（声学专业论文）纳米粒子组装电化学生物传感器和电化学发光免疫分析法的研究.pdf

纳米粒子组装电化学生物传感器和电化学发光免疫分析法的研究 漆红兰 摘要生命科学、材料科学、环境科学的发展，对分析化学提出了越来越 高的要求，同时也极大地促进了分析化学的发展。传统的分析方法往往需要烦琐 费时的分离、复杂昂贵的仪器设备分析速度慢、耗时长，且劳动强度大。建立 高灵敏度、高选择性、简单、快速的分析方法和廉价的小型化分析装置是分析化 学工作者的研究目标。我们长期的研究目的是建立快速、灵敏、可实现自动化的 新型均相电化学发光免疫分析方法，研制具有实用价值的纳米组装电化学和电化 学发光生物传感器，为i 临床免疫检测和基因检测提供性能优良的分析器件。 本论文研究工作旨在研究纳米粒子组装电极上电化学检测信号的增强作用， 结合生物分子识别物质如酶、抗原抗体和d n a 的特异性，研制具有实用价值的 纳米组装电化学生物传感器；利用多标记技术和磁性微粒的容易分离作用，结合 生物分子识别物质一抗原，抗体的特异性，建立简单、快速、灵敏的电化学发光免 疫分析新方法。本论文研究工作是在国家自然科学基金“新型功能纳米材料组装 电化学发光生物亲合传感器的研究”( n o 2 0 3 7 5 0 2 5 ) 和“新型均相电化学发光免 疫法的研究”( n o 2 9 9 7 5 0 1 7 ) 项目的资助下完成的。本论文研制了五种高灵敏 度、高选择性、简单的碳纳米管组装电化学生物传感器；建立了两种简单、快速、 灵敏的电化学发光免疫分析方法，并将其成功地用于过氧化氢、葡萄糖、酚类物 质、i g g 抗体、地高辛、碱基、d n a 序列等物质的测定：还初步研究了d n a 与 电活性药物维生素b 6 和氧氟沙星的相互作用，探讨了相互作用机理。 第一章引言详细介绍了电化学生物传感器和有关电化学分析的基本原理 及电化学生物传感器的固定化技术，概述了电化学发光分析法的基本原理，着重 评述了电化学生物传感器和电化学发光分析法的研究进展，还简要地介绍了超声 电化学的基本原理和研究进展。 第二章碳纳米管组装电化学生物催化传感器的研究研制了碳纳米管组 装基于血红蛋白直接电子转移的第三代过氧化氢生物传感器和碳纳米管组装预氧 化电流型葡萄糖生物传感器，并将其用于实际样品眼药水中过氧化氢和血清中葡 萄糖的测定。 第三章电化学免疫传感器的研究 研究了碳纳米管组装电极上酚类物质 的电化学行为，建立了同时测定对苯二酚和邻苯二酚异构体的电化学分析新方法： 研制了碳纳米管组装电化学免疫传感器，建立了免疫竞争法检测i g g 抗体的高 灵敏度电化学分析新方法。 第四章电化学发光免疫分析法的研究利用多标记技术嗣磁性微粒容易 分离懿终熏，提遗著建立了多拣记垮骚毫位孝发竞受疫分摄方法，荠遽其震予摸 拟血清样品中地高辛含豢的测定；以合成的钌联毗绽为电纯学发光标记物，建立 了测定地商窜灵敏、快速的磁性微粒电化学发光免烧分析法。 第五奄电化学d n a 生物传感嚣的研究磷伟4 了碳纳米篱糊电极，研究 了碳缡来罄灏毫辍上碱鏊豹遥健学行为，建立了溺辩灏定多令缀蒺戆高灵敏浚、 高选择性电化学分析新方法；研制了离灵敏度、商选择性的电化学d n a 传感器， 建立了互补d n a 序列测定的分析方法；还研究了电活性药物与d n a 的相曩作 用。 本论文舆体研究肉霉簿述鲡下： 1 碳纳米管组装第三代过氧化氢生物传感器设计了一种撼于血红蛋囱赢 接电子转移的碳纳米管组漱第三代过戴化氢生物传感器。在碳纳米管组装电极上， 疆瓣翡盎缎爨鑫胃实瑰囊矮毫予转移，氧气存在下麓遵氧诧氢鹣逐聚其毒螽好装 催仡活性，艇随过氧化氮浓度的增大，催化电流髓之增大。基此研制了碳纳米管 组装第三代过氧化氢生物传感器。在0 2 0m o l lp h5 4 醋酸缓冲溶液中，工作电 位为一0 3 0v ( v s 。a g a g c l ，3m o l ln a c i ) 时，传感器的响应电流与过氧优氢的浓 疫在6 。0 x t o - 6 m o l l 2 。0 x 1 0 4 m o l l 之润呈莛努熬缝注关系，藤关系数兔0 9 9 6 6 。 检出限为1 2 1 0 一m o l l 。对8 o x l 0 4 m o l l 过氧化氛进行1 1 次平行测定，相对标 准偏差为2 4 。将该法用于眼药水中过氧化氢的测定，结果满意。 2 。碳纳米管组装颈辍化电流型葡蕊糖生物传感器设计了一耱基予隧定瞧 予赍 奉、酶、颓氧纯秘袋、碳缡来警为一俸戆碳魏米管缝装预裁化奄漉整麓麓糖 生物传感器。碳纳米管糊电极本身具有良好的导电饿，碳纳米管糊中添加二氧化 铅，可消除抗坏血酸、尿酸等还原性物质对葡萄糖测定的干扰。该传感器具谢良 好翁灵敏发辆游除干扰懿力( 1 8m m o l l 抗坏觳羧，2 2m m o l l 尿酸不予撬 1 0m m o l l 麓萄糖豹测爨 ，在0 4 0 v ( v s s c 嚣) 豹工箨电位下仍傈持较高鹩选 择性和较短的响应时间( 1 0s ) 。该传感器的响应电流与葡萄糖浓度在o 5 2 0 m m o l l 范围内呈线性关系，相关系数为o 9 9 8 7 。该传感器应用于人血清中黼萄 糠会量斡测迩，结票满意。 3 碳纳米管组装电辍上酚类物瓒的电化学行为及其分析磁翔的研究研究 了碳纳米管组装电极上对苯二酚、问蔓i 兰二酚和邻苯= 酚的电化学行为。