（生物物理学专业论文）丙酯草醚的ahas作用靶标及微粒体代谢研究.pdf

张泉浙江大学硕士学位论文 摘要 2 一嘧啶氧基- n 一芳基苄胺类衍生物是我国拥有自主知识产权、自行创制的一 类具高效除草活性的农药先导化合物，具有国际原创性。丙酯草醚是该类化合物 中已成功开发的一种新型高效油菜田除草剂。目前，国内外有关丙酯草醚的除草 形式及其对作用靶标的抑制作用、除草选择性的代谢基础等尚缺乏必要的研究。 明确丙酯草醚除草形式对作用靶标的抑制作用，阐明丙酯草醚在植物体内的代谢 途径，尤其是其增、脱毒途径，对于明确其除草作用机理至关重要。 本文旨在研究丙酯草醚及其可能的代谢产物对a h a s 的抑制作用及其在微 粒体中的代谢作用。主要研究结果如下： 1 、以油菜叶片和子叶为试材，对乙酰乳酸合酶( a h a s ) 部分纯化及活性 测定的条件进行了优化。通过不同饱和浓度硫酸铵( 2 5 - 5 0 ，5 1 5 - 4 0 ， 1 5 - 4 0 ) 及p e g ( w w , 5 - 1 5 ) 分级沉淀a h a s 并比较不同反应时间的酶活 力大小，确定以下酶部分纯化与测定条件能得到较高的酶比活力，且步骤相对简 单；硫酸铵饱和浓度1 5 4 0 分级沉淀，酶促反应时间为3 0 m i n ，反应温度3 7 。c 。 由于分离过程中酶活力损失较大，试图通过梯度离心法分离叶绿体来进一步 纯化a h a s 的效果并不理想。 2 、支链氨基酸的负反馈调节作用是植物a h a s 的特征，在多次提取不同植 物材料a h a s 过程中注意到，三种支链氨基酸对a h a s 酶活力的抑制作用根部 的总是小于来自叶片的酶，这与早期文献报道的植物中存在负反馈抑制差异很大 的a h a s 同工酶相一致，由此推测根部a h a s 可能代表一种对支链氨基酸不敏 感的a h a s 同工酶。第二种可能是在提取过程中可能发生了酶蛋白的部分降解， 改变了酶对支链氨基酸的敏感性，或者是a h a s ( 粗) 酶测定中有其它干扰因子。 针对第二种可能性，我们通过加入蛋白酶抑制剂d p d s 对提取过程中酶活性及其 负反馈抑制的变化情况进行了分析。初步结论是蛋白水解不是造成根叶来源 a h a s 负反馈差异的主要原因，根部存在对支链氨基酸不敏感的丙酮酸脱羧酶干 扰了a h a s 酶活性可能是其主要原因。 3 、以油菜和玉米叶片为试材，研究丙酯草醚及其推测代谢产物对a h a s 的 张泉 浙江大学硕士学位论文 抑制作用。具有“嘧啶一氧苯”母核结构的嘧啶水杨酸类化合物a 能强烈抑制酶 活性，其余包括丙酯草醚及其重排产物在内的7 种化合物均无效。这与报道的丙 酯草醚为前体除草剂的结果一致，但丙酯草醚在植物体内是否先转化成嘧啶水杨 酸类化合物再发挥其除草作用有待于进一步研究。 4 、通过根长实验法，研究1 0 个小麦品种对丙酯草醚的敏感性。在2 0 1 j m 丙 酯草醚的作用下，b y 5 3 5 受到的抑制作用最明显，达到了6 2 4 ( 扣除溶剂影响) ； 抑制率最低的为临麦2 号和泰山2 3 # ，分别为3 8 7 、4 0 7 ( 扣除溶剂影响) 。 5 、从经5 乙醇和1 0 m m 丙酯草醚诱导的小麦黄化苗地上部制各微粒体， 研究【c 环- u - 1 4 c n 酯草醚在小麦微粒体中的代谢作用。h p l c m s 鉴定了3 种标 记产物的分子结构，获知丙酯草醚在小麦微粒体的作用下进行了芳环的羟基化作 用，微粒体反应体系也可能有助于丙酯草醚的异构化，在微粒体中丙酯草醚的代 谢可能与s m i l e s 重排反应有关。但丙酯草醚在植物细胞内是否容易转化成重排 系列化合物以及这些代谢物与丙酯草醚的除草活性或者脱毒的相关性尚待进一 步研究。 关键词：丙酯草醚；a h a s ；小麦微粒体；p 4 5 0 s ；作用机理 张泉浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t a san o v e lc l a s so fh e r b i c i d ep r e c u r s o r , 2 - p y r i m i d i n y l o x y - n a r y l - b e n z y l a m i n e d e r i v a t i v e s ，w h i c hs h o w e dp o t e n th e r b i c i d a la c t i v i t i e s ，w e r ei n v e n t e di nt h ee a r l y 2 0 0 0 si nc h i n aw i t l li n d e p e n d e n ti n t e l l e c t u a lp r o p e r t yr i g h t s o n eo f t h e s ec o m p o u n d s p y r i b a m b e n z - p r o p y lw a ss u c e e s s f u u yd e v e l o p e da sap o t e n th e r b i c i d ef o rr a p ef i e l d f