（生物化学与分子生物学专业论文）蜘蛛肽类毒素的结构与功能研究.pdf

中文摘要 多肽毒素存在于自然界的很多生物物种中，生物学活性是多肽毒 素研究一个极为重要的方面。综述了多肽毒素的生物学活性及相应的研 究方法。 通过离子交换和反相- i p l c 从海南捕鸟蛛粗毒分离了海南捕鸟蛛毒 素一i v ，m a l d i - t o f 测定其分子量为39 8 8 7 0 ，通过氨基酸组成分析、 c y s 烷基化修饰、l y s c 酶水解后h p l c 分离片段序列测定和羧肽酶一1 c 一 端测序确定了其氨基酸序列为：e c l g f g k g c n p s n d q c c k s s n l v c s r k h r w c k - y e i ，该序列与从虎纹捕鸟蛛分离的h w t x - i v 只相差7 个氨基酸残基 其中6 个c y s 形成3 对二硫键，在p h3 的条件下利用t c e p 对海南捕乌 蛛毒索一i v 进行了部分还原，收集r p h p l c 的洗脱峰，用碘乙酰胺烷基 化修饰游离的- s t t ，经质谱鉴定后进行氨基酸序列测定，由此确定了 c y s 2 一c y s i 7 、c y s 9 一c y s 2 4 和c y s l 6 一c y s 3 1 形成了卜4 、2 - 5 和3 - 6 的二 硫键配对方式。小鼠急性毒性实验确定海南捕鸟蛛毒素- i v 的l 队。为 0 2 0 士o 0 7m g k g ，而对美洲蜚蠊却没有影响。海南捕鸟蛛毒素- i v 能使电 刺激引起的大鼠输精管收缩产生先兴奋后抑制的作用，而对电刺激诱导 的小鼠膈神经膈肌收缩却只产生抑制作用，浓度为1 0 x l 旷m o l l 时 的阻断时间为1 8 1 0 2m i n ( 刀= 5 ) ，同时它对由去甲肾上腺素引起的 输精管收缩和直接电刺激肌肉引起的膈肌收缩没有影响，推测其具有神 经专一性。电生理实验表明海南捕乌蛛毒素- i v 能完全阻断t t x 一敏感型 的钠通道，而对钠通道的激活和失活没有影响，从而推测其是一种位点 一l 毒素。由以上结果可推断海南捕鸟蛛毒素一i v 为一种新型的作用于神 经细胞t t x - 敏感型钠通道位点一1 的阻断剂。通过固相化学合成法合成 了海南捕乌蛛毒素一i v ，并对其氧化复性条件进行了摸索，确定了0 1 m o l lt r is h c i 和0 im 0 1 ln a c i 缓冲液、p l l8 0 、样品浓度为0 1g l 、 塞塑墨 5 哪0 1 lg s i t 、0 5m m o l lg s s g 为最适条件。复性样品经质谱、与天 然毒素混合进样h p l c 分析和生物学活性分析，确定复性的海南捕鸟蛛 毒素i v 与天然毒素在结构和功能具有一致性。通过2 d n m r 技术已初步 确定了海南捕鸟蛛毒素一i v 的空间结构由两个d 一折叠和4 个p 一转角组 成，三对二硫键稳定这一构象。通过与i i w t x i v 和斗- c o n o t o x i ng i i i a 的比较分析，确定了转角- i v 为海南捕鸟蛛毒素一i v 的活性相关区域， 雨l y s 2 7 为活性关键残基。 从虎纹捕鸟蛛粗毒分离纯化到了虎纹捕鸟蛛毒素一i i i ( h w t x i i i ) 的 天然突变体( m - h w t x - i ii ) 和凝集素- i ( s h l - i ) 的天然突交体( s l h - ii ) 。 两种突变体的氪基酸序列都只比相应的毒素多肤少了c 一端的t r p 残基， 而其它序列完全相同。两者的序列分别为：d c a g y m r e c k e k l c c s g y v c s s r w k w c v l p a p 和g c l g d k c d y n n g c c s g y y c s r t 酥w c y l a g p 。通过比较研究它们 的生物学活性，发现虎纹捕鸟蛛毒素一i i i 的天然突变体没有虎纹捕鸟蛛 毒素- i i i 的使输精管收缩加强的作用，从而推测其c 一端残基为生物学 活性相关残基。凝集活性实验表明凝集素i 及其天然突变体具有相同的 凝集活性，同时1 d - n m r 分析确定两者空间结构相似，从而推测其c 一端 对于凝集素一i 不是活性相关残基。 关键词：海南捕鸟蛛毒素- i v 、氨基酸序列、二硫键定位、化学合成、 生物学活性、钠通道、结构与功能关系、天然突变体 a b s t r a c t an e u r o t o x i cp e p t i d e ( f t i , 1 1 1 x i v ) w a sp u r i f i e df r o mt h ev e n o mo ft h e s p i d e r s e l e n o c o s m i ah a i n a n aw i t hc o m b i n a t i o n o f i o n - e x c h a n g e a n d r e v e r s e - p l m s eh p l c t h ec o m p l e t eb m i n o a c i ds e q u e n c e ( 3 5r e s i d u e s ) w a s o b t a i n e db yu s i n ga u t o m a t e de d m a nd e g r a d a t i o n ，w h i c hi sa g r e e m e n tw i t h t h em o l e c u l a rm a s s39 8 8 7 0 d ab ym o s ss p e c t r o m e t r ya n dt h ea m i n oa c i d a n a l y s i s 。