（生物化学与分子生物学专业论文）肌球蛋白轻链激酶n端删除载体的构建.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除r 文r f l 特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 互垒照 签字日期：之! 年月旦日 肌球蛋白轻链激酶n 端删除载体的构建 研究生：于守鹏 指导教师：高颖教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘要 目的：平滑肌在体内分布十分广泛，对维持许多生理功能起着非 常重要的作用，其收缩机制非常复杂。肌球蛋白轻链激酶( m y o s i nl i g h t c h a i nk i n a s e ，m l c k ) 在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用，具 有激酶活性和非激酶活性。通常认为c a 2 + 和钙调蛋白( c a l m o d u l i n ，c a m ) 结合后，激活肌球蛋白轻链激酶( m y o s i nl i 曲tc h a i nk i n a s e ，m l c k ) 进 而使肌球蛋白2 0 k d a 轻链( m y o s i nl i g h tc h a i n s ，m l c 2 0 ) 1 9 位丝氨酸 磷酸化，从而激活肌球蛋白头部的a t p 酶活性，使m 9 2 + a t p 分解， 由此产生的磷酸基结合于横桥使其处于高自由能状态，启动横桥循环， 使粗、细肌丝相互滑动，最终导致肌肉收缩。然而，目前对于c a 2 + 降 至静息水平后平滑肌仍维持一定程度的张力以及在无钙钙调蛋白存 在时仍可观察到肌肉收缩的现象难以解释。近年来，关于平滑肌收缩 的非钙依赖性调节已成为该领域研究的热点。为研究其形态功能与生 物学活性变化，本文拟采用p c r 方法删除n 端1 4 1 个氨基酸序列( 即 肌动蛋白结合区域) ，构建p c o l d m l c k i 4 1 重组质粒，为进一步研 究肌动蛋白结合域的结构和功能奠定基础。 方法：以构建的重组质粒p c o l d 1 5 5 为模板，根据其核苷酸序列 设计一含有n d ei 酶切位点p c r 引物，用d n a 聚合酶进行p c r 扩增。 将扩增片段进行n d ei e c o ri 双酶切，产物行琼脂糖凝胶电泳回收得 到目的基因。将目的基因与载体连接，转化至大肠杆菌。筛选阳性克 隆，并以此为模板，进行p c r 扩增鉴定。对阳性克隆进行测序。 结果： 1 以重组质粒p c o l d 1 5 5 为模板，经p c r 扩增后得到约3 4 k b 的扩增片段，该片段大小与预期的一致。用n d ei 和e c o ri 双酶切， 产物经琼脂糖凝胶电泳，得到一分子量约3 4 k b 大小的片段。回收得到 m l c k 目的基因。 2 用n d ei 和e c o ri 双酶切重组质粒p c o l d1 1 5 5 ，琼脂糖凝胶电 泳显示得到约4 4 k b 载体和约3 5 k b 的m l c k 片段。与预期分子大小 一致。回收载体片段。用d n a 连接酶将目的基因与载体片段连接，转 化至e c o l ij m l 0 9 。细菌培养过夜，提取质粒，筛选阳性克隆。经测序 证实m l c k 的n 端4 1 个氨基酸序列己被成功删除。 结论：在本研究中，成功地将牛胃平滑肌m l c k 的n 端4 1 个氨 基酸序列进行了删除，构建了牛胃平滑肌p c o l d 1 5 5 d 4 1 重组载体。本 实验为进一步研究平滑肌收缩调节的分子机制提供一定的实验基础。 关键词平滑肌收缩肌球蛋白轻链激酶肌球蛋白肌动蛋白 c l o n i n go fd e l e t i o nm u t a t e dn - t e r m i n u sc d n a o fm y o s i n l i g h tc h a i nk i n a s e m a s t e rd e g r e ec a n d i d a t e ：y us h o up e n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rg a oy i n g m a j o r ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y a b s t r a c t p u r p o s e si t i sv e r ye x t e n s w et h a tt h es m o o t hm u s c l ei sd i s t r i b u t e di n c a r r y i n g ，p l a yav e r yi m p o r t a n tr o l ei nm a i n t a i n i n gal o to fp h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s ，b u t i t sc o n t r a c t i o nm e c h a n i s mi s v e r yc o m p l i c a t e d t h e w e l l e s t a b l i s h e dm o d ef o rt h er e g u l a t i o no fs m o o t hm u s c l ec o n t r a c t i o ni s ： c a ”f o r mac o m p l e xw i t hc a l m o d u l i n ( c a m ) ，t h ec o m p l