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中山大学硕士学位论文 酿酒酵母中g e m i n i n 同源蛋白 的筛选与鉴定 专业：生物化学与分子生物学 硕士生：李春明 指导老师：梁纯教授 陆勇军教授 摘要 g e m i n i n 是一个重要的细胞周期蛋白，它通过与另一个细胞周期蛋白c d t l 的相互作用对细胞周期进行调控。此外，在多细胞真核生物中，g e m i n i n 还参与 了神经组织的形成以及胚胎细胞的分化过程。 到目前为止，c d t l p 的同源蛋白在从酵母到人类多种真核生物中被发现，但 是g e m i n i n 的同源蛋白还没有在酵母中找到。本文通过信息生物学的方法搜索到 3 个可能的g e m i n i n 同源蛋白。通过研究发现，其中一个叫f a r 3 p 的蛋白可能是 g e m i n i n 的同源蛋白。 两个不同类型的单倍体酵母细胞交配结合成一个二倍体的过程是一个复杂 的过程，其中包括对细胞周期的调控，使待参与交配的酵母细胞的细胞复制活动 中止并停留在g 1 期。f a r 3 p 目前所知功能即参与这一调控过程，而具体如何调 控细胞周期的机制尚不清楚。我的研究发现，利用酵母双杂交的方法，f a r 3 p 可 以与c d t l p 相互作用，并且f a r 3 p 可以自身相互结合，可能是以超螺旋的方式形 成一个二聚体，同时f a r 3 p 可以与酿酒酵母的h o x 家族蛋白m a t a l p h a 2 p 相互作用。 而这些特征都符合g e m i n i n 特性。一系列的研究显示f a r 3 p 有可能是g e m i n i n 在 酵母中的同源蛋白。 关键字：d n a 复制起始；g e m i n i mf a r 3 p ：c d t l p ：酵母双杂交 酿酒酵母中o c m i n i n 同源蛋白的筛选与鉴定 s c r e e n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no f t h eg em i n i nh o m o l o g i nt h ey e a s ts a c c h r o m y c e sc e r e v i s i a e m a j o r ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y n a m e ：c h u n m i n gl i s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rl i a n gc h u n p r o f e s s o rl u y o n g j u n a b s t r a c t g e m i n i ni sa ni m p o r t a n tp r o t e i ni n v o l v e di n c e l lc y c l ec o n t r 0 1 t h i sp r o t e i nc a n b i n dt oa n o t h e rc e l lc y c l e - r e l a t e dp r o t e i nc a l l e dc d t l p ，w h i c hi se s s e n t i a lf o rd n a r e p l i c a t i o n b e s i d e s ，g e m i n i na f f e c t sb o t hn e r v o u ss y s t e mf o r m i n ga n de m b r y o n i c d i f f e r e n t i a t i o n s of a r , c d t l ph o m l o g sh a v eb e e nf o u n di ne u k a r y o t e s ，f r o mb u d d i n gy e a s tt o h u m a n h o w e v e r , t h eh o m o l o go fg e m i n i n ，t h ei n h i b i t o ro fc d t l p ，h a sn o ty e tb e e n f o u n di nu n i c e u u l a ro r g a n i s m s ，s u c ha sb u d d i n gy e a s t i nt h i st h e s i s ，t h r e eg e m i n i n h o m o l o gc a n d i d a t e si nb u d d i n gy e a s th a v eb e e ni d e n t i f i e du s i n gb i o i n f o m a t i o n m e t h o d s e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss u g g e s tt h a tf a r 3 pi sp o s s i b l yt h eg e m i n i nh o m o l o g w h e nt w oh a p l o i dy e a s tc e h sm a t ei no r d e rt of o r mad i p l o i d ，b o t hc e l l sn e e dt o b ea r r e s t e di ng 1p h a s e f a r 3 pi sk n o w nt ob ei n v o l v e di n t h i sp r o c e s s ，b u tt h e m e c h a n i s mi sn o tc l e a r i nm yr e s e a r c h ，y e a s tt w o h y b r i da n a l y s i sr e v e a l st h a tf a r 3 p c a l li n t e r a c tw i t hc d t l pa n dt h eh o xf a m i l y p r o t e i nm a t a a l p h a 2 p f a r 3 pc a n s e r f - i n t e r a c t ，p o s s i b l yf o r mad i m e r ，w h i c hi saf e a t u r eo fg e m i n i n t h es e r i e so f e x p e r i m e n t si n d i c a t et h a tf a r 3 pi sp o s s i b l yt h eg e m i n i nh o m o l o gi nb u d d i n gy e a s t k e yw o r d s ：i n i t i a t i o no fd n ar e p l i c a t i o n ；g e m i n i n ；f a r 3 p ；c d t l p ；y e a s tt w o - h y b r i d 酿酒酵母中g e m i n i n 同源蛋白的筛选与鉴定 英文缩写 a f a c t o r a c s a m p a p c a r s 盯p p - m e b s a c d c c d k c d n a c i l i p c i a p c m c o i p c t e r m i n u s d d h 2 0 d d k d m s o d n a d m s d t t e b e t b r e d l = a e m s f f c s g g 4 1 8 h a 缩略词与英汉对照 英文全称 a l p h af a c t o r a r sc o n s e n s u ss e q u e n c e a r n p i c i l l i n a n a p h a s e - p r o m o t i n gc o m p l e x a u t o n o m o u s l yr e p l i c a t i n gs e q u e n c e a d e n o s i n e5 - t r i p h o s p h a t e b e t a - m e r c a p t o e t h a n o l b o v i n es e r u ma l b u m i n c e l ld i v i s i o nc y c l e c y c l i nd e p e n d e n t k i n a s e c o m p l e m e n t a r yd n a c h r o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o n c a l fi n t e s t i n a la l k a l i n ep h o s p h a t a s e c e n t i m e t e r c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n c a r b o x y lt e r m i n u s d 0 1 l b l ed i s t i l l e dw a t e r d b f 4 一d e p e n d e n tk i n a s e d i m e t h y ls u l p h o x i d e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y n u c l e o s i d ed r i p h o s p h a t e s d i t h i o t h r e i t o l e x t r a c t i n gb u f f e r e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e t h y lm e t h a n e s