t h e a m i n oa c i d s e q u e n c eo fh n t x - i vi s s i m i l a rt ot h a to f h w t x - i v e x c e p to n l ys e v e nr e s i d u e s h n t x i v w a sp a r t i a l l yr e d u c e db y t c e pa tp h3 ，a n dt h ei n t e r m e d i a t e sw e r ei s o l a t e db yr e v e r s - p h a s eh p l c a l k y l a t i o no f f r e et h i o l s ，f o l l o w e db ys e q u e n c e ra n a l y s i s ，e n a b l e da l lt h r e e b r i d g e s t o b e i d e n t i f i e d ( c y s 2 一c y s t 7 ，c y s 9 一c y s 2 4 a n d c y s l 6 - c y s 3 1 ) h n t x - i v w 鹊s y n t h e s i z e db yu s i n gf m o c - c h e m i s t r ym e t h o d o l o g ya n dt h e r e n a t u r e dp e p f i d eh a dt h es a m e b i o l o g ya c t i v i t y 嬲t h e n a t i v et o x i n h n t x - i v i n d u c sl e t h a la c t i v i t yo nr a t sb u th a sn oe f f e c to nc o c k r o c h e s t h eu ) 5 0 0 f r a t s i s ( 0 2 0 o 0 7 ) m g k g h n t x - i vc o u r s e 5 e n h a n c e m e n to ft h et w i t c h r e s p o n s e i n d u c e db ye l e c t r o n l c a ls t i m u l a t i o no fv a sd e f e r e n sa n dt h e n i n b i b i f i o nc o m p l e t e l y h n t x - 1 vo n l yi n h i b i t st h ec o n s t r a c f i o no f p h r e n i c n e r v eh e m i d i a p h r a g m p r e p a r a t i o n s h n t x 4 vh a sn o e f f e c to nt h er h y t h m i c c o n t r a c t i o no fv a sd e f e r e n st r i g g e r e db ya d d i n gn o r a d r e n a l i n ea n dt h et w i t c h r e s p o n s eo fh e m i d i a p h r a g mi n d u c e db yd i r e c t l ys t i m u l a t i n gm u s c a l e ，w h i c h i n d i e a t st h a ti san e r v es p e c i f i ct o x i n e l e c t r o p h y s i o l o g i c a ls t u d i e ss h o w e d t h a th n t x - i vi n h i b i t s 嗽- ss o d i u mc u t l e t c o m p l e t e l y i nn g l 0 8 1 5c e l l s a n dh a sn oe f f e c to nt h ea c t i v a t i o na n di n a c t i v a t i o no f s o d i u mc u r r e n t , w h i c h s u g g e s t sh 、r i 一i vi s as i