碳纳米管 组装电极上，邻苯二酚、对苯二酚和间苯二酚的氧化峰明显分歼。基此建立了圈 潜硷滚邻苯二酸秘惑笨二懿鳇奄傀攀分撰蓊方法。在选定翡嶷验条传下，在 1 0 1 0 4 m o l l 邻苯二新存在的条件下响应电流与对苯二酚浓度在1 , 0 x 1 0 而 i i m o l l 1 0 1 0 “m o l l 之间呈良好的线性关系，相关系数为0 9 9 5 9 。检出限为 7 5 1 0 m o i l 。在i 0 1 0 。4 m o i l 对苯二酚存在的条件下，响应电流与邻苯二酚 浓度在6 o x l 0 m o l l 1 0 x 1 0 4m o l l 之间呈良好的线性关系，相关系数为 0 9 9 6 3 。检出限为2 o 1 0 m o l l 。将所建立的方法应用于模拟样品中对苯二酚和 邻苯二酚的同时测定，结果满意。 4 碳纳米管组装电化学免疫传感器的研究 以i g g 抗体为分析物，以对苯 二酚为底物，以辣根过氧化物酶为标记物，以对苯二酚过氧化氢辣根过氧化物 酶为检测体系，研制了碳纳米管组装电化学免疫传感器，建立了免疫竞争法检测 i g g 抗体的高灵敏度电化学分析新方法。工作电位为+ 0 0 3 0 v ( v s s c e ) 时，响应 电流与i g g 抗体浓度在o 3 0 1 0p g m l 范围内呈良好的线性关系，相关系数为 0 9 9 2 3 。检出限为0 1 li t g m l 。将该传感器用于模拟血清样品中抗体含量的检测， 结果满意。 5 多标记均相敷化学发光免疫分析法以b s a 为载体缀白，将地高睾和电 纯学发龙蠡记狻簧米港搀据澈在b s a 上，薹次提出势建立了多标记臻矮电繇学发 光免痰分析方法。根据免疫反应前后结合物分子扩散系数的变化，弓l 起电化学发 光强度的变饯，建立了均相嚷化学发光免疫分叛法测定地甍窜挠体葶鞋竞争法测定 地高辛的分析方法。电化学发光信号与地高辛抗体稀释度在1 ，5 0 0 0 0 1 2 0 0 0 倍 间呈一定的关系，电化学发光信号与待测地舞辛浓度在0 5 0n g m l 一3 0n g m l 闻 呈良好的线校关系，相关系数为0 9 9 7 6 。地离辛检出鞭为2 8 1 0 4 0 9 m l 。对1 0 1 0 母g m l 的地高擎进萱亍1 1 次测定，相对标准偏差为5 1 。 6 磁性微粒电豫学发光免疫分辑法褥台藏酌电纯擎发笼彩钌联就熬衍生 物标记在地离辛抗体上，地商辛标记在磁性微粒上，待测地高辛和标记在磁性微 粒主鹣蘧亳奉竞争钌联氆乏绽椽记静戆高辛菰俸，翻瓣磁场分离终瘸，建立了浏定 地高肇的磁性微粒电化学发光免疫分析法。电化学发光信号与地高辛浓度程1 0 1 0 8 9 m l 一2 0 1 0 4 9 m l 篷嚣蠹星蕤努豹线性关系，据关系数沟0 9 8 9 8 。缝 出限为7 5 1 0 一g m l 。 7 碳纳米管凝奄壤土碱罄电化学霉必技其分援痰爆鹣戮宠萋嚣裁了凝绒米 管糊电极，研究了碳纳米管糊电极上碱基的跑化学行为，建立了同时测定岛嘌呤 和腺噪呤，鸟嘌呤秽腿嘧嚏的电化学分橱耨方法。势摄其用予d n a 序列( 小孛 鹃腺d n a 和合成寡棱营酸) 申碱基( ( a 讳c 妖a + d ) 比傍j 的测溆，结果满意。 8 。电化学d n a 嫩物传感器的研究以聚毗咯包埋法将雅链d n a ( 8 5 - d n a ) 运定在磺缡苯管籀毫裰土，辍演纯己锭为电纯擎杂交指示裁，研利了一种离灵敏 度的电化学d n a 生物传感器，建立了种g s d n a 序列分析的电化学分析新方 i i i 法。传感器的响应电流与c s d n a 的浓度在5 0 1 0 。1 0 1 0 1 0 8 m o l l 范围内呈良 好的线性关系，相关系数为o 9 9 5 8 ，检出限为1 0 1 0 “o m o l l 。 9 d n a 与药物相互作用的研究利用维生素b 6 和氧氟沙星与d n a 结合前 后电化学行为和紫外可见光谱及荧光光谱的变化，研究了维生素b s 和氧氟沙星与 d n a 的相互作用，测定了维生素b 6 和氧氟沙星与d n a 的结合常数。实验结果 表明，维生索b 6 和d n a 、氧氟沙星与d n a 通过嵌合作用，结合生成非电活性的 超分子化合物。 本论文所研制的纳米粒子组装电化学生物传感器和所建立的电化学发光免疫 分析新方法，为生物活性分子的快速灵敏检测提供了良好的分析器件和分析方法。 碳纳米管对氧化还原蛋白或酶在电极上的直接电子转移具有良好的促进作用；可 以提高分子识别物质在电极上的固定量：可以提高电化学检测生物活性物质的灵 敏度和选择性。多标记技术可以提高电化学发光检测生物活性物质的灵敏度。磁 性微粒的容易分离作用大大简化了免疫分析的操作步骤。本论文的研究工作为进 一步研制高灵敏度和高选择性纳米组装电化学和电化学发光生物传感器提供了一 些基础性研究资料，对此方面的研究工作具有一定的促进作用。 