u l f o n a t e f l u o r e s c e n c e - a c t i v a t e dc e l ls o r t i n g g r a m g e n e t i c i n h e m a g g l u t i n i n 中文名 a 因子 a r s 一致序列 氨苄青霉素 细胞分裂后期促进复合物 自主复制序列 腺苷三磷酸 b 巯基乙醇 牛血清蛋白 细胞增殖周期 周期蛋白依赖的激酶 与r n a 互补的d n a 染色质免疫沉淀反应 小牛肠碱性磷酸酶 厘米 免疫共沉淀 羧基术端 双蒸水 d b f 4 依赖的激酶 二甲基亚砜 脱氧核糖核酸 脱氧核苷三磷酸 二硫苏糖醇 提取缓冲液 溴化乙啶 乙二胺四乙酸 甲基磺酸乙酯 流式细胞分析 克 g 4 1 8 硫酸盐 红血球凝集素 中山大学硕十学位论文 h l h l l r h u i d r i g g i p l b k b k d a m c m m g m i i l m l m n a s e n g n o c n t e r m i n u s o d 0 r c e 崛e p c r p e g 3 3 5 0 p e p s t a t i n a p i p e s p m s f p r e i c p r e r c p s b r n a s e a r p m s b s c m s c m h i s h e l i x l o o p h e l i x 螺旋环螺旋 h o u r 小时 h y d r o x y u r e a 羟基脲 i n i t i a t i o no fd n a r e p l i c a i t o nd n a 复制起始 i m m u n o g l o b u l i ng 免疫球蛋白g i m m u n o p r e c i p i t a t i o n 免疫沉淀反应 l u r i a b e r t a n im e d i u ml b 培养基 k i l o b a s e 千碱基 l od a l t o n 千道尔顿 m i n i - c h r o m o s o m em a i n t e n a n c e 微小染色质维持基因 m i l l i g r a m 毫克 m i n u t e 分钟 m i l l i l i t r e 毫升 m i c r o c o c c a ln u c l e a s e 微球菌核酸酶 n a n o g r a m 纳克 n o c o d a z o l e 诺考达唑 a m i n ot e r m i n u s 氨基末端 o p t i c a ld e n s i t y光密度 o r i g i nr e c o g n i t i o nc o m p l e x 复制起点识别复合体 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 多聚酶链式反应 p o l y e t h y l e n eg l y c e r o l3 3 5 0 聚乙二醇3 3 5 0 p e p s t a t i n a 胃酶抑制剂a p i p e r a z i n e n ，n - b i s 2 一e t h a n e s u l f o n i ca c i d 哌嗪n ，n 一二2 乙磺酸 p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e苯甲基磺酰氟 p r e i n i t i a t i o nc o m p l e x 前起始复合物 p r e r e p l c i a t i v ec o m p l e x 前复制复合物 p r e s p h e r o p l a s t i n gb u f f e r预去壁缓冲液 r i b o n u c l e a s ea核糖核酸酶a r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 转数分 s p h e r o p l a s t i n gb u f f e r 去壁缓冲液 s y n t h e t i cc o m p l e t em e d i u m 完全合成培养基 s c m l a c k i n gh i s t i d i n e 缺组氨酸完全合成培养基 6 s 酿洒酵母l f 】g e m i n i n 同源蛋白的筛选与豁定 s c m t r p s c ml a c k i n gt r y p t o p h a n s c m - t r p - - l e u s c m l a c k i n gt r y p t o p h a na n dl e u c i n e s c m l e u s c m - l e ug a lc u s c m - l e ug l uc u s c m u r a s c m l a c k i n gl e u c i n e s c ml a c k