t e 一1t o x i na f f e c t i n gt h es o d i u mc h a n n e lt h r o u g ha m e c h a n i s m q u i t es i m i l a rt ot h a to f t x t h et h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f h n t x - i vh a sb e e nd e t e r m i n e db y2 d n m r t h er e s u l t i n gs l t u c t u r ei s c o m p o s e d o f ad o u b l e - s t r a n d e d a n f i p a m l t e l1 3 - s h e e tc l 2 2 一s 2 5m a dw 3 0 - y 3 3 ) a n dt h r e et u r n s ( e 4 一k 7 ，p i i - d 1 4 ，k 1 8 一k 2 1a n d r 2 6 - r 2 9 ) a n db e l o n g s 幻廿1 e i n h i b i t o rc y s f i n ek n o ts t r u c t u r a lf a m i l y c o m p a r i s o nw i t hp - c o n o t o x i ng n l a a n dh 、 r r x i vs h o w st h a tt h ep o s i t i v e l yc h a r g e d r e s i d u e s o f l o o pi v ( r e s i d u e 2 6 - 2 9 ) ，e s p e c i a l l yr e s i d u ec y s2 7 ，m u s tp l a yac r u c i a lr o l ei ni t sb i n d i n gt o n e u r o n a lt e t r o d o t o x i n - s e n s i t i v e v o l t a g e - g a t e ds o d i u m c h a n n e l t w op e p t i d e c o m p o n e n t s ，n a m e d m h w t x i i ia n d s h l - i i ，w e r e i s o l a t e df i o mt h ec r u d ev e n o mo ft h e s p i d e rs e l e n o c o s m i ah u w e n a 讥1 e s e q u e n c e so f t h et w o p e p t i d e sa l es i l n i l a rt ot h e s eo fh w t x q l ia n ds h l - i b e s i d e sl a c ko ft h ec - t e r m i n a lt r y p t o p h a nr e s i d u er e p e c t i v e l y m - h w t x - 1 1 1 n e i t h e rc a u s e s p a r a l y s i s i nc o c k r o a c h e s q ，a m e r i c a n a ) n o r e n h a n c e s e l e c t r i c a l l yi n d u c e d c o n t r a c t i o no f r a tv a sd e f e r e n s w h i l ea sh w t x - i i i d o e s t h er e s u l ti n d i c a t e st h a t t r p 3 3 i sak e yr e s i d u er e l a t e dt ot h e b i o l o g i c a l f u n c t i o no fh w t x - i i i s h l i ia n ds i i l i ，h o w e v e r , h a v et h es a m e h a e m a g g l u t i n a t i o na c t i v i t yt oe a c ho t h e r , w h i c hs u g g e s t st h a tt h ec - t e r m i n a l o f s h l ii sn o t i m p o r t a n t t oi t sh a e m a g g l u t i n a t i o n a c t i v i t y k e y w o r d s ：h a i n a n t o x i n - i v , p r i m a r ys t r u c t u r e ，d i s u l f i d e b o n d s l o c a t i o n , s y n t