（生物化学与分子生物学专业论文）粟酒裂殖酵母rna组学：box+cd+snorna筛选及基因组织和表达研究.pdf

罗玉萍 中山人学博l ：学伉论文2 0 0 4 摘要 核仁小分子r n a ( s m a l ln u c l e o l a rr n a ，s n o r n a ) 是目前研究得最为清楚的一类 非编码r n a ，它在真核生物核糖体的生物合成中起关键作用，主要参与核糖体r n a 前体的剪切加工和指导r r n a 上特定位点核糖的27 o 一甲基化以及尿嘧啶向假尿嘧 啶的转换等转录后修饰。在不同的生物中，s n o r n a 基因组织和表达策略呈现出高 度的多样性。因此，当前有必要继续从不同的模式生物中发现和鉴定新的s n o r n a 基因。粟酒裂殖酵母是一种较古老的单细胞真核生物，在生物进化上具有重要的 分类地位。虽然粟酒裂殖酵母与酿酒酵母同属于子囊真菌，但研究表明，粟酒裂 殖酵母在基因的组织、结构以及基因的表达调控等方面与酿酒酵母并不相同，在 r n a 剪切，细胞周期和染色体结构等方面与高等动物却有一定的相似性。因此， 对粟酒裂殖酵母s n o r n a 进行系统研究，对于了解s n o r n a 基因的加工成熟机制、 探索s n o r n a 作为核酸调控分子在生物代谢过程中的调控作用以及揭示s n o r n a 基因的起源与进化无疑有蓿酿酒酵母所不能替代的优势。 本文通过构建核内小分子r n a 的c d n a 文库和序列测定，在粟酒裂殖酵母基 因组中共发现了4 4 种b o xc ds n o r n a 的基因序列。b l a s t 搜索粟酒裂殖酵母基 因组数据库得知，这4 4 种通过文库筛到的b o xc ds n o r n a 中，除u 1 4 ，s n r 3 8 和 s n r 3 9 已有报道外，另外1 3 种已由其它实验室利用生物信息学的方法预测到并在 粟酒裂殖酵母基因组一卜进行了注释，其余的2 8 种为新的s n o r n a 。n o r t h e r n 杂交 结果显示，这些s n o r n a 都有很强蚓5 f ；i 性杂交带，其大小与预期的砌q a 分子相符， 表明它们是粟酒裂殖酵母细胞中稳定表达的r n a 分子。逆转录实验进一步验证这 些s n o r n a 的存在。 根据s n o r n a 的结构和功能的关系，预测2 7 种新的s n o r n a 可指导3 2 个r r n a 位点和一个u 6s n r n a 位点甲基化修饰。采用d n t p 浓度依赖性引物延伸分析对部 分新的s n o r n a 指导的甲基化位点进行鉴定，在粟酒裂殖酵母1 8 s 和2 5 sr r n a 上 标定了3 6 个甲基化修饰的位点。这3 6 个位点中，有2 6 个在sc e r e v i s i a e ，动物以 及植物r r n a 中相应位点的核苷酸有被甲基化修饰，同时在sc e r e v i s i a e ，动物以 及植物中发现了指导这些位点2 o 核糖甲基化修饰的反义s n o r n a ，其余的位点 为粟酒裂殖酵母所特有的甲基化位点。其中1 8 sr r n a5 6 5 、7 6 8 ，2 5 sr r n a9 4 9 三个位点预测分别由本实验鉴定的新的s n o r n as n r 8 0 、s n r 8 4 和s n r 8 3 所指导， 因此，这三个s n o r n a 是粟酒裂殖酵母特有的s n o r n a 。此外，粟酒裂殖酵母所特 有的另一s n o r n as n r 8 5 具有典型的b o xc ds n o r n a 序列元件，但没有找到与 r r n a 或s n r n a 配对的功能区，陔分子可能指导其它r n a 的2 - o 一核糖甲基化或 粟酒裂殖酵母r n a 组学：b o xc ds n o r n a 筛选及基因纰织和表达研究 具有其它调控功能。 基因组织分析显示，几乎所有粟酒裂殖酵母b o xc ds n o r n a 是由内含子编码 的。表明粟酒裂殖酵母b o xc ds n o r n a 的基因组织不同于酿酒酵母而与脊椎动物 非常类似。然而，与脊椎动物不完全相同，粟酒裂殖酵母内含子编码的s n o r n a 只有7 个位于蛋白质基因的内含子中，其余均位于非编码r n a 基因的内含子中或 蛋白质编码基因3 或5 末端非翻译区的内含子中。此外，在已鉴定的粟酒裂殖酵 母b o x c ds n o r n a 中，有1 5 个s n o r n a 基因在粟酒裂殖酵母的三条染色体上形成 五个s n o r n a 基因簇。除基因簇i 包含了5 个内含子编码的s n o r n a 外，其余4 个簇均包含了内合子编码和非内含予编码的s n o r n a 。r t - p c r 分析和d n a 序列 测定不仅证实了裂殖酵母s n o r n a 基因簇中内含子的存在，也证实了裂殖酵母 s n o r n a 基因簇是以一个前体分子被一起转录的。这些基因簇的剪接终产物明显没 有蛋白质的编码潜力，因而它们都属于n o n c o d i n gr n a 基因。