i n gl e u c i n ec o n t a i n i n gg a l a c t o s ea n dc u s 0 4 s c ml a c k i n gl e u c i n ec o n t a i n i n gg l u c o s e a nc u s 0 4 s c m l a c k i n gu r a c i l s c m - u r a - l e us c ml a c k i n gu r a c i la n dl e u c i n e s d s s e c s s d n a s 、 t a e t b s t b s t t w e e n 2 0 g “l y p d y p g s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s e c o n d s a l m o ns p e r md n a s p h e r o p l a s tw a s hb u f f e r t r i s a c e t a t e e d l a t r i s b u f f e r e ds a l i n e t r i s b u f f e r e ds a l i n et w e e n 一2 0 p o l y o x y e t h y l e n e s o r b i t a nm o n o l a u r a t e m i c r o g r a m m i c r o l i t r e y e a s te x t r a c t p e p t o n e d e x t r o s e y e a s te x t r a c t p e p t o n e g l a c t o s e y p d y e a s t e x t r a c t p e p t o n e r a f f i n o s e g l a c t o s e 缺色氨酸完全合成培养基 缺亮氨酸和色氨酸完全合 成培养基 缺亮氨酸完全合成培养基 缺亮氨酸含有半乳糖和 c u s 0 4 的完全合成培养基 缺亮氨酸含有葡萄糖和 c u s 0 4 的完全合成培养基 缺尿嘧啶完全合成培养基 缺亮氨酸和尿嘧啶完全合 成培养基 十二二烷基硫酸钠 秒 鲑鱼精子d n a 去壁漂洗液 t r i s 乙酸e d t a 三羟甲基氨基甲烷缓冲盐 t r i s 缓冲的盐非离子活性 剂 土温2 0 微克 微升 酵母粉蛋白胨葡萄糖 酵母粉蛋白胨半乳糖 酵母粉蛋白胨棉子糖半 乳糖 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：枷r 日期：巧年 6 月1 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名： 嚣魏日期：伽叼年6 月 中山大学硕士学位论文 1 1d n a 复制起始 第一章前言 真核多细胞生物的生长过程是细胞的分裂和分化过程。在细胞的分裂过程 中，离不开d n a 的复制过程。如何确保遗传物质精确复制并遗传给下一代细胞， 对生物体来说至关重要。在一个完整的细胞周期中，细胞要经历4 个相对独立的 时期。g 1 s g 2 m g 1 。细胞在完成有丝分裂后，即进入一个细胞周期。首 先进入的是g i 期。在这个时期，细胞主要是准备有丝分裂过程中所需要的d n a 以及合成相关的蛋白。在g 1 的末期，细胞需要通过一个s t a r t 检测点，在这 个过程中有一系列的蛋白参与检测。通过检测点后，细胞进入了s 期。在这个时 期，细胞进行d n a 复制，结果就是使细胞中含有基因的两份拷贝。接着细胞进 入g 2 期，这是d n a 复制结束和开始有丝分裂之间的间隙，在这期间细胞合成某 些蛋白质和r n a 分子，为进入有丝分裂提供物质条件。最后，细胞进入有丝分裂 期，细胞一分为二，并进入下一个循环。 在整个细胞周期中，d n a 复制起始的形成和调控是非常重要的一环。到目 前为止，已经发现1 0 几种蛋白参与这一过程，包括m c m 2 7 p ，o r c l - 6 p ，c d t l p ，。 c d c 6 p ，g e m i n i n 等【1 ，2 】，对于这么一个复杂精确的生物学过程，还有很多相关蛋 白有待发现。 由于基因组大小的区别，真核生物采取了与原核生物不同的复制机制。原核 生物一般只有一个单一的复制起始点，并以该点为起始依次复制。而真核生物可 在染色体上多个复制起始位点同时复制。在酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 中，其1 6 条染色体上拥有多达2 5 0 3 0 0 个复制起始位点，而在高等真核生物中， 这个数目可达成千上万个【3 1 。为了保证基因的精确复制，d n a 的复制起始过程有 套极为严格的机制。 1 2 酿酒酵母的d n a 复制起始 酿酒酵母巾g e m i n i n 同源蛋白的筛选与鉴定 1 2 1 复制子和复制原点 d n a 复制需要一个起点，复制起点有一定的特征。