h e s i s ，b i o l o g i c a la c t i v i t y , s o d i u mc h a n n e l s ，s t r u c t u r ea n d f u n c t i o n ，n a t i v em u t a n t 缩写表 a c n c c a c p y c y s d t t f m o c g s h g s s g h p l c i a m l y s c m a l d i t o f 删r p i t c r p - h p l c t f a t t x 缩骂表 ( 中英文对照) 乙腈( a c e t o n i t r i l e ) 0 【一氰基一4 一羟基肉桂酸( o c c y a n o 一4 - h y d r o x y c i n n a m i c a c i d ) 羧肽酶一y ( c a r b o x y p o p t i d a s ey ) 半胱氨酸( c y s t e i n e ) 二硫苏糖醇( d i t h i o t h r e i t e l ) 芴甲氧羰基( 9 - f 1 u o r e n y l m e t h o x ) ，c a r b o n y l ) 还原型谷胱甘肽( r e d u c e dg l u t a m i n e ) 氧化型谷胱甘肽( o x i d i z e dg l u t a m i n e ) 高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c e1 i q u i dp h a s e c h r o m at o g r a m ) 碘乙酰胺( i o d o a c e t a m i d e ) e n d o p r o t e i n a s el y s 。c 基质辅助激光解吸飞行时间质谱( m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o nt i m e o f - f l i g h tm a s s s p e c t r o m e tr y ) 核磁共振( n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ) 异硫氰酸苯酯( p h e n y l is o t h i o c y a n a t e ) 反相高效液相色谱( r e v e r s e - p h a s eh p l c ) 三氟乙酸( t r i f i u o r o a c e t i ca c i d ) 河豚毒( t e t r o d o t o x i n ) 蒸= 童垒肽盔蠢出生堑堂适蝗妞究直洼 第一章多肽毒素的生物学活性研究方法 多肽毒素存在于自然界的很多生物物种中，在蜘蛛、芋螺、蝎、蛇 等动物的毒液中含有大量的多肽，这些多肽毒素对于动物本身的防御和 捕食起到极为重要的作用。随着多肽毒素研究的发展，越来越多的不同 生物学活性的多肽毒素被分离。也正因为如此，多肽类毒素对于神经生 物学，药理学等学科的研究有着极为重要的意义。另一方面，多肽毒素 是天然多肽的重要来源，这些多肽结构相对简单、稳定，是进行结构和 功能关系、分子设计、蛋白质折叠等研究的理想模式分子，通过比较这 些多肽的结构对于蛋白质的空间结构预测也有十分重大的意义。 毫无疑问，生物学活性是多肽毒素研究一个极为重要的方面，而在 当前多肽的分离纯化、一级结构测定、甚至空间结构的解析都已成为实 验室的一些常规的方法的情况下，生物学活性研究便成为多肽毒素研究 的重点和难点。以下综述了多肽毒素的生物学活性及相应的研究方法， 希望对于实验室蜘蛛毒素研究有一点帮助。 1 神经毒素 神经毒素是天然多肽毒素中含量最大的成分，是当前毒素研究的热 点。多肽神经毒素按其肽链长短可分为长链( 6 0 - 7 0 个氨基酸残基) 和 短链( 2 0 - 4 0 个氨基酸残基) ，长链毒素主要为蝎毒中作用于钠通道的d ， b 一毒素，而短链毒素种类繁多，功能各异。神经毒素按其生物学功能可 分为钠通道毒素、钾通道毒素、钙通道毒素、氯通道毒素、乙酰胆碱受 体毒素和谷氨酸受体毒素等类型。它们对于神经生物学、药理学的研究 和发展具有重要的意义，一些已知结构和作用机理的神经毒素已成为离 子通道、神经递质、受体、神经突触等神经生物学和药理学研究不可替 簋= 茎垄熬耋塞垃生麴堂遣性蟹窀左洼 一 代的工具试剂。从现有的研究手段和工具可从以下层次研究神经毒素的 生物学活性“”。 1 1 动物整体水平研究 整体水平的研究主要是指动物的急性毒性实验6 ，常用的动物有小鼠、 蟋蟀、蜚蠊和蝗虫等。实验方法主要是通过腹腔注射或脑室注射观测动 物的给药后症状，判断毒素的毒性强弱，求出毒素的l d ”或e d s “通过 注射动物还可以判断毒素作用的选择性，例如t l w t x i v 和i i n t x i v 能使 小鼠致死而对于蜚蠊无效，而很多专一作用于昆虫的毒素对于哺乳动物 没有影响，有的毒素甚至对于昆虫也具有选择作用性，如 c o v a l i t o x i n - i i 能使蟋蟀产生兴奋而对蜚蠊却没有影响，因而毒性实验 中因尽可能多选几种动物“1 。