迄今为此，除粟酒 裂碴酵母外，在其它生物中均未发现n o n c o d i n gr n a 基因的外显子和内含子都编 码有功能的s n o r n a 的现象，表明粟酒裂殖酵母s n o r n a 基因表达的新策略。 r t - p c r 分析和d n a 序列测定显示，粟酒裂殖酵母s n o r n a 基因簇i 的第二 个内含子的3 剪接位点有3 个，表明n o n c o d i n gr n a 的成熟加工也存在选择性剪 接机制。这是酵母n o n c o d i n gr n a 选择性剪接的首次报道。 在粟酒裂殖酵母s n o r n a 基因簇i i 中发现了一种特殊的基因结构形式，分别 编码s n r 5 7 和s n r 5 5 的两个内含子紧密相连，中间没有插入外显子序列，称为连 体内含子。r t - p c r 分析和r t - p c r 产物的斑点杂交结果显示，这种连体内含子是 按顺序剪接的，两个内含子编码的s n o r n a s n r 5 7 和s n r 5 5 先通过r n a 剪接，然 后，经核酸酶作用去除分枝的套索结构依次从多顺反子转录前体释放。 比较分析不同生物的b o xc ds n o r n a 的功能同源分子及其指导的甲基化位 点，发现s i i o r n a 基因在进化过程中发生了一泛的重组和转位。有些s n o r n a 来 源于同一s n o r n a 分子的重复及随后的序列变异，重复的s n o r n a 基因可以通过 染色体重复产生，也可以通过内含子的转座产生。 通过对粟酒裂殖酵母b o xc ds n o r n a 的系统研究，我们不仅发现罕见的基因 结构t 。连体内含子”，也发现了粟酒裂殖酵母b o xc ds n o r n a 基因独特的基因组 织和表达策略。这些研究成果丰富了人们对s n o r n a 基因结构与表达的认识，为 内含子的起源和进化提供了新的材料。 关键词：粟酒裂殖酵母，s n o r n a ，实验r n a 组学，基因组织，基因簇，内含子， 选择性剪接 型：! 鲨 些盔兰堡! ：兰生堡皇 翌竺 a b s t r a c t s m a l ln u c l e o l a r r n a s ( s n o r n a s ) r e p r e s e n t aw e l l ，c h a r a c t e r i z e d g r o u p o f n o n c o d i n gr n a s ，w h i c hp l a ya ni m p o r t a n t r o l ei nr i b o s o m en u c l e o l a rm a t u r a t i o n f e w s n o r n a sa r er e q u i r e df o rn u c l e o l y t i cp r o c e s s i n gs t e p so ft h ep r e r r n a ，w h e r e a sm o s t o ft h e ma p p e a rt ob ei n v o l v e di nt h et w om o s tc o m m o n t y p e so fr r n a m o d i f i c a t i o n ： s i t e s p e c i f i c 2 - o - r i b o s e m e t h y l a t i o na n dp s e u d o u r i d y l a t i o no fr r n a s t h eg e n o m i c o r g a n i z a t i o na n dm o d e so fe x p r e s s i o no fg u i d es d o r n a se x h i b i tg r e a td i v e r s i t yi n d i 髓r e n to r g a n i s m s s oi ti s i m p o r t a n tt o c o n t i n u ei d e n t i f y i n gm o r en o v e ls n o r n a s f r o mv a r i o u s o r g a n i s m s f o rab e t t e r u n d e r s t a n d i n go ft h ed i v e r s i t y o fr n ag e n e s t r u c t u r ea n df u n c t i o n a sw e l la st h em e c h a n i s m si n v o l v e di ne v o l u t i o no ft h es n o r n a g e n ef a m i l y f i s s i o ny e a s ts c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b ei s as i n g l e c e l l e d f r e e 1 i v i n g a r c h i a s c o m y c e t ef u n