具有该特征的序列称之 为a r s ( a u t o n o m o u s l yr e p l i c a t i n gs e q u e n c e v 4 1 。a r s 由数个区域组成。a 区域比 较保守，它i 土i a c s ( a r sc o n s e n s u ss e q u e n c e ) 及其附近长约1 7 b p 的序列构成。a c s 是一段长约l l b p 富含a t 碱基的保守序列。b 区域靠近a 区域，但它的序列相对a 区域来说并不是非常保守。b 区域是一个标准组件，酿酒酵母的a r s l 含有三个 元件b 1 ，b 2 和b 3 ，它们都影响a r s 的活性【5 】。其中b 1 与a 靠近，同时它是 o r c ( o r i g i nr e c o g n i t i o nc o m p l e x ) l 拘识别位点。b 1 有一对相似的碱基，其作用非 常重要，它们与a c s 等距，是o r c 与d n a 结合的重要区域【酬。 1 2 2 酿酒酵母复制起始蛋白 1 2 2 1 复制原点识别复合物( o r i g i nr e c o g n i t i o nc o m p l e x , o r c l 6 p ) o r c 在从酵母到人类的真核细胞中都普遍存在，并且序列较为保守。在结 构上，复制原点识别复合物由6 个蛋白组成，o r c l 6 p ，以其分子量的大小命名， 最大的为o r c l p ，最小的为0 r c 6 p 。六个蛋白组成一个大的复合物，是d n a 复制 过程中必须的组件。o r c 可特异的与a r s 结合【7 1 ，在酿酒酵母中，o r c 特异性 的与a r s 的a b l 组件相结合，其区域达3 0 个b p 左右【8 9 1 。在整个细胞周期中，o r c 均与酿酒酵母复制原点结合。o r c 同时也是其他复制相关蛋白的装载平刨1 0 】。 1 1 2 2 细胞周期分裂蛋8 6 ( c e l ld i v i s i o nc y c l ep r o t e i n ，c d c 6 p ) c d c 6 p 首先发现与酿酒酵母中，是用细胞周期突变株筛选的实验发现的【1 。 c d c 6 p 是d n a 复制起始蛋白组装过程中的一个重要蛋白，它在o r c 结合到染色体 上之后装载，在c d c 6 p 结合以后，m c m 家族蛋白再结合上染色体来【1 2 j 。在c d c 6 p 的基因敲除酵母株中，细胞停留在g 1 期，但不会引发起始d n a 的合成。同时c d c 6 p 的缺失也会影响p r c r c ( p r e r e p l i c a t i v ec o m p l e x ) 的热稳定性，这说明c d c 6 p 也是 维持p r e r c 稳定性的必需蛋白【1 3 】。在细胞周期中，c d c 6 p 的表达量和活性受到严 2 中山大学硕士学位论文 格的控制，以阻止g 1 期以外的p r e r c 的形成，从而保i , 正d n a 在整个细胞周期中 只被复制一次【1 4 , 1 5 】。 1 2 2 3c d t l p c d t l p 首先在裂殖酵母中作为一个c d c l o p 转录调控因子的作用蛋白而发现 1 16 1 ，随后的实验表明它是一个重要的细胞周期蛋白。酿酒酵母的c d t l p 发现得比 较晚，因为酿酒酵母c d t l p 跟其他物种的c d t l p 相似性只有1 0 1 5 。酿酒酵母的 c d t l p 是m c m 2 7 p 蛋白复合物被装载至u p r e r c s 中所必需的；它与c d c 6 p - - 起发 挥该装载作用【1 7 】。在酿酒酵母中，c d t l p 在g 1 后期被c d k s 排除在核外，以防止 g 1 期以外的p r e r c 的形成。此外，c d t l p j 还有一个重要作用就是抑制蛋f 刍g e m i n i n 的靶蛋白【1 8 1 。g e m i n i n 是一个跟细胞复制和细胞分化相关的蛋白，已经在从线虫 到人类的多细胞生物中发现，但还没有在酵母中发现【1 9 , 2 0 】。 1 2 2 4 微染色体维持蛋白( m i n i c h r o m o s o m em a i n t e n a n c ep r o t e i n s ，m c m 2 7 p ) m c m 蛋白复合物是d n a 复制起始的必需蛋白。这些蛋白共同协作在d n a 复制起始的早期发挥重要的作用。m c m 2 7 p 这6 个蛋白在众多生物体中都存在 很高的保守性1 2 1 。虽然m c m 2 7 p 存在序列上的相似性，但是任何一个蛋白的删 除都将影响m c m 蛋白复合物的功能，酿酒酵母将无法生存。这说明每一种m c m 蛋白对于细胞都是必需的【2 1 , 2 2 , 2 3 , 2 4 】。 m c m 蛋白复合物是p r e - r c 的核心组件，通过o r c 、n o c 3 p 、c d c 6 p 和c d t l p 等的共同作用装载到染色体上【1 ，2 1 。