e ws t u d i e s ，h o w e v e r , h a v eb e e nc o n d u c t e do l lt h eh e r b i c i d a lf o r m ( s ) ，t h es i t eo f a c t i o na n ds e l e c t i v i t yo ft h eh e r b i c i d eb o t ha th o m ea n da b r o a d f o rt h ep u r p o s et o u n d e r s t a n dt h em o d eo f a c f i o no f p y r i b a m b e n z - p r o p y l ，i ti sc r i t i c a lt oc l a r i f yt h et a r g e t s i t ei n h i b i t i o nb yh e r b i c i d a lf o r m ( s ) a n dt oe l u c i d a t et h em e t a b o l i s mo ft h eh e r b i c i d e i np l a n t t h ep r e s e n ts t u d yw a sc a r d e do u tt oa d d r e s st w om a j o ri s s u e s ：1 ) a h a s i n h i b i t i o nb yp y r i b a m b e n z - p r o p y la n dt e n t a t i v em e t a b o l i t e sa r t i f i c i a l l ys y n t h e s i z e d ； a n d2 1m i c r o s o m a lm e t a b o l i s mo f p y r i b a m b e n z - p r o p y l m a j o rr e s u l t so b t a i n e da r ea sf o l l o w s ： 1 p r o c e d u r e sw e r ee s t a b l i s h e db o t l lf o rt h ep a r t i a lp u r i f i c a t i o na n df o ra s s a yo f a h a s t h eh i g h e s ts p e c i f i ca c t i v i t ya n dr e c o v e r yo ft h ee n z y m ew e r eo b t a i n e db y 1 5 - 4 0 a sf r a c t i o n a t i o na m o n gt h r e ed i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nr e g i m e so fa m m o n i u m s u l f a t e ( a ss a t u r a t i o nc o n c e n t r a t i o n , 2 5 - 5 0 ，5 - 1 5 - 4 0 a n d1 5 - 4 0 ) p e g ( w w , 5 * 0 - 1 5 ) f r a c t i o n a t i o ng a v es i m i l a rr e s u l t sa s1 5 - 4 0 a s f o rc o n s i s t e n c ya n d c o n v e n i e n c e ，3 0m i na n d3 7 。cw e r es e l e c t e df o ra h a sa s s a y 2 d u r i n gi s o l a t i o n so fa h a sf r o mv a r i o u sp l a n ts o u r c e s ，w en o t i c e dt h a tt h e f e e d b a c ki n h i b i t i o no fa h a sa c t i v i t i e sb yb r a n c h e d - c h a i na m i n oa c i d sd i s p l a y e da n i n t e r e s t i n gp h e n o m e n o n ：l e a fa h a sw a sa l w a y si n h i b i t e dt oam u c hg r e a t e re x t e n t t h a nt h o s eo f r o o ta h a s t h ep o s s i b i l i t yo f p a r t i a lp r o t e o l y s i so f a h a sa st h ec a u s e f o rc h a n g e so fa h a ss e n s i t i v i t ya g a i n s tb r a n