e xa c t i v a t e sm y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e ( m l c k ) t op h o s p h o r y l a t e 2 0 k d a m y o s i nl i g h t c h a i n ( m l c 2 0 ) a ts e r l 9t oa c t i v a t e m y o s i na t p a s ea c t i v i t y ，a n dt h e i n o r g a n i cp h o s p h a t er e s u l t i n gf r o mm 9 2 + 一a t ph y d r o l y z e db ya c t i v a t i e d m y o s i nm g + - a t p a s eb i n d sw i t hc r o s s b r i d g et oi n c r e a s e i t sg i b b sf r e e e n e r g y , w i c hi n i t i a t e sc y c l i cc r o s s - - b r i d g e a c t i n i n t e r a c t i o n sa n d s l i d i n g b e t w e e nt h i c kf i l a m e n t sa n dt h i nf i l a m e n t sf o l l o w e db ys m o o t hm u s c l e c o n t r a c t i o n h o w e v e r ，s m o o t hm u s c l er e m a i n st e n s i o na tr e s t i n gc y t o s o l i c f r e ec a z + c o n c e n t r a t i o na n di t sc o n t r a c t i o nc a nb ed e t e c t e di nt h ea b s e n c eo f c a 2 + c a m ，t h er e a s o nf o rt h i sp h e n o m e n o ni su n k n o w nw e l l m y o s i n1 i g h t c h a i nk i n a s eo fs m o o t hm u s c l e ( s mm l c k ) p l a y sa l l i m p o r t a n t r o l ei n r e g u l a t i n gs m o o t hm u s c l ec o n t r a c t i o na sak e ye n z y m ew i t hk i n a s ea c t i v i t y a sw e l la sn o n k i n a s ea c t i v i t y i nr e c e n ty e a r s ，p e o p l eh a v ev e r yi n t e r i s t i n g r e s e a r c h i n g a b o u tt h ec o n t r a c t i o no fs m o o t hm u s c l en o n c a l c i u m d e p e n d e n c ea d j u s t m e n t i no r d e rt of u r t h e rs t u d yi t sf u n c t i o na n dt h eb i o l o g y a c t i v i t yc h a n g e ，t h i sa r t i c l em a k e su s eo ft h ed e l e t i o nm u t a t ea n de s t a b l i s ha m o d e ls m o o t hm u s c l en 几c kp a r t i a la m i n oa c i d s s e q u e n c ef l a w , t h e r e c o m b i n a n to fm l c k f r a g m e n tn e e d st ob ec l o n e da n de x p r e s s e d m e t h o d sw ed e s i g nf o r w a r dp r i m e r la n dr e v e r s ep r i m e r 2b a s e do n t h es e q u e n c eo fp c o l d 15 5 ，t oa m p l i f yt h eg e n eb yp o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( p c r ) t h ep c ra m p l i f i c a t i o nb ed o u b l ed e g e s t e db yr e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e sn d ei e c o ria n d p u r i f i e d t h e p r o d u c t a si n s e r t f r a g m e n t t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp c o l di b s15 5b ed o u b l ed e g e s t e db