g u sp o s s e s s i n gm a n y f e a t u r e st h a ta r ed i f f e ：r e n tf f o m s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eb u ts i m i l a rt om o r ec o m p l i c a t e de u k a r y o t e s i th a ss e r v e da s a ne x c e l l e n tm o d e lo r g a n i s mf o rt h es t u d yo f c e l l c y c l ec o n t r 0 1 g e n o m i co r g a n i z a t i o n d n a r e p a i ra n dr e c o m b i n a t i o n a n dr n ap r o c e s s i n g t h e r e f o r e m eu s eo f p o m b e f o r f o n c t i o na n dc o m p a r a t i v es t u d i e ss h o u l dp r o v i d eab r o a dp e r s p e c t i v eo fp r o b l e m si n s n o r n am o l e c u l a r b i o l o g y t h a tc o u l dn o tb ep r o v i d e db y s t u d y i n gs c e r e v i s i a e b yc o n s t r u c t i n ga n ds c r e e n i n gt h es c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b ec d n al i b r a r y 、 g e n e r a t e df r o mn u c l e a rs m a l lr n a m o l e c u l e s 4 4c d n a s e q u e n c e s w e r ea s s i g n e dt ot h e c db o xs n o r n a sa c c o r d i n gt o s e q u e n c ea n ds t r u c t u r a lm o t i f s a m o n gw h i c hu 1 4 、 s n r 3 8a n ds n r 3 9h a v e b e e nc h a r a c t e r i z e d p r e v i o u s l y , a n d 13c d n as e q u e n c e s c o r r e s p o n dt os n o r n a s t h a tw e r er e c e n t l ya n n o t a t e di nc h r o m o s o m e sb yt o d dl o w e t h er e m a i n i n g2 8s b o r n a sa r ef i r s ti d e n t i f i e da n dc h a r a c t e r i z e df r o msp o m b e t o f o r t h e rc o n f i r ms t a b l ea c c u m u l a t i o no ft h e s en o v e ls n o r n a s n o r t h e mb l o ta n dr e v e r s e t r a n s c r i p t i o nw e r ep e r f o r m e dw i t hf i s s i o ny e a s tt o t a lc e l l u l a rr n a a n do l i g o n u c l e o t i d e s s p e c i f i c f o rt h o s es n o r n a r e s p e c t i v e l y r e s u l t ss h o w e dt h a tt h o s es n o r n a sw e r e e x p r e s s e ds t a b l yi nsp o m b e b a s e do nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns t r u c t u r ea n df u n c t i o n ，u s i n gt h ed d b o xp l u s 5 n tr u l e sw ep r e d i c t e d3 2f r n a m e t h y l a t i o ns i t e sa n d1 u 6 m e t h y l a t i o ns i t e f o rt h e s e n o v e ls n o r n a s u