通过采用不同的注射方式也可以判断毒素 对于中枢神经系统或外周神经系统的选择性，例如i _ w r x - i i 在腹腔注射 小鼠无异常反应，而在脑室注射会使小鼠惊厥反应，证明h w t x - ii 作用 于中枢神经系统的某种受体”1 。 1 2 器官水平研究 通过在离体动物标本上进行药理学实验是研究毒素生物学活性的常 用的方法常被用于毒素研究的标本有小鼠膈神经一膈肌、大鼠输精管、 豚鼠回肠和离体心脏等“1 。膈神经一膈肌是运动神经纤维控制的典型的神 经肌肉接头标本，其突触后膜分布了大量的n 一型乙酰胆碱受体，膈肌体 积较b , 收缩稳定，对于药物较为敏感，而且在实验过程中可以选择性 的刺激肌肉或神经，因而有助于判定毒素的作用的选择性0 1 大鼠输精 管、豚鼠回肠都属于平滑肌收缩系统，输精管上分布了大量的0 【。、伐：肾 上腺素能受体，而回肠除了有仪肾上腺素能受体，更为重要的是分布大 量的妒乙酰胆碱能受体，通过电刺激标本上的神经末梢可诱导肌肉收 缩，或者通过加入相应的神经递质( 肾上腺素或乙酰胆碱) 也可诱导特 征性的收缩，通过测定药物对收缩( 电刺激和神经递质) 的影响，或者 是通过测定受体阻断剂( 如阿托品) 对于药物作用的影响可以初步判断 毒素的作用位点( 突触前膜或后膜) ，甚至是更为深入作用机理“州“1 。 簋= 耋丕放垂焘毁生堑堂适缝珏峦左洼 在迷走交感神经干控制的心脏在电刺激神经时可表现出两币 效应，在较 低频率和强度的电刺激下，表现为迷走效应释放乙酰胆碱抑制心脏的节 律收缩，而高频率和强大的电刺激下，阿托品化的心脏产生交感效应即 心脏的兴奋效应，同输精管和回肠标本一样，通过测定毒素对两种效应 的影响，有助于确定毒素的作用位点“。h w t x - i 就是通过在三种标本的 巧妙实验而确定其作用位点为突触前膜“”。以上几种标本的实验都是测 定毒素对于标本机械行为的影响，在器官水平还可以测定毒素对于标本 电效应的影响，如动作电位、终板电位和脑诱发电位等“”“”。器官水平 的研究实验操作比较简单，标本本身对于外界条件要求相对简单，但只 要设计得当，对于阐述毒素作用机理的确十分有帮助，同时对于许多问 题的阐明也不是膜片钳所能代替的。 1 3 细胞和通道水平的研究 1 3 1 膜片钳 n e h e r 和s a k m a n n 于1 9 7 6 年首次报告用膜片钳技术记录到细胞膜离子 单通道电流。经过2 0 多年的发展，这一技术得到了很大的发展，已被 广泛的应用于神经生物学、生理学、药理学等多种领域的基础和应用研 究中。膜片钳的关键技术的使用一尖端表面加热抛光的玻璃吸管与细胞 膜表面形成千兆封接。利用膜片钳技术可进行四种离子通道记录模式， 即细胞贴附式、外面向外、内面向外和金细胞记录模式“。 膜片锚是神经毒素的生物学活性研究中应用最为广泛的工具之一， 而在上述四种记录模式中又属全细胞模式应用最为广泛。金细胞模式可 记录细胞膜上同一种离子通道的电流总和，其电流强度较前三种单通道 记录电流大几个数量级，受外界的干扰较小；金细胞模式细胞损伤较小， 基本上保持原有功能，药物对于离子通道的影响可直接通过细胞功能表 现出来；电极直接与细胞内环境相通，可以进行细胞内给药；同时在实 验过程中可进行电压或电流钳制以研究药物对于离子通道的影响“1 。 利用膜片钳研究毒素的作用机理，非常关键的环节是选择合适的细 胞，因为不同细胞上的离子通道或受体的种类和分布各不相同，即使同 堇二童壹然叠耋数生堑堂适丝盟究左建 一 一类型的细胞在不同的发育时期，其离子通道或受体的种类也是不相同 的，而且不同的多肽神经毒素的作用选择性各不相同。下述几种细胞是 神经毒素的膜片钳研究中较常用的细胞。 背根神经节神经元( d o r s a l r o o t g a n g li o nn e u r o n s ，d r g ) 是感 觉冲动由外周向中枢传导的通路，也是初级感觉信息的调制部位“”。大 鼠d r g 细胞上分布了大量的离子通道和受体，是离子通道和受体研究的 理想细胞模型。d r g 细胞广泛的应用于研究神经毒素对于钠离子通道的 影响，d r g 细胞上钠离子通道分布有一定规律，通常情况下直径较大的 细胞表达的是t t x 一敏感型钠离子通道，而直径较小的细胞倾向于表达 t t x 一不敏感型钠离子通道，因而可以根据不同的目的选择不同大小的细 胞进行实验，当然严格的操作是加入t t x 作为对照“”。大鼠d r g 细胞 主要通过急性分离获得，其分离技术已较为完善，同时本实验室已经非 常成功建立了该技术平台。在此技术平台上通过进一步摸索，还可以开 展神经毒素对于其它离子通道( 如钾离子和钙离子通道) 和受体( 如谷 氨酸、丫一氨基丁酸、5 一羟色氨受体等) 的研究。与d r g 细胞相类似并用 于毒素研究的感觉神经元还有三又神经和交感神经节等 海马( h i p p o c a m p a l ) 属于大脑边缘系统，它与人体的感觉、运动、 学习、记忆及内环境恒定系统的调节功能密切相关。海马结构比较复杂， 细胞种类较多，海马神经元上分布了丰富繁荣离子通道和受体，被广泛 的应用于神经毒素研究，例如海马大锥体细胞( h i p p o c a m p a lp y r a m i d a l n e u r o n 8 ) 就是其中一种较为常用的细胞模型。