y n d ei e c o ria n dp u r i f i e dt oo b t a i nv e c t o rf r a g r n e n t t h ei n s e r tf r a g m e n t a n dv e c t o r f r a g m e n tw e r el i g a t e db yt a k a r ad n al i g a t i o n k i ta n d a m p l i f y i e db yp c r ，t h ep r o d u c tw a st r a n s f o r m e di n t oc o m p e t e n t r e s u l t s 1 t h ei n s e r tf r a g m e n tw i t hn d ei e c o ris i t ew a sa m p l i f i e df r o mp c o l d 15 5c d n ab yp o t y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n t a k er e c o m b i n a n tp l a s m i dp c o l d i b s15 5a st h et e m p l a t e ，d e s i g n sp a i ro fp c rp r i m e r s a c c o r d i n gt oi t s n u c l e o t i d es e q u e n c ea n dn d eis i t ew a sa d d e dt o5 e n d o fu p s t r e a m p r i m e r t h eg e n ew a sa m p l i f i e db yt a k a r ap y r o b e s t t md n ap o l y m e r a s e t a k a r aw i t hh i g h - f i d e l i t y 2 t h eo b t a i n i n go fi n s e r tf r a g m e n ta n dv e c t o rf r a g m e n t m a k i n gu s eo fr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s en d ei e c o rid o u b l ed e g e s t s t h eg e n ew i t hi n s e r tf r a g m e n ta n dr e c o m b i n a n tp l a s m i dp c o l di b s15 5 ，w e o b t a i ni n s e r t f r a g m e n t a n dv e c t o r f r a g m e n tr e s p e c t i v e l y r e c l a i m e da n d p u r i f i e d t h ef r a g m e n t sw e r ea n a l y s e de l e c t r o p h o r e s i sb yl a g a r o s e 3 t h es c r e e n i n ga n di d e n t i f i c a t i o n go f e x p r e s s i o np l a s m i d t h ei n s e r tf r a g m e n ta n dt h ev e c t o rf r a g m e n tw e r el i g a t e db yt a k a r a d n a l i g a t i o nk i ta n dt r a n s f o r m e di n t oe c o l ij m 10 9c o m p e t e n tc e l l s a f t e r t h e e x p r e s s i o ng e n ew a sa m p l i f i e db yp c r ，r e c o m b i n a n tp l a s m i dw a s c o n f i r m e de l e c t r o p h o r e s i sb y1 a g a r o s ea n de d n a s e q u e n c e d t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h e12 3n u c l e o t i d e ss e q u e n c eo ft r a n s l a t i o nb e g i n n i n gh a sb e e n d e l e t e d c o n c l u s i o ni nt h i ss t u d y , w es u c c e s s f u l l yh a v ed e l e t e dn - t e r m i n u s 12 3n u c l e o t i d e ss e q u e n c eo fc d n ab o v i n es t o m a c hs m o o t hm u s c l em l c k ， c o n s t r u c t e db o v i n es t o m a c hm l c k1 - 4 1a m i n oa c i ds e q u e n c ed e l e t i o n m u t a n tv e c t o r t h i s e x p e r i m e n t f o rf u r