c h e d - c h a i na m i n oa c i d sw a st e s t e db y i n c l u s i o no fp r o t e a s ei n h i b i t o rd p d sd u r i n gg i l z y m ei s o l a t i o nf r o mz e am a y s n o n e t h e l e s s ，p r e l i m i n a r yr e s u l t se x c l u d e de n z y m ep r o t e o l y s i sa st h em a j o rc a u s ef o r t i l ed i f f e r e n t i a lf e e d b a c ki n h i b i f i o nf r o ml e a v e sa n dr o o t s ；r a t h e rs u c hd i f f e r e n c ew a s p r e s u m a b l yr e s u l t e df r o mt h ep r e s e n c ei nr o o t so fp y r u v a t ed e c a r b o x y l a s ea c t i v i t i e s ， 张泉浙江大学硕士学位论文 w h i c hi n t e r f e r e dw i t ht h ea h a sa s s a y 3 w i t ha l i a sf r o ml e a v e so fb r a s s i c an a p u sa n dz e am a y s ，i n h i b i t i o n e x p e r i m e n tb yp y r i b a m b e n z p r o p y l a n di t st e n t a t i v em e t o b o l i t e s a r t i f i c i a l l y s y n t h e s i z e ds h o w e dt h a to n l yt h ec o m p o u n da ，p o s s e s s i n g “p 妒m i d i n y l - o x y s a l i c y l a t e ”，ac o r eh e r b i c i d a ls t l u e t u r eo f p y r i m i d i n y ls a l i c y l a t eh e r b i c i d e s ，s t r o n g l y i n h i b i t e da l i a s a c t i v i t y w h i l ea l ls e v e no t h e r c o m p o u n d si n c l u d i n g p y r i b a m b e n z - p r o p y la n d i t sr e a r r a n g e m e n t p r o d u c ts h o w e d l i t t l ee f f e c t t h e r e f o r e ，t h e e x p e r i m e n t s e o n f u - m e d p r e v i o u ss u g g e s t i o n t h a t p y r i b a r n b e n z - p r o p y l w a sa p r o h e r b i c i d e t h er e s u l t sw o u l da l s os u g g e s tt h a tp y r i b a r n b e n z - p r o p y lm i g h t e x e r ti t s h e r b i c i d a le f f e c t sb yf i r s tt r a n s f o r m i n gt os i m i l a rs t r u c t u r e sa st h o s eo fp y r i m i d i n y l s a l i e y l a t eh e r b i c i d e s 4 r o o tl e n g t he x p e r i m e n t sw i mt e nc n l t i v a r so fw h e a ts h o w e dt h a tw i t h2 0 1 a m p y f i b a m b e n z - p r o p y l ，t h el a r g e s ti n h i b i t i o no fr o o tg r o w t ho c c u r r e di nb y 5 3 5b y 6 2 4 w h i l et h o s eo f l i n m a i2 # a n dt a i s h a n2 3 # w e r ei n h i b i t e db y3 8 7 a n d4 0 7 ， r e s p e c t i