s i n gt h e d e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e ( d n t p ) c o n c e n t r a t i o n d e p e n d a n tp r i m e re x t e n s i o na s s a y , w ee x p e r i m e n t a l l yv e r i f i e d3 6r r n am e t h y l a t i o n s i t e s o ft h e 3 6 m e t h y l a t i o n s i t e s ，2 6h a v eb e e nf o u n dt o b ei o c a t e di nt h e p h y l o g e n e t i c a l l yc o n s e r v e dr e g i o n so f r r n a t h eo t h e r sa r en o tk n o w nt ob em e t h y l a t e d i no t h e re u k a r y o t e sa n dt h e ym a yb es p e c i f i co n l yt os p o m b e ，a m o n gt h e m ，g m 5 6 5a n d a m 7 6 8i nl8 sr r n a ，a m 9 4 9i n2 5 sr r n a ，w e r ep r e d i c t e dt a r g e t e db ys n o r n a s n r 8 0 、s n r 8 4a n ds n r 8 3 ，r e s p e c t i v e l y s ot h et h r e es n o r n a s n r 8 0 、s n r 8 4a n ds n r 8 3 a r eb u d d i n gy e a s t s p e c i f i c i na d d i t i o n s n r 8 5 p o s s e s s e st h ef e a t u r e st y p i c a lo fb o x c ds n o r n a b u td e v o i do fc o m p l e m e n t a r i t yt or r n a so rs n r n a s ，t h ef u n c t i o no f w h i c hr e m a i n st ob ee l u c i d a t e d f h eg e n eo r g a n i z a t i o n so fs p o m b es n o r n aa r ed i f f e r e n tf r o ms a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a eb u ts i m i l a rt ov e r t e b r a t e m o s to fb o xc ds n o r n a sf r o msp o m b ea r e i n t r o n - e n c o d e d h o w e v e r , u n l i k ev e r t e b r a t ew h e r et h em a j o r i t ys n o r n a n e s t e dw i t h i n i n t r o n so f p r o t e i n c o d i n gg e n e s a m o n g 4 0i n t r o n i cs n o r n a si ns p o m b e ，o n l ys e v e n 1 1 i 燮堕堂堕垒塑堂! ! ! ：! ! 旦! ! ! 型垒塑垄些矍型塑堡翌鲞望笪塑 a r eh o s t e di nt h ei n t r o n sw i t h i nt h eo 鼢o f p r o t e i n c o d i n gg e n e s t h er e m a i n i n ga r ea l l f o u n di nt h ei n t r o n so fe i t h e ru n t r a n s l a t e dr e g i o n s ( u t r s ) o f p r o t e i n c o d i n gg e n e so r n o n c o d i n gr n ag e n e s ，i n c l u d i n gf i v ep o l y c i s t r o n i cr n a g e n e sw h i c hw e r er e f e r r e d t os n o r n a g e n ec l u s t e ri - va si nsc e r e v i s i a e x c e p tf o rc l u s t e ri ，龇l a r g e s th o s t g e n ei nt h ef i s s o ny e a s t ，c o n t a i n sa l lf i v ei n t r o n e n c o d e ds n o r n a s 。