海马神经元可以通过急 性分离的办法获得，但在研究中比较常用的是通过体外分散培养技术获 得，常用的动物为新生大鼠、培养细胞可存活1 个月以上。大鼠的皮层 神经元与海马神经元的分离方法基本相同，也是毒素生物学活性研究的 常用细胞模型“4 圳。 在研究神经毒素对于肌细胞的影响时，可以采用心肌细胞、骨骼肌 细胞、和平滑肌细胞进行膜片钳研究。豚鼠( 2 0 0 3 0 0 9 ) 心脏在 l a n g e n d r o f f 灌流系统中通过酶液循环灌流消化一定时间后，除去心房， 筮二塞垒脑盎塞数生整堂适娃蟹荭友鎏 一 剪碎心室，在含蛋白酶e 的溶液中搅拌孵育便可获得含心室细胞的悬浮 液，待细胞沉降贴壁后便可进行膜片钳记录“”。分离豚鼠的气管和肺组 织并通过酶液消化、p a st e u r 吸管连续吹打分散组织可获得游离的平滑 肌细胞”。青蛙和大鼠的骨骼肌收缩肌纤维( s k e l e t a l t w i t c hm u s c l e f i b r e s ) 可用于研究神经毒素对于骨髂肌细胞离子通道或受体的影响6 ”。 在神经毒素的生物学活性研究中，培养细胞常用于膜片钳研究，例 如n g l 0 8 一1 5 细胞m “3 ”、脑神经细胞株b 5 0 和b 1 0 4 m 、入肠平滑肌细胞 株( c u l t u r e dh u m a nl a t e s t i n a l s m o o t hm u s c l ee e l l1 i n e ，h i s m ) 嘲 等。人胚肾细胞( h u m a ne m b r y o n i ck i d n e yc e l 1s i t e k - 2 9 3 ) 啡姗1 和爪蟾 卵母细胞( x e n o p u sl a e v i so o c y t e s ) “”在神经毒素的生物学活性研 究发挥极其重要的作用，通过向细胞中注射c r n a 可以在细胞膜上表达 相应的离子通道或受体，由于分布在两种细胞膜上的离子通道和受体较 少，因而表达的离子通道或受体具有专一性，有助于神经毒素与其专一 性通道或受体的相互作用研究，通过突变通道或受体上的某些氨基酸残 基可以确定毒素在靶分子上的作用位点。同时由于钾离子通道的复杂 性，因而通过在两种细胞膜上表达钾离子通道是研究作用于钾离子通道 的神经毒素的必备方法“”。 上述的几种细胞模型都是哺乳动物细胞，而在众多的神经毒素中有 大量的毒素具有昆虫专一性，研究这类毒素较为常用的方法是分离蜚蠊 的巨轴突，通过d o u b l eo i 卜g a p 技术以电流钳和电压钳的模式研究毒 素对于轴突膜电位和跨膜离子流的影响”。 1 2 3 放射性配体结合法 放射性配体结合法是神经毒素生物学活性研究一种较为常用的方法， 通过放射性配体结合法可以阐明神经毒素与离子通道或受体的相互作 用关系，即神经毒素的作用专一性，同时通过竞争性结合测定方法可以 阐明毒素在靶分子上的作用位点。应用该方法进行毒素生物学活性研究 需要使用放射性同位素使毒素分子带上放射性，神经毒素通常所用到的 同位素标记是3 i i 和”5 i ，”5 i 标记的灵敏度要高于3 i l 大部分的神经毒素 箜= 童垒然盎耋的生塑堂适! 建班究虚洼 多肽都采用”5 i 标记。用于放射性配体结合实验的理想组织应含有高密 度的靶受体和低密度的与配体非特异结合的受体，实验的组织可取自 脑、外周组织、天然表达或移植受体的细胞株等，通常在神经毒素的研 究中使用的组织是大鼠脑或某一脑区( 如海马、小脑等) ，通过将脑制 成匀浆，用差速离心法分离出含离子通道或受体的突触体。将一定浓度 的标记神经毒素与不同浓度的未标记竞争物共同孵育，通过离心或抽滤 等方法除去游离的标记神经毒素后，测定突触体上放射性强度做出竞争 性动力学曲线，从而推断神经毒素的生物学活性及作用位点“”“1 。 2 抗菌肤生物学活惶研究 抗菌的发现起源于1 9 8 0 年b a m a n 发现的天蚕素( c e r o p i n ) ，其后在 无脊椎动物和脊椎动物中都发现了大量的抗菌肽h 8 ，蜘蛛毒素中也发现 了抗菌肽，例如从狼蛛( l y c o s ac a r o l i n e n s i s ) 粗毒分离到了两种抗 菌肽l y c o t o x i n - i 和l y c o t o x i n - i i “”，从a c a n t d o s c u r r i a 蜘蛛粗毒中 分离了一种富含c y s 的1 8 肽o ”，从c u p i e n n i i u ss a l e i 蜘蛛分离到的 抗菌肽就达到5 种之多6 ”，h u w e n t o x i n - i i 也表现出较弱的抗菌活性。 另外在蝎毒中发现了数种抗菌肽”“”。 抗菌肽的特点在于热稳定好、强碱性、抗菌谱广，而且不会诱导抗 药菌株产生。抗菌肽对于动物体本身而言主要作为一种免疫机制，防止 细菌及其它微生物的感染“。在至今发现的抗菌肽中其一级结构同源性 很小，因而很难预测某种多肽是否具有抗菌肽活性。