关键词：电化学生物传感器电化学发光纳米粒子酶免疫分析d n a 序列 分析 n a n o p a r t i c l e a s s e m b l e d e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sa n d e l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y h o n g l a nq i a b s t r a c tc u r r e n ta n a l y t i c a lc h e m i s t r yt r e n d st h ei n n o v a t i o n t h ed e v e l o p m e n t o f b i o s c i e n c e ，e n v i r o n m e n t a ls c i e n c ea n d n e wm a t e r i a ls c i e n c eh a sm a d en e wr e s e a r c h s u b j e c t so na n a l y t i c a lc h e m i s t r y f o ri n s t a n c e ，b i o l o g i c a l l ya c t i v es u b s t a n c e si n c l u d i n g d n a ，p r o t e i n s ，d r u g sa n de n v i r o n m e n t a lt o x i cs u b s t a n c e sw e r ee x c l u s i v e l ys e l e c t e da s r e s e a r c ha n a l y t e s a n a l y t i c a ls y s t e m sh a v eb e e nt r a n s f e r r e df r o ms i m p l es y s t e m st o c o m p l e xs y s t e m s a n a l y t i c a l m e t h o d sh a v et r e n d e df o r w a r db i o c h e m i c a lm e t h o d s i n v o l v i n ge n z y m a t i ca n di m m u n o c h e m i c a lr e a c t i o n s c o n s i d e r a b l ee f f o r t sh a v em a d e d u r i n gt h e l a s td e c a d e st o i m p r o v ec o n v e n t i o n a la n a l y t i c a lm e t h o d si na c c u r a c y ， s e n s i t i v i t y , s e l e c t i v i t y , f a s t n e s sa n da u t o m a t i o n ，a n dt od e v e l o pn e wm e t h o d o l o g i e s f o r i n d u s t r i a l ，e n v i r o n m e n t a la n db i o m e d i c a lp r o c e s s e s i nr e c e n ty e a r s ，h i g h l ys e l e c t i v e a n ds e n s i t i v e a n a l y t i c a l m e t h o d ss u c ha s i m m u n o a s s a ya n db i o s e n s o rh a v eb e e n r e c e i v e dm u c ha t t e n t i o n t h ed e v e l o p m e 眦o far a p i d ，s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v em e t h o d a n dt h ef a b r i c a t i o no fas i m p l ea n dc h e a pa n a l y t i c a ld e v i c ef o rt h ed e t e c t i o no f b i o l o g i c a lm o l e c u l a r s u b s t a n c e sh a v eb e e na l o n g s t a n d i n gg o a l t h ea i mo ft h e p r e s e n t w o r k i st o d e v e l o p n o v e l e l e c t r o g e n e r a t e d c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y a n dt o d e s i g n a n df a b r i c a t ee l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o r sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f b i o l o g i c a lm o l e c u l ew i t l ls e n s i t i v i t y , s e