f o u ro t h e rc l u s t e r s ( i i ，i i i ，f va n dv ，) i nsp o m b eu s eb o t hi n t r o na n de x o n ，p a r t i c u l a r l yt h ee x o na t3 e n d f o rs n o r n a c o d i n g a l lt h es n o r n a i nt h es a m ec l u s t e rl i n k e dw i t he a c ho t h e ra n d t r a n s c r i b e da sap o l y c i t r o n i c p r e c u r s o rr n a a n dw eh a v e d e n t i t l e da l l v e so f s p l i c i n gi n t e r m e d i a t e so rp r o d u c t sf r o mp r i m a r yt r a n s c r i p to f t h ec l u s t e r sb yr t - p c r a n dd n a s e q u e n c i n g 。t h ef i v eh o s tg e n e si nx p o m b ea r en o n c o d i n gr n ag e n e s b e c a u s et h ee x o n so ft h ef i v ec l u s t e r sh a v en op o t e n t i a lf o rp r o t e i nc o d i n g a t p r e s e n t ， e x c e p tf o rf i s s i o ny e a s t ，n oo n ep o l y e i s t r o n i cr n ag e n et h a te n c o d e sf o rs n o r n a sb y b o t ht h ei n t r o l l sa n di t se x o nw a sf o u n df r o mo t h e ro r g a n i s m 。i m p l y i n gan o v e l s t r a t e g yo f s n o r n a e x p r e s s i o ni nt l l ef i s s i o ny e a s t b yr t - p c ra n dd n as e q u e n c i n g t h r e ea l t e r n a t i v e3 s p l i c es i t e sf o rt h ei n t r o ni i o fc l u s t e rlw e r ei d e n t i t l e d 。s u g g e s t i n gt h a tm u l t i p l ea l t e r n a t i v es p l i c i n g sa l s ot a k e p l a c ei nt h ep r o c e s s i n go fn o n - c o d i n gr n at r a n s c r i p t i nal o w e re u k a r y o t ea st h e f i s s o ny e a s t t h e s ea l t e r n a t i v es p l i c i n g sr e s u l tf r o ms t r u c t u r a l l yr e l a t e de v e n t s ，t h a ti s t h ep r e s e n c eo f t a n d e m3 s p l i c es e q u e n c e s w i t hu n k n o w nf u r m t i o n a lm e a n i n gb e c a u s e t h ee x o n so ft h ec l u s t e rih a sn op o t e n t i a lf o rp r o t e i n c o d i n g t h i si st h ef i r s te x a m p l e o f a l 蜒m a t i v es p l i c i n go f n o n c o d i n gr n a g e n ei ny e a s t i ns p o m b e t 、v oi n t r o n s e n c o d es n o r 5 7a n ds n r 5 5 ，r e s p e c t i v e l y , i n u x t a p o s i t i o n w i t h o u ti n t e r c a l a t i n ge x o n ，t e r m e da s s