但这些抗苗肽在空 间结构上却有一定的相似性：二硫键稳定的旷结构和两亲 螺旋，氨基 酸序列中包含2 9 个碱性氨基酸残基和5 0 以上的疏水氨基酸。抗菌肤 的作用机制很复杂，不同类型的抗菌肽有不同作用机制，但分子本身具 有阳离子性和双亲性是它们的共同特征。阳离子性有助于多肽与细胞膜 中脂多糖结合，而双亲性有助于多肽在细胞膜上产生通道。多数研究表 明抗菌肽与细胞膜结合后在膜上产生离子通道，从而使膜去极化，减少 笸= 重垒肽叠蠢鲍生麴堂遣性壁究左鎏 一一一 膜两侧的电位梯度，破坏了膜的完整性，从而造成细胞裂解”。 由h u lt m a r kd 在八十年代初建立了两种方法简单而实用的方法研究 多肽的抗菌活性( 5 s - 6 1 ：( 1 ) 琼脂糖孔穴扩散法，将对数生长期的细菌与 培养基混匀后，迅速铺平制作平皿，用灭菌的3m m 不锈钢打孔器在平 皿止打孔，每孔可加入5u l 浓度不同的样品，培养后测量抑菌圈的直 径l 但由于培养基的成分、厚度、孔穴大小和所加样品量等因素直接影 响抑菌圈的大小，因此采用该方法测定的抗茵活力仅仅是一定性依据。 因而通常采用下述方法进行抗菌活性研究。( 2 ) 比浊法，取对数生长 期的细菌( 如e c o l i k l z d 。) 离心后去上清，将菌体悬浮于冰浴的0 1 m o l l 的p b s 中，在5 7 0n f f l 下测得浑浊度o d = 0 4 ，取1 0 “l 样品加入 到上述1m 1 细菌悬浮液中，同时另取1 0u 1p b s 加入相同体积的细菌悬 浮液中，震荡培养后立刻转入冰浴，2 0m i n 在相同的波长下测彩值， 将所测结果代入经验公式u = 抓。a 一1 ，求得活力单位。但该方法较复杂， 所需时间较长。后来b u l e t “4 1 和g h r e t - s a b a t i e r “2 对该方法进行了改 进。测活实验在一有9 6 孔的微滴定盘( 9 6 - w e l 1sm i c r o tit e rp l a t e s ) 上进行，并用m i c r o p l a t er e a d e r 测定各孔的鲫值。应用该方法可以 在一块盘上进行多个样品浓度和多种细菌的抗菌活性测定，大大节省时 间，同时测定的体积较小( 1 0 0 1 ) ，因而又可大大的节约样品。在确 定了多肽的抗菌活性后可通过做剂量曲线求出最小抑制浓度。测定多肽 的抗菌活性应在可能的情况选取尽可能多的菌种，包括细菌( 革兰氏阳 性和革兰氏阴性) 和真菌，而且应尽量选择敏感菌。 3 细胞毒素 细胞毒素是指通过干扰与细胞生长、分化、死亡及功能等相关的机 制抑制细胞生长甚至杀死细胞的的毒素，在临床上被广泛应用于恶性肿 瘤的治疗和研究“1 。有的细胞毒素是细胞本身分泌的蛋白质，如人体血 小板细胞可分泌蛋白质降解自身裂解的红细胞的，协助免疫球蛋白l g e 差= 室垒虺圭麦的生塑堂适性班客直洼 一一 和l g g 抵御外来微生物或人体癌细胞删。这类细胞毒素的作用机理很复 杂，一种机制便是通过与细胞膜上的受体结合后，干扰蛋白质的生物合 成，研究表明这些细胞毒素可能与细胞程序死亡和凋亡有关“”“”。 另 一类细胞毒素是一些广泛的存在于自然界的分子量较小的碱性多肽，动 物毒素中就发现了大量的细胞毒素多肽，例如蜂毒肽“”( r e e l i t t i n ，来 源于蜜蜂毒) 、i s c t ”( 来源于蝎类o p i s t h a c a n t h u s m a d a g a s c a r i e n s is ) 、p 1 i s u l i nl ”( 分离于j u m p e ra n t ) ，o - c o n o t o x i n m v i i c 也被发现具有细胞毒活性“”。c o h e ne 等在四种培养细胞中检测 了2 6 中蜘蛛粗毒的细胞毒活性，发现部分蜘蛛的粗毒具有很强的细胞 毒活性”，l i z h e ny a n 等从狼蛛( l y c o s ac a r o l i n e n s i s ) 粗毒分离到 了两种具有较强细胞毒活性的抗菌肽l y c o t o x i n - 和l y c o t o x i n - i i ，两 种毒素都能够在细胞膜上形成孔道以增加膜的通透性而使真核和原核 细胞裂解，在低于浓度3 0u i i l 0 1 l 时被检测到具有裂解兔红细胞的活性 4 9 1 细胞毒素多肽在结构有一些共同特征，即分子量较小的多肽的空间 结构由旷折叠组成，丙在分子量稍大的多肽的空闻结构主要是由二硫键 稳定的旷螺旋和旷折叠结构。通过电生理和分子生物学技术研究表明这 类结构能与细胞膜上的离子转运蛋白或在细胞膜上形成孔道，以干扰第 二信使系统从而推测打破了膜两侧的电位梯度或者干扰信号传导从而 导致细胞死亡。细胞毒素的这一作用机理类似于抗菌肽，但并非所有的 抗菌肤都有细胞毒活性”“。 一般情况进行细胞毒活性研究都在培养的细胞株上进行，该方法操 作起来较为繁琐，鉴于多数细胞毒素多肽都具有溶血活性，因而可以通 过检测多肽的溶血活性做一些初步的研究。( 1 ) 取兔( 或牛或猪) 新鲜 血液，加入肝素抗凝后，通过用p b s 缓冲液( 5 0 咖0 1 ln a h ：p o ，1 5 0 m m o l ln a c i ) 离心( 5m i n ，4 3 1 0 x g ) 洗涤3 次得到红细胞沉淀。