t h e rs t u d i e st h ec o n t r a c t i o n a d j u s t m e n tm o l e c u l a rm e c h a n i s mo fs m o o t hm u s c l et op r o v i d et h ec e r t a i n r a t i o n a l e k e yw o r d s ：m y o s i nl i g h t c h a i n k i n a s e ( m l c k ) ；s m o o t hm u s c l e c o n t r a c t i o n ；m y o s i n ；a c t i n 4 肌球蛋白轻链激酶n 端删除载体的构建 硕士研究生：于守鹏 指导教师：高 颖教授 专业名称：生物化学与分子生物学 前言 平滑肌具有多种独特的功能和复杂的调节机制，其细胞内存在着多 种收缩蛋白，如肌球蛋白( m y o s i n ) ，肌动蛋白( a c t i n ) 和原肌球蛋白 ( t r o p o m y o s i n ) ，还有许多调节蛋白，如肌球蛋白轻链激酶( m y o s i n l i g h t c h a i nk i n a s e ，m l c k ) ，钙调蛋白( c a l m o d u l i n ，c a m ) 和肌球蛋白轻链 磷酸酶( m y o s i nl i g h tc h a i np h o s p h a t a s e ，m l c p ) 等。其中肌球蛋白轻链激 酶( m y o s i nl i g h tc h a i nk i n a s e ，m l c k ) 起着非常重要的作用。 研究表明，m l c k 的分子结构主要含有一个激酶活性结构，该区域 位于激酶的中心部位。m l c k 的n 末端有肌动蛋白结合的部位；c 末端有 与肌球蛋白结合的区域【6 。7 】。此外，还有与钙钙调蛋白复合物结合的部位。 传统观点认为平滑肌收缩与舒张的主要调节机制是在c a 2 十的参与下，由 m l c k 催化2 0 k d 肌球蛋白轻链( m l c 2 0 ) 磷酸化，从而促进肌球蛋白与 肌动蛋白之间的相互作用而引起收缩。该学说认为平滑肌的收缩依赖于 细胞内 c a 2 + 1 i 的升高和随之产生的m l c 2 0 磷酸化 1 4 1 。 但这一学说并不能全面解释平滑肌收缩活动的特点。在生理条件 下，细胞内 c a 2 + 1 i 的升高和m l c 2 0 钙依赖性磷酸化都是瞬间发生的。 当细胞内 c a 2 + i 降至静息水平后，根据钙依赖性调节学说，平滑肌应随 之松弛。但实际上某些部位的平滑肌特别是括约肌和血管平滑肌并未松 弛，而是继续维持一定的张力。这种低c a 2 + 水平时平滑肌张力持续状 态( 1 a t c hs t a t e ) 或紧张性收缩( t o n i cc o n t r a c t i o n ) 可使器官对抗所加负荷而 保持原有形状，具有重要生理意义睁1 0 j 。这一现象提示在平滑肌收缩过 程中还存在着其它调节途径【1 1 - 1 3 1 。一些学者的研究表明平滑肌的收缩可 不依赖于m l c 的磷酸化【8 10 1 。m l c k 具有激酶和菲激酶活性，可直接激 活非磷酸化肌球蛋白a t p 酶的活性。为了进一步探寻m l c kn 末端肌动 蛋白结合域的结构和功能及调节机制，我们利用分子生物学技术，将 m l c k 的c d n a 的n 端部分核苷酸进行删除，构建了牛胃平滑肌m l c k l 一4 l 位氨基酸序列删除载体。该研究将为进一步研究m l c k i n 节平滑肌 收缩的分子机制提供定的实验基础。 材料和方法 一、材料 ( 一) 重组质粒p c o l d l b o v i n es t o m a c h15 5 km l c k 由m l c k 全长通 过n d e i 和e c o r i 酶切位点构建到p c o l d 载体中( 以下简称p c o l d 1 5 5 ) 由日本群马人学k o h a m a 教授惠赠。p c o l d 质粒图谱及多克隆位点见 f i gl ；m l c k 结构见f i g2 ；m l c k 删除部分见f i g3 ；本研究构建载体 的过稃如f i g4 所示。 p o ： i ”“：“4 “”“”。 i t e h t 8gf x a i f 4 l o 州 t - i ” 蛾女虚t “r 埘i e ；碥a 童稳撼麟童量3 皇蚯强卫艘餐z = 点! 嚣烈 鑫叠! 盘oi 。 “。p 。1 “1 。5 li 巾i_ i # r f 。l骱月ij * m “勘j i f r h l i 盟i 札t 鼎。曲土t 滥喊上t 池量鼬监矗量 “疆l 珏矗i 瓠，刍监i 焦一 l o “舭k 1 一“6i ；“# 8 lg 7 h ，ie _ jn vo o ，h 。m 洲- t - ： ，p d 14 qf 州i ；i 。矗嚣：娑：= ：。，。t ，。，。t t 。；。，。，|i m 肌越 i b 1 c ：c l g c c tf c c g e g g t i f tt t t1 1 1 t 邢蚺。 i j n h - 日 _ _ mri f i 9 1 t h em a pa n dm u l t i p l ec l o n i n gs i t e so f p c o l dp l a s m i d c a mb i n d i n g 2 6 4 2 c a mb i n d i n g 1 0 0 21 0 2 2 i 圜 睦蚤矗鞋巍l 虢撼善j l | | t e l 。