v e l y 5 nv i t r om e t a b o l i s mo f 【cr i n g - u - 1 4 c 】p y r i b a m b e n z - p r o p y lw a ss t u d i e dw i t h m i c r o s o m e si s o l a t e df r o me t i o l a t e dw h e a ts e e d l i n g sp r e t r e a t e dw i t h5 ( v v ) e t h a n o l a n d1 0m mp y r i b a m b e n z - p r o p y l l a b e l e df r a c t i o u so fr e a c t i o np r o d u c t sw e r ef a s t s e p a r a t e da n dd e t e r m i n e db yh p l c - l s ca n dt h e nt h r e em a j o rp u t a t i v em e t a b o l i t e s “l ，y 2a n dv 3 ) w e r ei d e n t i f i e db yh p l c m s a n a l y s i so f t h em o l e c u l a rs t r u c t u r e s o ft h e s ep r o d u c t si nr e s p e c tt ot h a to fp y r i b a m b e n z - p r o p y ls u g g e s t e dt h a tt h e s e p r o d u c t sw e r el i k e l ya l l r e l a t e dt os m i l e sr e a r r a n g e m e n t t h es t u d yi n d i c a t e dt h a t p y r i b a m b e n z - p r o p y lu n d e r w e n th y d r o x y l a t i o ni nw h e a tm i c r o s o m e sa n dt h ei nv i t r o s y s t e mm i g h ta l s of a c i l i t a t e i s o m e r i z a t i o no ft h eh e r b i c i d e f u r t h e rs t u d i e sa l e r e q u i r e dt oc l a r i f yw h e t h e rr e a r r a n g e m e n tr e a e t i o u so fp y r i b a m b e n z - p r o p y la r er e a d y t oo c c u rw i t h i n p l a n t c e l l sa n dw h e t h e rt h e s es m i l e sr e a r r a n g e m e n t - r e l a t e d m e t a b o l i t e sa l ei n v o l v e di nh e r b i c i d a la c t i v i t i e sa n d o rd e t o x i f i c a t i o no ft h e ( p r o - ) h e r b i c i d e k e y w o r d s ：p y r i b a m b e n z - p r o p y l ；a l i a s ；w h e a tm i c r o s o m e ；p 4 5 0 s ；m o d eo f a c t i o n 缩略词 a b b r e v i a t i o n s 英文缩写英文全称中文名称 a h a s a c c t o h y d r o x y a c i ds y n t h a s o 乙酰羟酸合酶 a l s a c c t o l a c t a t es y n t h a s e乙酰乳酸合酶 a sa m m o n i u ms u l f a t e 硫酸铵 b s ab o v i n es e r u n la l b u m i n 牛血清白蛋白 d m f n ，n d i m e t h y l f o r m a m i d e n ，n 一二甲基甲酰胺 d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e二甲基亚砜 d p d s 2 ，2 - d i p y r i d y ld i s u l f i d e2 , 2 一邻联吡啶二硫化物 d t td i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a o e t i ea c i d 乙二胺四乙酸 e g t a e t h y l e n