺。刺激肾脏可分泌前列 腺素( p r o s t a g l a n d i n s ，p g ) ；4 ) a n gi i 还可以使大脑和垂体分泌血管加压素( a v p ) 及促皮质素( a c t h ) ，兴奋交感神经释放甲肾上腺素。 a n g i 虽含有血管紧张素系统全部作用所必须的肽序列，但无生物活性，必 须通过转换酶系统将其转化为a n g l i 才能表达其活性。a c e 广泛分布于全身实 质性器官，各组织所含浓度不已，但以肺部血管内皮细胞含量最高，约占4 2 。 a n g i 主要通过肺部转换酶的降解，由十肽变为8 肽。实验证明，血流经过肺部 一次即有7 5 a n g i 转化为a n g l i 。倘由静脉注射a n g l 经过一次肺循环，其中 2 0 4 0 降解为a n g l i 。 a n g i i i 是七肽化合物，它是a n g i i 在氨基肽酶的作用下从氨基木端切去天 冬氨酸形成七肽，再在多肽酶的作用下，生成无活性多肽和氨基酸。a n g l i i 其 升压效果只有a n g l i 的2 0 ，刺激肾上腺分泌醛固酮的作用等于或大于a n g l i ， 对血管的收缩能力约为a n g i i 的1 3 1 2 。 1 2 2 a n g 的研究方法 可从a n g 的含量、受体、a n g m r n a 表达等多个水平研究a n g 。目前常用 硕士学位论文 方法有高效液相层析、免疫组化技术、放射自显影术、d n a 重组技术、定量反 转录p c r 技术、原位杂交、分子杂交等方法。 1 3 稳定同位素标记化合物应用 同位素标记的氨基酸是氨基酸中的普通原子被它的同位素所代替形成的标 记物，同普通的氨基酸相比，在实验过程中，通过放射性探测仪、质谱、核磁 共振等分析检测仪器可以观察到氨基酸中同位素原子的走向，为人们在科学研 究中提供了一个安全、有效、方便的示踪工具，用以揭示其在动植物体内的转 运转化过程、诊断疾病、探索化学物质的合成机理等。 1 5 n 作为示踪剂广泛应用于生物化学、医学、药学和农业科学等领域，尤 其对生命科学研究有极为重要的意义。在蛋白质的人工合成方面，1 n 标记氨 基酸起着独特的示踪作用，其应用也越来越广泛。又由于1 5 n 标记化合物具有