l e c t i v i t ya n d s i m p l i f y i nt h i st h e s i s ，t a k i n ga d v a n t a g e s o ft h eu n i q u e p r o p e r t i e so fn a n o p a r t i c l e sa n d t h e s p e c i f i c i t y o fb i o l o g i c a lm o l e c u l a rr e c o g n i t i o ns u b s t a n c e s ，s u c h a s e n z y m e ， a n t i g e n a n t i b o d y ，d n a ，w eh a v ed e s i g n e d as e r i e so fe l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sa n d d e v e l o p e d as e r i e so fe l e c t r o g e n e r a t e d c h e m i l u r n i n e s e e e ei m m u n o a s s a y 翻r 畦描 d e t e r m i n a t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e ，g l u c o s e ，p h e n o l ，i g g ，d i g o x i n ，a n dd n a - a p a r t o fr e s e a r c hw o r ki nt h i st h e w si sf i n a n c i a l l ys u p p o r t e db y t h en a t i o n a ln a a n a ls c i e n c e f o u n d a t i o n o f c h i n a ( e r r a n t n o 2 0 3 7 5 0 2 5 ，n o 2 9 9 7 5 0 1 7 ) t h e m a j o r o o n t e 嚣t s 法t h i st h e s i sa r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： i nc h a p t e r1 ，g e n e r a li n t r o d u c t i o nt oe l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s ，e l e c t r o g e n e r a t e d c h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) a n ds o n o e l e c t r o c h e m i s t r y i n c l u d i n g i t s p r i n c i p l e a n d r e s e a r c h d e v e l o p m e n t ，a n d t h ep u r p o s eo f t h i sr e s e a r c hw o r kw e r ep r e s e n t e d v i n c h a p t e r2 ，t w oa m p e r o m e t r i c b i o s e n s o r s i n c o r p o r a t i n g m u l t i w a l lc a r b o n n a n o t u b e s ( m w n t ) h a v e b e e nd e s i g n e da n d a p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fh y d r o g e n p e r o x i d ei np h a r m a c e u t i c a li n j e c t i o n so fh y d r o g e np e r o x i d e a n dt ot h ed e t e r m i n a t i o no f g l u c o s ei nh u m a n s e r u mw i t l ls a t i s f a c t o r yr e s u l t s ，r e s p e c t i v e l y a m p e r o m e t r i ct h i r d - g e n e r a t i o nh y d r o g e np e r o x i d e b i o s e n s o r i n c o r p o r a t i n g m u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e sa n dh e m o g l o b i na na m p e r o m e t r i c t h i r d g e n e r a t i o n h