m c m 蛋白复合物被装载到染色体的同时， c d c 6 p 和c d t l p 将会从染色体上卸载下来。m c m 蛋白复合物不仅在复制起始中起 作用，在d n a 合成的延伸过程中也是必不可少的。 1 2 2 5m c m l o p m c m l o p ：是p r e r c 的组成部分，它是d n a 高效复制所必需的蛋白1 2 5 l 。 研究 表明m c m l o p 定位在复制起始原点，并且和m c m 复合物的六个亚基结合【2 6 】。在 g 1 期p r e r c 形成后去掉m c m l o p 会导致m c m 复合物从染色体上解脱下来但是不 影响o r c 与染色体的结合，在d n a 复制开始后，m c m l o p 对复制叉的延伸有重要作 用【2 7 2 8 】；遗传学研究表明m c m l o p 可以和不同的延伸因子相互作用，这些延伸因 3 酿洒酵母中g e m i n i n 同源蛋白的筛选与鉴定 子包括 ：o l y m e r a s ed 和e 的一个亚基等，猜测m c m l o p 对于延伸因子的转载是必须 的【2 9 1 。 1 2 2 6c d c 7 d b f 4 蛋白激酶 c d c 7 首先通过细胞周期缺陷株的方法筛选出来【1 1 】。研究表明c d c 7 p 可以与 组蛋白h 1 免疫共沉淀，说明它在生物体内可以与组蛋白h 1 相互作用【3 0 3 1 1 。c d c 7 p 在d n a 的复制起始中是必需的，但它的激酶活性却不足以激活起始的开始，仍 需要其他因子的协作。 c d c 7 和d b f 4 有十分密切的联系。在酿酒酵母中高表达d b f 4 基因可以抑 制c d c 7 的突变表型，反之，c d c 7 基因也可以抑制d b f 4 的突变表型【3 2 1 。遗 传分析表明c d c 7 p 可以与o r c 2 p 发生相互作用，而d b f 4 p 可以在o r c 结合到 d n a 后与起始位点相连【3 3 1 。所有的这些发现预示c d c 7 p 和d b f 4 p 有可能会形成 一个复合物从而激活d n a 的复制起始。在d n a 复制起始过程中，c d c 7 d b f 4 磷酸化m c m 蛋白复合物【3 4 ，3 5 1 ，引发d n a 复制的起始。此外，c d c 7 d b f 4 参与 了把c d c 4 5 p 募集到起始位点的过程【3 6 】。 c d c 2 8 p 全称为周期蛋白依赖性蛋白激酶( c y c l i n d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e s ) c d k ，它的活性依赖与g 1 周期蛋白c l n l 3 和s 期周期蛋白c l b l 6 。c d k 的活性提 高会使细胞由g 1 期进入s 期，激活相关蛋白的功能，开始d n a 的复制；d n a 复 制开始后，c d k 的高活性可以阻d z p i e r c 的再次形成，保证d n a 在整个细胞周 期中只被复制一次。其方式包括磷酸化c d c 6 p ，脱离染色体，进入泛素降解途径， 以及将m c m 蛋白排出核外【3 7 3 引。 1 2 2 7c d c 4 5 p ( c e hd i v i s i o nc y c l ep r o t e i n4 5 c d c 4 5 p ) c d c 4 5 p 在低温敏感缺陷株的筛选中被发到3 9 1 。它对于酿酒酵母的d n a 复制 起始是必需的【4 0 1 。c d c 4 5 p 与m c m 蛋白复合物和o r c 协同作用促使 d n a 复带i j 起 始。研究表明，c d c 4 5 p 的突变会阻止d n a 聚合酶的组装，此外c d “5 p 对复制叉 的延伸也有作用，猜测c d c 4 5 p 是复制叉的组成部分【3 6 】。 1 2 3p r e - r c 的组装及功能 4 c p 山大学碗士学位论文 在p r e - r c 的组装过程中首先是o r c 蛋白主动去识别复制起始原点并与之 相结台。然后，阻o r c 复合物为平台募集其他复制起始相关蛋白。最先结合上 去的是c d c 6 p ，c d c 6 p 的结合会改变o r c - c d c 6 p 复合物的构象，从而为m c m 2 7 p 的结台以及c d t l p 的装载奠定基础。当m c m 蛋白复合物结合到染色体上， c d k s ( c y c l i n d c p c n d c n t k i n a s e s ) 和c d c 7 家族蛋白的激酶就会丌始磷酸化过程 激发d n a 合成的起始。c d k s 可以使c d c 4 5 p ，d n a 聚台酶a 和其他在d n a 复 制叉上起作用的蛋白装载到染色体上。c d c 6 p 和c d t l p 在这个过程中会从p r e r c 上卸载下来。c d c 6 p 被磷酸化并进入泛素降解途径。c d t l p 则被迁出核外。