eg l y c o l b i s p a m i n o e t h y l乙二醇双( 2 - 氨乙基醚) 四 e t h e r - n ，n ，n ，n - t e t r a a c e t i ca c i d乙酸 f a df l a v i na d e n i n ed i n u c l e o t i d e 黄素腺嘌呤二核苷酸 g s tg l u t a t h i o n et r a n s f e r a s e 谷胱甘肽转移酶 h e p e s - 【2 h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - n 4 - 羟乙基哌嗪乙磺酸 一 2 - e t h a n e s u l f o n i ea c i d ) h p l c h i g hp e r f e r m a n e el i q u i d高效液相色谱 c h r o m a t o g r a p h y l s c l i q u i ds c i n t i l l a t i o nc o u n t i n g 液体闪烁计数仪 m sm a s ss p e c t r o m e t r y 质谱 n a d p h d - n i t o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e 烟酰胺腺嘌呤二核营酸 2 - p h o s p h a t e p 4 5 0 s c y t o c h r o m ep 4 5 0 s细胞色素p 4 5 0 酶系 p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 p o p o p 1 , 4 - d i - 【2 - ( 5 - p h e n y l o x a z o l y 0 - b e n z e n e1 , 4 一双【2 - ( 5 - 苯基噫唑) 】苯 p p o 2 , 5 一d i p h e n y lo x a z o l e2 , 5 一二苯基嗯唑 n i d pt h i a m i n ed i p h o s p h a t e 氯化硫胺素焦磷酸盐 致谢 本论文是在黄建中副教授的悉心指导下完成的。从论文的选题，实验的设 计，直至论文的撰写无不凝聚着导师的心血和智慧。两年来，导师在我的学习、 工作、生活中都给予了无微不至的关怀。导师严谨的治学态度，求是创新的科 研精神，广博的学识让我深深牢记，必将受益终生。值此论文付梓之时，向恩 师致以最诚挚的谢意! 同时，在实验的过程中遇到了许多困难，幸蒙叶庆富教授指导，并提出了 很多富有成效的针对性意见，帮助我解决问题，开拓思路，使实验得以顺利完 成。在此向叶老师致以深深的谢意! 在攻读硕士期间，本所陈子元院士、华跃进教授、徐步进教授、吴殿星教 授，崔海瑞教授、汪志平副教授、张永熙副教授、张明龙副教授等都曾给我很 多的关心、帮助和指导，在此表示衷心的感谢。 感谢课题组汪海燕博士、韩爱良博士、王伟博士、丁炜硕士、朱其松硕士， 余志扬硕士、岳玲硕士尤其是杨征敏博士在课题研究、学习、生活中给我的热 忱帮助与启迪。感谢研究生同仁孙宗涛、李雪斌、黄晖、张巧生、姜磊、王继 业、李腊梅、马军辉等，他们同样在工作、学习中，给予了我很大的支持。 最后，特别感谢我的家人，是他们的无私的关爱给我了克服困难的勇气和 动力，使我能够顺利完成学业。 谨向参加本论文评阅、答辩和对论文提出宝贵意见的所有专家、朋友致以 最诚挚的谢意和最衷心的祝愿! 张泉 2 0 0 7 年夏于华家池 张泉浙江大学硕士学位论文 第1 章文献综述 1 1 乙酰羟酸合酶( a h a s ) 根据辅助因子、底物专一性及在生理作用上的差异，乙酰羟酸合酶( a c e t o h y d r o x y a c i d s y n t h a s e ；a h a s ；也称乙酰乳酸合酶a e e t o l a c t a t es y n t h a s e ；a l s ：e c2 2 1 6 ) 可分成两类 ( d u g g l e b ya n dp a n g2 0 0 0 ) ： l 、f a d 依赖型a h a s ，存在于植物、藻类、真菌、细菌、古细菌，但尚未在动物 中发现。是催化支链氨基酸( 亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸) 生物合成途径关键反应的酶， 催化两分子丙酮酸或一分子丙酮酸和一分子2 一酮丁酸合成一分子乙酰乳酸或一分子乙 酰羟丁酸( 图1 1 ) 。该酶受终产物( 支链氨基酸) 的反馈抑制作用，也是磺酰脲类、咪 唑啉酮类和嘧啶水杨酸类等数类除草剂的作用靶标。 2 、f a d 非依赖型a h a s ，存在于某些细菌中，仅用于合成乙酰乳酸，与这些细菌 中的2 ，3 丁二醇发酵有关，对支链氨基酸不敏感。其最适p h 值为6 0 ，比上述类型的 a h a s 低。 这两类酶的活性都需要辅助因子t h d p 和二价金属离子的存在。本文以后所涉及的 a l i a s 属于f a d 依赖型a h a s 。 