( 2 ) 将上述沉淀用p b s 配成浓度为1 ( 或0 5 ) 的红细胞悬浮液，将1 0 u 1 不同浓度的样品加入到1 0 0i x l 的红细胞悬浮液中，阳性对照中加入相 簋= 童垒胜耋塞煦生蛰堂适性盟究左造 同体积的双蒸水作为l o o 裂解率，而阴性对照中加入同体积的p b s 作为 0 裂解。( 3 ) 在3 7 。c 保温1h 后离心( 1 1 6 0 x g 、3m i n ) ，取上清在5 7 0 1 1 1 1 1 下测得值，绘制样品的溶血剂量曲线，确定样品是否具有溶血或 及溶血活性的大小”。 4 凝集活性和抗凝作用 凝集素是一类专一识别糖并与之非共价的、可逆的结合的蛋白质， 具有细胞凝集功能。凝集素的分子和细胞识别功能，因而可以通过免疫 组化的方法利用外源凝集素作为探针，以区别正常组织细胞和癌变组织 细胞，进而对肿瘤进行早期诊断和确诊”4 。凝集素广泛的存在于不同的 生物物种中。近年来在动物( 例如蛇毒的毒液) 中也发现有凝集素的存 在。从虎纹捕鸟蛛粗毒分离到了两种类凝集素( s h l - i 和s h l - ii ) 是当 前发现分子量最小的多肽凝集素。通过红细胞凝集实验可确定多肽的凝 集活性，凝集实验在9 6 孔微型血凝板上进行，该方法操作简单，样品 用量较少，加入相应的单糖还可以确定凝集素的糖结合专一性”。需 要注意的某些凝集素具有血型专一陛，因而实验中可多选几种红细胞， 如人、小鼠、兔等的红细胞。 去整合素能拮抗整合素( 即纤维蛋白原) 与血小板膜上的整合素受 体结合，抑制血小板之间的粘连，阻止血拴形成，起到抗凝作用。去整 合素分子中都含有r g d 序列并通过通过r g d 序列与整合素受体结合，去 整合素超家族包括一些蛇毒蛋白、神经毒素、以及具有抗栓活性的水蛭 蛋白和胞间去整合素等。抗凝涉及到阻止血小板的粘连，因而在抗凝 实验中首先要分离血小板，即取两周内没有用过阿司匹林等抑制血小板 功能的新鲜血，用枸檬酸钠抗凝( 或草酸钠，0 1 m o l l ) ，抗凝剂与血 液为1 ：9 ，1 5 0 0 r m r n i n 离心l o m i n ，上清夜即为富含血小板血浆。比较 常用的鉴定药物抗凝的实验有以下三种：( 1 ) 比浊法，即通过比较加入 药物和末加药物的血小板血浆在加入诱变剂后浊度的变化，从而衡量药 簋= 童垒肽查蠢的生物堂适焦盈巍左洼 物的抗凝效果。( 2 ) 血浆复钙时间，即通过比较加入c a c l ：后的凝固时 间，推断药物的抗凝作用及最低抗凝浓度。( 3 ) 血浆凝血酶原时间，加 入诱变剂为含钙凝血酶液，其它操作与( 2 ) 相同u 6 。目前从动物毒素 中发现的多肽类去整合素都是从蛇毒分离的含r g d 序列的多肽，分子量 为4 8 k d ，富含半胱氨酸而且都形成二硫键，有较高的同源性”。通过 血浆复钙时间实验初步确定了虎纹捕鸟蛛粗毒有一定的抗凝活性，但由 于粗毒可能含有与c a 2 + 形成沉淀的盐类物质，因而该结果需要通过进一 步实验加以证实 5 其它生物学活性 在蜘蛛和蝎毒中发现了一些具有肌肉毒性的多肽，能够作用于肌肉纤 维使其产生形态上的变化，甚至导致肌肉坏死。p h t x l ”和 p h t x 2 ”“( p h o n e u t r i an i g r i v e n t e r ) 能使小鼠骨骼肌产生形态学的变化， 通过光学显微镜和透射电镜研究它们都对膈神经一膈肌细胞造成了不同 程度的损害。在动物毒素中还发现了一些酶的抑制剂，例如在蛇、蝎和 蜘蛛毒液中就分离到了激肤类似多肽( k i n i n - 1 i k ep e p t i d e ) ，它们能 抑制血管紧张素转换酶( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m ea c e ) 的活 性唑 参考文献 1e u g e n eg r i s h i n p o l y p e p t i d en e u r o t o x i nf r o ms p i d e rv e n o m s e u r ，b i o c h e m 1 9 9 9 ，2 6 4 2 7 6 2 8 0 2l a c h t a nd r a s h w a n y e c h o d g s o n p h a r m a c o l o g ya n db i o c h e a d s t r y o f s p i d e rv e n o m s 2 0 0 2 ，t o x i c o n , 4 0 ，2 2 5 - 2 5 4 3l o u r i v a ld p o s s a n i ，b a l t a z z a rb e c e r r i l ，m u r i e ld e l e p i e r r e ，j a n t y t g a t ，s c o r p i o n t o x i n s s p e c i f i c f o rn a + - c h a n n e l s ，e u r ， l i 筮二童垒肽童蠢鲍生堑堂适性噩窀左造 b l o c h e m 1 9