当d n a 合成完成以后，m c m 2 7 p 以及c d c 4 5 p 从复合物上分离出来。简图如下： ( 二埃) 1 0 r ，i 萝) ( 二露。 j 篇 崮1 i 酿酒酵母的d n a 复制起始模型 f i g u r e l _ l m o d e lo f t h e i n i t i a t i o n o f d n a m p l i c a t i o n i n s c e r e v i s i a f 1 3 酿酒酵母有性生殖过程中的信号传导 1 3 1 酿酒酵母的有性生殖 酿酒酵母存在两种类型的单倍体细胞，a 和o 。a 型酵母细胞含有m z a t b 基因 型细胞中含m a t a 基因。在营养丰富的情况下酵母以单倍体细胞的形式自 5 带心一 h 、 塑 。 q 酿洒酵母中g e m i n i n 同源篮白的筛选与鉴定 主生长，并以出芽方式生殖。但在外界环境欠佳，营养缺乏的情况下，两种不同 类型的酵母细胞将进行有性生殖，相互结合形成一个二倍体。在这个过程中a 型 酵母细胞释放出a 因子，同时它本身具有q 受体，可以感知q 因子。相应的，a 型酵母细胞释放出q 因子，同时它本身具有a 受体，可以感知a 因子。两种不同类 型的细胞通过彼此分泌的信息素因子与相应受体结合，以激活受体耦联g 蛋白为 起点，触发一系列的反应，使细胞沿着信息素浓度梯度方向定向极性生长【4 1 1 。 最后两个单倍体酵母细胞发生接触，融合为一个二倍体。在这个过程中，信号沿 着一个通道网传递，从而激发与有性生殖相关基因的表达，以及中止细胞的细胞 周期，使其停在g 1 期。 1 3 2 信息素的传导 在有性生殖的过程中，信息素的传导过程被激活。许多与信息素感知和传 递相关的蛋白已经被发现【4 引。a 或者q 酵母细胞释放的a 型信息素或者a 信息素与 相反类型的酵母细胞表面的受体结合。a 信息素受体由s t e 2 基因编码，q 受体则 由s t e 3 编码。受体蛋白嵌在细胞膜中，来回七次。它由三个部分组成，分别为g q ，g1 3 ，gy 。在信息素与受体结合的过程中，g1 3 ，gy 将会分离出来。g1 3 y 接着触发下游的蛋白激酶反应通道，该反应通道控制这两个重要的生物学过 程。一个是激活转录调控因子s t e l 2 ，从而使与有性生殖相关的基因能够表达。另 一个是中止细胞周期的进行，主要的相关蛋白是f a r l p ，有研究显示f a r l 通过与 细胞周期相关蛋i 刍c d c 2 8 p 相互作用来控制细胞周期。gby 同时也跟酵母细胞的 极性生长以及酵母间桥的形成密切相关【4 3 , 4 4 】。 6 中山大学硕十学位论文 p h e r o m o n e m e m b r a n e f o r m a t i o n 喜 m a p kc a s c a d e s t el2 f a r 王 t r a n s c r i ! g 。a t t e s t lr a n s c n o t l o n t i1 图1 2 酿酒酵母信息素信号传导途径m 1 1 3 3 信息素与细胞周期的调控 为了研究信息素导致酵母细胞中止在g 1 期的作用机理，科学家发现了多 个的f a r 系列的蛋白。缺失该系列蛋白的酵母细胞能够进行正常的信号传导过程， 并且能触发有性生殖的反应，但是无法将细胞停留在g 1 期。f a r l p 是最先发现 的f a r 系列蛋白。f a r l p 通过与c d c 2 8 p 的结合来影响细胞周期，但是目前这个结 论受到质疑。有研究显示f a r l p 和c d c 2 8 p 在体内无法相互作用。f a r l p 对细胞的 极性生长也有影响，无论是在有性生殖时期还是在营养生殖时期1 4 5 】。 其余与信息素介导的细胞周期中止相关的f a r 系列蛋白陆续被发现，包括 f a r 3 1 l p 。其中以f a r 3 p 为代表，研究显示f a r 3 p 影响细胞周期的机制跟f a r l p 完全不一样。f a r l p 和f a r 3 p 均缺失的菌株相对于单独缺失f a r l p 或f a r 3 p 的菌株， 在信息素作用下；期细胞周期停留的效果要强。这说明f a r l p 和f a r 3 p 是通过两 种不同的途径影响细胞周期的。有实验表明f a r 3 p ，f a r 7 p ，f a r 8 p ，f a r 9 p ，f a r l o p ， f a r l l p 存在一个相互作用网，在细胞中，这5 个蛋白可能是结合成一个复合物 发挥作用的【州。 7 酿洒酵母中g e m i n i n 同源蛋白的筛选与鉴定 1 4p s i b l a s t 1 4 1 序列比对和数据库搜索 比对是科学研究中最常见的方法，通过将研究对象相互比较来寻找对象可 能具备的特性。在生物信息学研究中，比对是最常用和最经典的研究手段。 最常见的比对是蛋白质序列之间或核酸序列之间的两两比对，通过比较两 个序列之间的相似区域和保守性位点，寻找二者可能的分子进化关系。进一步的 比对是将多个蛋白质或核酸同时进行比较，寻找这些有进化关系的序列之间共同 的保守区域、位点，从而探索导致它们产生共同功能的序列模式。