1 1 1 支链氨基酸生物合成途径 植物和微生物体内支链氨基酸生物合成途径具有一个不同寻常的特征：采用四步平 行的反应合成缬氨酸和异亮氨酸。催化这四步反应的酶分别是：乙酰羟酸合酶( a h a s ) ， 酮酸还原异构酶( k e t 0 1 a c i dr e d u c t o i s o m e r a s e ；k a r l ；e c1 1 1 8 6 ) ，二羟酸脱水酶 ( d i h y d r o x y a c i dd e h y d r a t a s e ；d h a d ；e c 4 2 1 9 ) 和转氨酶( t r a n s a m i n a s e ；t a ；e c 2 6 ，1 4 2 ) 。丙酮酸是支链氨基酸合成的共同前体，2 一酮丁酸则是异亮氨酸合成的另一前 体。亮氨酸的合成还需另外三种酶：2 - 异丙基苹果酸合酶( 2 一i s o p r o p y l m a l a t es y n t h a s e ； 2 i p m s ；e c 2 3 3 1 3 ) ，3 - 异丙基苹果酸脱水酶( 3 - i s o p r o p y l m a l a t e d e h y d m t a s e ；3 - i p m d ；e c 4 2 1 3 3 ) 和3 一异丙基苹果酸脱氢酶( 3 - i s o p r o p y l m a l a t ed e h y d r o g e n a s e ；3 - i p m d h ；e c 1 1 1 8 5 ) 。a h a s 催化的反应作为支链氨基酸合成的第一步共同反应，对碳代谢流向支 链氨基酸的多寡起到控制作用，此外，终产物支链氨基酸的负反馈调节作用也是碳流调 l 张泉浙江大学硕士学位论文 节的重要因素。 植物各个器官，尤其是幼嫩组织中都有支链氨基酸的生物合成。在细胞水平上，植 物中支链氨基酸合成在叶绿体中进行( s i n g ha n ds h a n c r1 9 9 5 ) ，a h a s 由细胞核编码， 一至多拷贝，活性受支链氨基酸负反馈调节。真菌的支链氨基酸生物合成在线粒体中进 行，a l i a s 单拷贝，也是核编码，活性受支链氨基酸负反馈调节。细菌a h a s 多拷贝， 各同工酶对支链氨基酸的敏感性存在较大差异。 c h 3 c = o t d c 0 0 e c 4 3 1 1 9 a h a s e c2 2 1 6 甲hl ：i h 3 + i h 3 c - - h c 一2 q 苏氨酸 ( h 3 c 一甚o g c 、 2 酮丁酸 h 3 i 邺一o 苎+ c h 2 。h c o d 2 - 7 r 酰2 驿t 醇 图1 1 支链氨基酸合成途径。酶的缩写参见正文。 f i g 1 1t h eb r a n c h e d - c h a i na m i n oa c i db i o s y n t h e s i sp a t h w a y s c et e x tf o re l l z y i l t ea b b r e v i a t i o n s 2 卸c i c l c 张泉旗江大学硬士学位论文 1 1 2a h a s 催化反应机制与动力学特征 1 1 2 1a h a s 催化反应机制 a h a s 催化反应的机制为乒乓机制，辅因子硫胺素二磷酸( n l d p ) 在其中起到非 常重要的作用：t h d p 阴离子先是攻击一分子丙酮酸形成乳酰t h d p ( 1 a c t y l t h d p ) ，继 而脱羧形成羟乙基硫胺素二磷酸烯胺( h e n l d p ) ，然后再攻击另一分子丙酮酸或一分子 2 酮丁酸形成乙酰羟酸中间体( a h a t h d p ) ，最后释放出产物乙酰乳酸或乙酰羟丁酸。 具体如图1 2 所示： 旷“h l 恒 一、贮湖一 h o 。宁一c h a t h d p e - a h a 丁h d p a 协b c r a t e o r a c e t o t l y d r o x y b u t y r a t e 图1 2 a h a s 催化反应机制( 引自c h i p m a ne t a l 2 0 0 5 ) f 唔1 2a h a sr e a c t i o nm e c h a n i s m 根据1 h - n m r 分析反应中间体的分布规律得知，乳酰t h d p 中间体的形成是限速步 骤，而后续其它步骤的反应速率常数都要大许多。因此尽管a h a s 偏好2 二酮丁酸作为 其第二底物( 见下) ，但因为h e t h d p 与第二底物的缩合反应并非限速步骤，故第二底 物无论是丙酮酸还是2 酮丁酸并不影响a h a s 催化反应的速率，a h a s 催化反应的速率 取决于丙酮酸和2 酮丁酸的浓度。 3 dn k 卅l iii怙确1 5 1 b0 o 人 h 张泉浙江大学硕士学位论文 a h a s 偏好2 - 酮丁酸作为其第二底物是一个具有生理重要性的性质，这种底物偏好 性可以用专一性常数r 来表示： ( 2 一酮丁酸生成速率) 尼：么! 圣墼塾墼生盛垄垩2 一 【2 一酮丁酸】 【丙酮酸】 专一性常数r 可以由一系列不同浓度的2 酮丁酸和丙酮酸竞争反应实验求得。