i a m e s ei n t r o n s ，i i ew i t h i nsp o m b es 1 1 0 r n a g e n ec l u s t e ri i m o r e o v e r , t h es i m n e s ei n t r o n si nt h ep o l y c i s t r o n i ct r a n s c r i p t o f c l u s t e ri l i sr e m o v e db yas t e p w i s es p l i c i n g ，a n dt h e r e b yi m p l y i n gt h a tt h et w oi n t r o n - e n c o d e d s n o r n a s s n r 5 7a n ds n r 5 5 ，a r er e l e a s e di nt u r nf r o mt h ep o l y c i s t r o n i ct r a n s c r i p to f t h e g e n ec l u s t e rb yr n as p l i c i n ga n dt h e nf r o me x o n u c l e o l y t i ct r i m m i n go f d e b r a n c h e d l a r i a t s t h eu n u s u a ls t r u c t u r ea n de x p r e s s i o no f p o m b es i l o r n ag e n ec l u s t e r1 1w a s v e r i f i e de x p e r i m e n t a l l y c o m p a r i s o no fb o xc ds i l o r n aa n dt h e i r f u n c t i o n a lh o m o l o g u e si nd i v e r s e o r g a n i s mr e v e a l st h a te x t e n s i v e r e c o m b i n a t i o na m o n gd i f l e r e n ts n o r n a sh a v eo c c u r r e d d u r i n gt h ee v o l u t i o nf r o mt h e i rp r i m i t i v ep r o g e n i t o r s s o m es n o r n ac l e a r l yd e r i v e d f r o md u p l i c a t i o no fa na n c e s t r a lg e n ef o l l o w e db yd i v e r g e n c e ，d u r i n gt h ec o u r s eo f e v o l u t i o n d u p l i c a t e d s i l o r n aa r o s ef r o mc h r o m o s o m a l d u p l i c a t i o n s o ri n t r o n t r a n s p o s i t i o n ， t h r o u g hs y s t e m a t i c a l l ys t u d y i n go nt h eb o xc ds n o r n a i ns c h i z o s a c c h r o m y c e s p o r o b e + a l lu n u s u a lo r g a n i z a t i o no f t w os p l i c e o s o m a ti n t r o n s ，t e r m e d a ss i a m e s ei n t r o n s ， w a sf i r s t l yd e m o n s t r a t e di nap o l y e i s t r o n i cr n ag e n et h a te n c o d e s f o rt h r e es n o r n a s b vb o t ht h ei n t r o n sa n di t se x o n 0 u rr e s u l t sd e m o n s t r a t e as of a ru n k n o w n c o n s t i t u t i o n o fe u k a r y o t i cg e n ea n dp r o v i d ea ni m p o r t a n tc l u ef o rt r a c k i n gm e c h a n i s m s w i t hw h i c h i n t r o ne v o l u t i o nh a so c c u r r e di ne u k a r y o t e s k e vw o r d ：s c h i z o s a e c h r o m y c e sp o