此外，还可以 把蛋白质序列与核酸序列相比来探索核酸序列可能的表达框架；把蛋白质序列与 具有三维结构信息的蛋白质相比，从而获得蛋白质折叠类型的信息。 比对还是数据库搜索算法的基础，将查询序列与整个数据库的所有序列进 行比对，从数据库中获得与其最相似序列的已有的数据，能最快速的获得有关查 询序列的大量有价值的参考信息，对于进一步分析其结构和功能都会有很大的帮 助。近年来随着生物信息学数据大量积累和生物学知识的整理，通过比对方法可 以有效地分析和预测一些新发现基因的功能。 1 4 2p s i b l a s t 及其算法 b l a s t 通过序列与基因组数据库的比对，找出基因组中与该序列相似的 基因。b l a s t 方式在生物信息学中得到广泛的使用。今年来，b l a s t 新发展了 一种算法称为位点特异性迭代b l a s t ( p s i b l a s t ) 。p s i b l a s t 的特色是每次 用序列搜索数据库后，再利用搜索的结果重新构建新的相似性序列集，然后用新 的序列集再次搜索数据库，如此反复直至没有新的结果产生为止。总之， p s i b l a s t 的主要思想是利用多次迭代找出最佳结果。p s i b l a s t 自然地拓展 了b l a s t 方法，能寻找蛋白质序列中的隐含模式【4 6 1 ，有研究表明这种方法可以 有效的找到很多序列差异较大而结构功能相似的相关蛋白，甚至可以与一些结构 比对方法，如t h r e a d i n g 相媲美。其单一循环的具体算法如下： 8 中山大学硕士学位论文 p s 差一b l a s t 算法 ( 1 ) 将长为l 的待比对序列以步长臀分为糟千小段 _ _ - _ i l 长为l 的待比埘序列 最多可分为l - w + i 段小片段 ( 对蛋白序列来说，霄一般为3 ) 小片段组成待埏配数组 提交到基因组进行比肘 图1 3p s i - b l a s t 算法第一步 f i g u r e1 3t h ef i r s ts t e po fp s i b l a s t 第一步：将提交的序列以图中所示方法分成若干段。对于一段长为l 的序列， 如果分段步长为w 的话，将会有l w + 1 段分序列。比如a t c g 的序列，l 为4 ， 如果步长w 为2 ，则可分为a t , t c ，c g 共4 - 2 + 1 = 3 个分段。 ( 2 ) 待匹配数组巾的片段与幕戮纽序列比对，找出捆同序列 一一- - - - - - - - i i = = = = = = 摹囡组序列 亍= = = = 二= 二三宝寸了、一二二= 里剧 相同的强配 图1 4p s i b l a s t 算法第二步 f i g u r e1 4t h es e c o n ds t e po fp s i - b l a s t 第二步：将分段序列与数据库中的序列进行比对。在比对的过程中，以长为w 的小段为匹配单位，找出基因组数据库中与之序列相同的片段。 9 酿酒酵母中g e m i n i n 同源蛋白的筛选与签定 ( 3 ) 对于每个相同片段的姨配，将待比埘序列和耩因组序列向两个方向 蘧怖，蛊刘两者的相似性鹾德小予s 。 一= 两嗣；，_ 互 毒； 上 _ = 爿爿= = = 毕 蜃大逃蹴片段 图1 5p s i - b l a s t 算法第三步 f i g u r e1 5t h et h i r ds t e po fp s i b l a s t 第三步：对于每一个匹配，在匹配位点进行左右延伸，尽可能的在阂值允许的 范围内扩大相似性片段长度，直到两序列的相似性系数低于所设阈值。 以上三步是算法的一个循环，完成以后，在基因组中所找到的有一定相似性 的序列将会添加进相似性序列集，并以该序列集作为新的比对序列，与基因组数 据库进行新一轮的比对。如此循环，知道相似性序列集不再增加为止。 基于序列模式的数据库搜索灵敏度较高、特异性较好，因而可以发现一些距 离较远但却具有生物学意义的相似序列。比如线虫g e m i n i n 同源蛋白的发现即用 p s i b l a s t 方法找出【4 7 1 。 1 5g e m i n i n 1 5 1g e m i n i n 的功能 g c m i n i n 蛋白在1 9 9 8 年被m c g a r r y 和k i r s c l m e r 筛选出来，随后的研究表明 g e m i n i n 不仅参与d n a 的复制过程，它对细胞的分化也有重要作用。 g e m i n i n 参与d n a 的复制过程。在d n a 复制开始以后的s g 2 期，g e m i n i n 通过与c d t l p 的相互作用阻止m c m 家族蛋白的结合到染色体上【4 引。在s g 2 期， c d t l p 与m c m 家族蛋白顺利结合到p r e r c 上是复制起始的一个重要条件， g e m i n i n 与c d t l p 的作用则抑制p r e r c 的再次形成，从而抑制了d n a 的再次复 制。而在g