k i n a c t i n b i n d i n g a c t i n b i n d i n g c a ，c a m s e n s i t i v ec a l c a m i n s e n s i t i v e m y os i n l b i n d i n g f i g2 b o v i n es m o o t hm u s c l em l c kd o m a i ns t r u c t u r e c 1 c c a g c t g c g a g g g c c t c t g t g g c c g a g g a g 3 1 c t g g t g c t g a t g g t g g t g g t g g t g g t g a c g g c t a c g g g a 6 c c t g g g c c t g g c t g g 0 0 g g t g g c g a g a g g 1 0 1 g c a a g g t g c c c c c g c a g a a g a c g a c g g c g a g g a c g t g c g t g g g g t g c t c 刖k g a g g c g c g t g g a g a c a c g g 1 7 i c a g c a c a c g g a g g a g g c c g t t c g c c a g c a g g a g g t g g & g c k g c t g g a c t t c c g c g a c c t c c t g g g c “g a 2 4 1 a g g t g a g c a c c k a g a c c t t g t c t g a a g a g g a c c t g a a g g a g a t c e c a g c c g a g c a g c t g g a c t t c c g c g a 3 1i c c t c c t g g g c a a g a a g g t g a g t a c a a a g a c c t t g t c t g a a g a g g a c c t g a a g g a g a 丁c c c a g c t g a g c a g 3 8 1 a t g g a t t t c c g c g c c a a c c t g c a g c g g c a g g t g a a g c c g a a g a c c c t g t c a g a g g a g g a g a g g a a a g t g c m deb盎ni 。qe曰yee琏工i se eeekyh 4 5 l a t g g c c c c c a g c a g g t g g a c t t c c g c t c t g t c c t a g c c 姐g a a g g g g a c t c c c a a g a c c c c 丁g t g c c t g a 矗eqqydeesyi akk工已 k t pvpe 5 2 1 g a a g g t a c c c c c t c c a a k a c c g g c c a c g c c a g a t t t t c g c t c a g t g t t g g g c a g t a a g a a 址a 1 1 t a c c a k vppp k p a t户dfrs v l gskkk l p 5 9 1 a c a g a g a 盯g g t a g c a a t a a c a c t g a g g c c t t g a a t g c c a a g g c a g c a g a a g g t c t c a a g c c t g t g g g c a t e ngsnnt e a l n akaa e glkp vgn 6 6 1 a t g c c c a g c c t t c a g g g t t c c t g a a a c c c g t g g g c a a c g c c a a g c t g g c t g a t a c c c c c a a a c c c t t g a g aqpsg flk尸vgnkl adtpkpls f i g3 t h ep a r to fn e c l e o t i d es e q u e n c ea n dd e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eo f t h eb o v i n es t o m a c h15 5 k d ap r o t e i ne d n a u n d e r l i n e si n d i c a t et h ea m i n o a c i ds e q u e n c ed e l e t e d 7 f i g4 t h ec o n s t r u c t i o no f d e l e t e dm l c kc d n a i n t op c o l div e c t o r ( 二) 菌株 t o p l 0 f 由日本群马大学k o h a m a 教授惠赠、大肠杆菌j m l 0 9 由 宝生物工程( 火连) 有限公司赠送。 ( 三) 主要试剂 琼脂糖、二硫苏糖醇( d t t ) 、碳酸氢钠、乙二胺四乙酸( e d t a ) 、 苯甲基磺酰氟( p m s f ) 购自s i g m a 公司。 丙烯酰胺、三( 羟甲基) 胺基甲烷( t r i s ) 、f 巯基乙醇( 3 - m e ) 、 溴化乙锭f e b ) 、四甲基乙二胺( t e m e d ) 、二氨基联苯胺( d a b ) 购 自a m r e s c o 公司。 