m b e ，s n o r n a ，e x p e r i m e n t a lr n o m i c s ，g e n e o r g a n i z a t i o n ，g e n ec l u s t e r ，i n t r o n ，a l t e m a t i v es p l i c i n g 中山大学博士学位论文 编号：0 1 7 0 0 1 0 3 4 粟酒裂殖酵母r n a 组学：b o x c ds n o r n a 筛选 及基因组织和表达研究 罗玉萍 导师：屈良鹄教授 专业：生物化学与分子生物学 研究方向：真核生物分子生物学 答辩委员会委员： 主席翔括记 委员： 罗乐萍 中山大学博 学位论文 第一章综述 第一节n o n - c o d i n gr n a 和r n a 世界 r n a 研究始于1 9 世纪末，经过一个多世纪的努力，对r n a 的认识取得了巨 人进展。但1 9 8 2 年以前r n a 在整个牛物学的研究中并不引人注目。虽然在6 0 年 代，当转移r n a ( t r a n s f e rr n a ，即t r n a ) 、核糖体r n a ( r i b o s o m er n a ，即r r n a ) 和信使r n a ( m e s s e n g e rr n a ，即m r n a ) 等各种不同类型的r n a 被不断发现，但 几乎所有的生物学家都认为r n a 不过如此，只不过是位于d n a 与蛋白质之间的 一个中间物质。60 年代末期，为了避丌生命起源中的鸡与蛋的问题，科学家提出 了生命起源的r n a 学说。但此学浇一直沉睡了十多年，直至8 0 年代r n a 研究爿 取得了一系列生命科学研究领域最富挑战性的成果。 1 9 8 1 年发现四膜虫r r n a 前体能通过自我剪接切除内含子，表明r n a 也具有 催化功能，称为核酶( r i b o z y m e ) ，这对“酶一定是蛋白质”的传统观点是一次 大的冲击。1 9 8 3 年发现反义r n a ( m a t i s e n s er n a ) ，表明r n a 还具有调节功能。 其后发现一个基因转录产物通过选择性拼接可以形成多种蛋白质，从而打破了“一 个摹因一条多肽链”的传统j ! ! ! 点。1 9 8 6 年发现锥虫线粒体m r n a 的序列可以发生 改变【2 1 ，称为编辑( e d i t i n g ) ，于是基因与其产物多肽链的共线性关系也被打破了。 同年g i l b e r t 提出“r n a 世界”的假洗，这对“d n a 中心”的观点是一次有力的 冲击。1 9 8 7 年w e i s s 论述了核糖体移码即r n a 再编码( r e c o d i n g ) 机制，说明遗 传信息的编码也是可以改变的。9 0 年代以来，许多意想不到的新的r n a 功能陆 续被发现，许多传统观点被打破，r n a 已成为最活跃的研究领域之一。 细胞中的r n a 分子大致可以分为两类，一类是编码蛋白质的m r n a ，另一类是 不具有蛋白质编码潜力的r n a ，因而称之为非编码r n a ( n o n c o d i n gr n a ， n c r n a ) i 孓引。n c r n a 的种类繁多，其功能几乎涉及细胞功能的各个方面( 图1 - 1 ) 。 t r n a 和r r n a 参与蛋白质生物合成：真核生物特有的端粒酶r n a ，它既是端粒酶 的组成成分，也是染色体末端复制的模板【9 j ；人的x i s tr n a 与x 染色体的失活有关 l 0 , 1 1 ；在大肠杆菌中发现的6 sr n a ，它可以和全酶结合并控制启动子的使用【l 2 j ； 核仁小分子r n a ( s n o r n a ) 参与r r n a 的转录后加工和修饰1 1 3 - 2 1 1 ；g r n a 与编辑位 点下游序列互补指导r n a 编辑【2 2 _ 2 4 】；核内小分子r n a ( s n r n a ) 参与m r n a 前体 的加工剪接 2 5 , 2 6 】；核糖核酸酶p 的r n a ( r n a s epr n a ) 在生物界广泛存在，具有 催化活性，参与t r n a 和部分r r n a 前体的5 端加工过程 2 7 , 2 8 ；m i r n a 和s i r n a 都可 以与m r n a 形成配对，抑g l j m r n a 翻译产物的成熟，从而诱导基因表达沉默4 驯； o x ysr n a 具有抗氧胁迫，抗突变作用m 3 4 j ；t m r n a 识别3 端残缺m r n a ，帮助清 堕堕型堕竖苎墨翌竺丝兰坐! ! 旦! ! ! ! 翌垒堕垄丝竺型垫堡塑室鉴堕塑 除其翻译产物队3 5 】；7 s r n a 和4 5 sr n a 与蛋白质构成信号识别颗粒在蛋白质的分 泌中起作用1 3 6 - 3 9 等。非编码r n a 的种类还远不i 上这些f 4 0 4 9 j ，每种r n a 的功能也远 小i r 上面提到的那么简单。随着研究的深入，更多种类的非编码r n a 将被发现， r n a 的更多功能将被诠释，个丰富多彩的r n a 世界将展现在人们面前。 