r 值 为触n s 的特征参数，添加支链氨基酸抑制剂、改变底物2 酮丁酸浓度或p h 值均不会 影响此常数( g o l l o pe l a l l 9 8 9 ；g o l l o p e t a 1 9 9 0 ；b a r a k e t a l l 9 8 7 ) 。不同的物种或同一物 种中不同的a h a s 同工酶的r 值可能不同，如肠细菌中，同工酶i 、i i 和i 的r 值分 别为1 、1 8 5 和5 3 ( m c c o u r ta n dd u g g l e b y2 0 0 6 ) ；酿酒酵母( & c e r e v i s i a e ) 中唯一的 a h a s 的r 值为3 0 ( g o l l o pe t a l l 9 8 9 ) ，大麦中一种a h a s 同工酶的r 值为1 0 ( d e l f o u m e 甜a 1 9 9 4 ) 。在正常生理条件下，细胞内丙酮酸的浓度要比2 酮丁酸浓度高出许多，因 此，为了保障所有三种支链氨基酸的合成就要求有较高的r 值，此外细胞中具有不同r 值的a l i a s 同工酶可以适应不同的生长条件，后者对于细菌尤为重要。 1 1 2 2a h a s 的抑制动力学特征 a h a s 除草剂对酶的抑制程度是随着时间的增加而逐渐增大的，即所谓的“慢速结 合抑制”( l a r o s s a a n ds c h l o s s l 9 8 4 ：r a y l 9 8 4 ；m u h i t c h e t a l l 9 8 7 ；c h a n g a n d d u g g l e b y 1 9 9 7 ) 。从动力学角度分析，慢速结合抑制现象可以分为两个阶段，首先a h a s ( e ) 与除草剂( i ) 快速形成一个结合力相对较弱的初始复合体( e i ) ，由于除草剂的结合， a h a s 的构象发生变化，复合体继而转变成一个结合得更牢固的紧密复合体( e i ) 。 除草剂对a h a s 活性的抑制大小、酶变构的速率均与除草剂的浓度有很大的关系。 k i e + i = e i 亭e i ：l ： 图1 3 除草剂与a h a s 的两步反应。e ：酶：i ：除草剂；e l ：初始复合体；e l * ：紧密复合体 f i g1 3r e a c t i o ns c h e m eo f e n z y m ei n h i b i t i o no f t w o - s t e ps l o w - b i n d i n gi n h i b i t o r s 实验表明，当甲嘧磺隆与a l i a s 作用时，与a h a s 结合的紧密程度与丙酮酸有很 大的关系。如果把a l i a s 与丙酮酸、除草剂混合预先保温，则当把酶从除草剂溶液中重 新取出时，其活力很难恢复：而如果在保温阶段不加丙酮酸，则a l i a s 的活力可很快恢 复。除草剂在与已经结合了丙酮酸的a h a s 作用时，其结合力要比与未结合丙酮酸的 4 张泉浙扛大学硕士学位论文 a h a s 作用时更强，这可能表明丙酮酸分子的存在使得酶更容易变构，进而与除草剂形 成紧密复合体( e i + ) ( l a r o s s aa n ds c h l o s s1 9 8 4 ) 。 磺酰脲类除草剂对a h a s 的抑制作用属于非竞争性抑制，而咪唑啉酮类除草剂对 a h a s 的抑制作用属于反竞争性抑制( c h a n ga n dd u g g l e b y1 9 9 7 ) ，由于两类除草剂的结 构不同，所以它们与酶结合的位点应该是不同的。另外一些实验表明，磺酰脲类除草剂 与咪唑啉酮类除草剂与a h a s 结合时是互斥的( d u m e re ta l1 9 9 1 ；s e h l o s se ta l1 9 8 8 ： l a n d s t e i n e t a l1 9 9 3 ；s h a n e r e t a l1 9 9 0 ) ，即a h a s 只能结合一种除草剂。从已经解析的 拟南芥晶体结构分析，磺酰脲类除草剂与咪唑啉酮类除草剂与a h a s 催化亚基的结合位 点存在部分重叠( 参见1 1 3 3 ) 。 除草剂对酶的抑制作用是否可逆目前一直存在争议。有报道称，用凝胶过滤法和透 析法，能够使除草剂分子缓慢但完全的与酶分离( m u h i t c he ta l1 9 8 7 ；l a r o s s ae ta l1 9 8 4 ； d u l l l c r e l a l1 9 9 1 ：s c h l o s se t a l1 9 8 8 ) ，而当除草剂分子被移走的时候，酶的活力恢复情 况也不一样，有的则完全失活。 1 1 2 3 负反馈调节 a h a s 在支链氨基酸合成过程中起着非常重要的作用，为了保证氨基酸的平衡供 应，a l i a s 在细胞内的表达和其活力都受到了严格而复杂的控制，终产物反馈抑制作用 就是其中的一个重要的机制。 除了少数细菌a l i a s 例外，a h a s 同工酶的活力均能被至少一种支链氨基酸所抑 制。