y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o rw a sd e s i g n e db yi m m o b i l i z i n gh e m o g l o b i n ( h b ) o na g l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e m o d i f i e dw i t hm u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e s ( m w n t ) t h e d i r e c te l e c t r o nt r a n s f o ro ft h eh bi m m o b i l i z e do nt h em w n t - m o d i f i e de l e c t r o d ew a s o b s e r v e d t h ef o r m a lp o t e n t i a lo ft h ei m m o b i l i z e dh bw a s - o 2 4 1v v s a g a g c lr 3 m o l ln a c l ) a n dt h eh e t e r o g e n e o u se l e c t r o nt r a n s f e rr a t ec o n s t a n tw a s0 5 8s 。1i na 0 2 0m o l la c e t a t eb u f f e rs o l u t i o n ( p h5 4 ) t h ei m m o b i l i z e dh be x h i b i t e de x c e l l e n t e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yt or e d u c eh y d r o g e np e r o x i d ei nt h ea b s e n c ea n dp r e s e n c eo f o x y g e n ，w h i c hf a c i l i t a t e dd e s i g n i n ga na m p e r o m e t r i ct h i r d g e n e r a t i o nb i o s e n s o rf o r h y d r o g e np e r o x i d e i nt h ep r e s e n c eo fo x y g e n ，t h er e s p o n s et oh y d r o g e np e r o x i d eo f t h ed e s i g n e db i o s e n s o ra tap o t e n t i a lo f o 3 5vw a sl i n e a ri nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g e f r o m6 0 1 0 _ 6 m o l lt o6 0 x1 0 一m o l l a n dt h ed e t e c t i o nl i m i t w a s1 2 1 0 6 m o l l t h er e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o n w a s 2 4 f o r n i n es u c c e s s i v e a s s a y s a t1 0 x 1 0 5 m o l l h y d r o g e np e r o x i d e t h ed e s i g n e d b i o s e n s o rw a s a p p l i e d t ot h ed e t e r m i n a t i o no f h y d r o g e np e r o x i d ei np h a r m a c e u t i c a li 巧e c t i o n sw i t l ls a t i s f a c t o r yr e s u l t s p r e o x i d a t i v e a m p e r o m e t r i cg l u c o s eb i o s e n s o ri n c o r p o r a t i n gm u l t i w a l lc a r b o n n a n o t u b e sa n dp b 0 2a p r e o x i d a t i v ea m p e r o m e t r i cg l u c o s eb i o s e n s o ri n c o r p o r a t e d w i t hm w n ta n dp b 0 2w a sd e s i g n e di no r d e rt om a k et h eb i o s e n s o rp o s s e s s i n gt h e i n t e r f e r e n c e - 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