一”“”+ 。“”p ；6 磊盎矗“! ! ! ! 然燕，。静。封。d 辅。 4 事_ 磊；i i 磊：甜始l q ；s 酶p $ s 髓摹；s 辩a 幽卜l 细胞内的r n a 世界( s p i r i n sa ，2 0 0 2f e b sl e t t e r s ) f i g u r el 一1 i n t r a c e l l u l a rr n aw o r l d 第二节s n o r n a 的简介 核仁小分子r n a ( s m a l ln u c l e o l a rr n a ，s n o r n a ) 是目前发现数量最多，研究 的最为清楚的种非编码r n a 。这类小分子r n a 一般长约7 0 3 0 0 n t ，是一类在 代谢上比较稳定的分予。由于它们主要富集于真核细胞核仁中，所以称为核仁小 分子r n a f ” 。典型的s n o r n a 具有以下主要特征：存在于核仁中；具有类似核仁 提取物的性质( 抗盐性) ；与特定的蛋白质结合并以核糖核蛋白体( m o n u c l e o p r o t e i n p a r t i c l e s ，s n o r n p s ) 的形式存在和行使功能【5 0 - 5 2 ；r n a 分子中具有保守的序列元 件。和m r n a 相反，s n o r n a 没有3 端的“p o l ya ”尾巴，但在5 端有2 ，2 ，7 一 三甲基鸟苷“帽”等修饰。s n o r n a 在核糖体r n a 前体的剪切加工和转录后修饰 过程中起重要作用。主要指导r r n a 上特定位点核糖的2 - o 一甲基化修饰以及尿嘧 啶向假尿嘧啶的转换。由于s n o r n a 同真核生物核糖体生物合成过程的紧密联系， 罗玉萍 中山人学博1 j 学位论文 自二十世纪九十年代以来日益受到人们的高度关注，成为目前国际分子生物学研 究的前沿领域之一。 1 s n o r n a 的研究历史 s n o r n a 的研究最早可以追溯到二十世纪六十年代末，当时科学家们在哺乳动 物细胞中发现了一种新的核内小分子r n a ，由于它是在细胞核中发现的第三个富 含尿嘧啶的小分子r n a ，故命名为u 3 【5 ”。进一步研究发现，这种小分子r n a 与 r r n a 前体( p r e r r n a ) 之间存在联系，用激酶标记和转录抑制剂进行的研究结果表 明：u 3 是种代谢稳定的r n a 分子，由r n a 聚合酶i i 转录，它与一般的s n r n a 不同，应属于一种新类型的小分子r n a ，由于它定位于核仁，故命名为s n o r n a 。 随后人们在不同的生物中发现了u 3 的同源分子，通过系统比较不同生物的u 3 基 因的结构特征，发现u 3 分子中存在4 个保守的结构元件b o x a ，b o x b ，b o x c 和 b o x d 。此后不久，人们又从脊椎动物中陆续发现了u 8 ，u 1 3s n o r n a 【5 。与u 3 样，这些s n o r n a 也都是由独立基因编码的，是r n a 聚合酶i i 的稳定代谢产物， 在它们的5 末端具有三甲基鸟背帽子( t m g - c a p ) 结构，并具有u 3 中的b o x c 和 b o x d 等保守的结构元件。 二十世纪八十年代术，人们将m r n a 剪切研究中的新技术和新方法应用到 s n o r n a 的研究中。根据大量s n o r n a5 端具有2 ，2 ，7 一三甲基鸟苷“帽”( t m g c a p ) 结构，i f f i 且多数s n o r n a 有与f i b r i l l a r i n 相结合的特点，发展了抗体沉淀技术，来 专一性沉淀s n o r n a 。这一技术的建立，很容易将s n o r n a 与其它小分子r n a 分 离丌来，并因此而发现了大批新的s n o r n a 分子。随着许多新的核仁小分子r n a 被陆续发现，s n o r n a 的结构及功能的研究取得了突破性进展。人们发现s n o r n a f i 仅参与核糖体r n a 前体的剪切加工，而且参与核糖体r n a 转录后修饰过程， 即指导r r n a 上特定位点核糖的2 - o 一甲基化修饰以及尿嘧啶向假尿嘧啶的转换 1 4 - 1 6 , 5 5 - 6 1 。功能研究还表明，s n o r n a 不仅参与p r e r r n a 的修饰和加工，而且也 参与s n r n a 和t r n a 的转录后修饰 6 2 。6 4 1 。不仅如此，s n o r n a 与人的端粒酶在分 子起源和进化方面可能存在某种联系6 6 。s n o r n a 作为一个r n a 调控分子在结 构基因的表达与调控过程中扮演着十分重要的角色1 6 “】。 随着众多模式生物基因组计划的相继开展，国际分予生物学数据库中的基因 组序列不断增加，为寻找和分析新的s n o r n a 提供了便利。人们主要采用两种方 法从模式生物基因n0 t , 发现新的s n o r n a ：一种是基于计算机软件分析的计算机 p n a 组学方法( c o m p u t a t i o n a lr n