在细菌( u m b a r g e ra n db r o w n1 9 5 8 ；a r f i na n dk o z i e l l1 9 7 3 ；b a r a ke ta l1 9 8 8 ；p r o t e a u a n ds i l v e r1 9 9 1 ；y a n ga n dk i m1 9 9 3 ) ，真菌( m a g e ea n dd er o b i c h o n s z u l m a j s t e r1 9 6 8 b ； g l a t z e re la l1 9 7 2 ；t a k e n a k aa n dk u w a n a1 9 7 2 ；p a n ga n dd u g g l e b y1 9 9 9 ) ，和藻类( o d ae la l 1 9 8 2 ；l a n d s t e i ne la l1 9 9 3 ) 中缬氨酸对a h a s 抑制作用最强，其墨值从4 4 9 m 到1 4m m 不等。不过在高等植物中，亮氨酸对a h a s 的抑制作用或与缬氨酸相等，或比缬氨酸更 强些( m i f l i n1 9 7 1 ；d u r n g ra n db 6 9 e r1 9 8 8 ；s m g he la l1 9 8 8 ；s o u t h a na n dc o p e l a n d1 9 9 6 ) 。 添加2 - 3 种支链氨基酸对a h a s 的抑制作用要比任一支链氨基酸对a h a s 的抑制作用 都要大，即存在协同抑制现象。这可能与a l i a s 调节亚基上存在两个支链氨基酸的结合 位点有关( l e ea n dd u g g l e b y2 0 0 2 ) 。 需要指出的是，真核生物中a h a s 比较不稳定，在纯化a h a s 的过程中，经常会 5 张泉浙江大学硕士学位论文 造成调节亚基的丢失，以致其对支链氨基酸的反馈抑制作用不敏感。 1 1 3a h a s 的结构 迄今，绝大多数做过特征化研究的a h a s 均由催化亚基( = 6 5 k d a ) 和调节亚基( 9 - 4 5 k d a ) 组成，酶活性中心处于催化亚基二聚体界面，调节亚基赋予酶的负反馈调节特性。 2 0 0 2 年p a n ge ta l 首次报道了酵母a h a s 催化亚基的晶体结构，最近m c c o u r te ta l ( 2 0 0 6 ) 报道了拟南芥a h a s 催化亚基的晶体结构，k a p l u n e t a l ( 2 0 0 6 ) 报道了大肠杆菌a h a s i i i 调节亚基的晶体结构。 1 1 3 1 细菌a h a s 肠细菌中至少存在三种具不同反应动力学、底物专一性和负反馈特性的f a d 依赖 型a h a s 同工酶，分别为a h a s i 、a h a s i i 与a h a s i i i ，其催化亚基的氨基酸序列同源 性大于4 0 。在绝大多数细菌中，编码调节亚基和相应的催化亚基的基因排列在同一个 操纵子上( e o y a n ga n ds i l v e r m a n1 9 8 4 ；s c h l o s se ta l1 9 8 5 ；b a r a ke t 耐1 9 8 8 ) 。a h a s i i 不受 终产物反馈抑制作用。那些仅含一个a h a s 基因的细菌，其a h a s 性质与肠细菌的 a h a s i i i 类似。 大肠杆菌a h a s i i i 的催化亚基只有很低的酶活力( 5 ) ，但与a h a s i i i 全酶具 有相似的底物特异性、辅因子依赖性及除草剂的抑制作用。催化皿基不结合缬氨酸，对 缬氨酸不敏感。调节亚基虽然能结合缬氨酸，但是其结合力比全酶弱得多。将催化亚基 与调节亚基体外重组可获得与天然酶性质相同的全酶( 啦p 2 ；1 5 0 1 6 0k d a ) ( v y a z m e n s k y e t 甜1 9 9 6 ) 。对肠细菌a h a s i 和a h a s i i 的研究也表明a h a s 全酶是由2 个催化亚基 与2 个调节亚基组成，即呈n 2 d 2 结构。 值得一提的是，不同来源的催化、调节亚基重组成全酶后，丧失了对缬氨酸的敏感 性。 1 1 3 。2 真核a h a s 植物中编码a h a s 的基因拷贝数从一个至多个。例如，拟南芥和苍耳为1 个；烟草 和玉米为2 个；油菜5 个；棉花6 个。 酿滔酵母的晶体结构显示其为二聚体( p a n ge t a l 2 0 0 2 ) 。活性位点位于二聚体的界 6 张泉浙江大学硕士学位论文 面上，位置紧邻由点突变所推测出的除草剂结合位点。单体的结构与过氧化物酶( p o x ) 等其他t h d p 依赖型酶相似，由f t 、b 、t 三个结构域组成。 m c c o u r t 等( 2 0 0 6 ) 得到了拟南芥a h a s 的晶体衍射图案，为一四聚体结构，a h a s 的活性位点在两个单体的相邻的界面上，每一个单体均由、p 、丫三个结构域组成。与 其他t h d p 依赖型酶类不同的是，在除草剂a h a s 复合体中，还观测到了一条c 末端 的尾巴。 a h a s 晶体结构的得出，有助于在分子水平上更好的