限制性内切酶n d ei 、e o o ri 、d n a 标准分子量、质粒提取试剂 盒f 劢点幺凡口m i n i b e s tp l a s m i dp u r i f i c a t i o nk i tv e r 2 0t a k a r a ) 、扩增试 剂盒( t a r ap y r o b e s “d n ap o l y m e r a s et a k a r ap c r ) 、产物回收试 剂盒( t a k a r aa g a r o s eg e lp u r i f i c a t i o nk i tv e c 2 0t a k a r a ) 购自宝生物 工程( 大连) 有限公司。引物由t a k a r a 公司合成。 ( 四) 仪器 p c r 扩增仪( 宝生物工程有限公司) 核酸电泳仪( 北京六一仪器厂) p h a r m a c i ab i o t e c h 成像系统 空气浴恒温摇床江苏太仓市实验设备场t h z c 型 c r 2 1 e 型日立高速离心机日本曰立公司 c t - 1 2 r 型台式微量高速离心机目本日立公司 二、方法 ( 一) 引物设计 为了便于实验操作，首先根据p c o l di 质粒图谱和要删除的片段设 计e 游引物( 包含n d ei 酶切识别位点) 及下游引物。 p l ：上游引物b s1 5 5 k n d ei 57 - - g g a a t t c 笪巡a a g a c c c c t g t g c c t g a g a a g - 3 7 f 3 4 b a s e s l ，c a t a t g 为n d ei 酶切识别位点。 p 2 ：下游引物p c o l dr 57 c a g a a t c t a a g a t c c c t g c c 3 7 p 3 ：上游引物p c o l df 5 ，一a c g c c a t a t c g c c g aa g g 3 7 ( 二) 模板的获得：提取质粒p c o l d 15 5 ，应用宝生物公司小量质粒提 取试剂盒2 0 ( t a k a r am i n i b e s tp l a s m i dp u r i f i c a t i o nk i tv e r 2 0 ) 。具体 步骤如下： 1 在l b ( a m p + 1 液体培养基中培养含有p c o l d 1 5 5 质粒的细菌。 2 取1 4 毫升的菌液，1 2 0 0 0 9 离心2 m i n ，弃上清。 3 用2 5 0 9 l 的溶液i ( s o l u t i o ni ) 含r n a s e a 充分悬浮细菌沉淀。 4 加入溶液i i ( s o l u t i o ni i ) 2 5 0 p l ，轻轻地上下翻转混合5 6 次 使菌体充分裂解，形成透明溶液。 5 加入4 预冷的溶液i i i ( s o l u t i o ni i i ) 4 0 0 9 l ，轻轻地上下翻转 混合5 6 次，直至形成紧实集块，然后室温静置2 m i n 。 6 室温1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，取上清。 7 将试剂盒中的s p i n c o l u m n ( 离心柱) 安置于收集管( c o l l e c t i o n t u b e ) 上。 8 将上述操作6 的上清液转移至s p i nc o l u m n 中。 9 向s p i nc o l u m n 中加入r n a s e a5 0 0 9 l ，3 6 0 0 9 离心3 0 s ，弃滤液。 1 0 再向s p i nc o l u m n 中加入r n a s e b7 0 0 - t l ，3 6 0 0 9 离心3 0 s 弃滤液。 1 1 重复操作1 0 ，然后1 2 0 0 0 9 再离心l m i n 。 1 2 将s p i nc o l u m n 安置于新的1 5 m l 的离心管上，在s p i nc o l u m n 膜的中央处加入6 0 儿l 的水或沈脱液，室温静置1m i n 。 1 3 1 2 0 0 0 9 离心1 m i n 洗脱d n a ，得到质粒p c o l d 1 5 5 。 ( 三) p c r 反应 以p c o l di b s l 5 5 为模板，以p 1 p 2 为引物，使用d n a 聚合酶 ( 死缸嘏口p y r o b e s ，md n ap o l y m e r a s e ) 进行p c r 扩增。在0 2 m l 反应 管中加入下列成分： p c r 反应体系 10 p y r o b e s tb u f f e r d n t pm i x t u r e ( 各2 5 m m ) p l p 2 t e m p l a t e p y r o b e s t 7 md n ap o l y m e r a s e d d h 2 0 t o t a l 5 0 9 1 在设定好p c r 仪上反应： 9 4 。c 预变性1 m i n 后，9 4 。c 变性3 0 s ，5 54 c 复性4 5 s ，7 2 。c 延伸4 5 s ， 3 0 个循环。最后7 2 延伸6 m i n 。 p c r 产物检测：取5 p l ，用1 琼脂糖凝胶( 含0 5 p g m l 溴化乙锭) 进行琼脂糖凝胶电泳。在3 0 2 n m 波长的紫外灯下观察p c r 产物。 【技术要点】 1 、扩增得到的p c r 产物为平滑末端，如果使用的引物5 端没有 叫叫掣叫叫驯叫叫唧州谢脚 特别进行磷酸基修饰? 此时的p c r 可亩接克隆于平滑末端的载体中， 如果使用去磷酸化载体，p c r 片段必须进行5 磷酸化处理。 2 、d n t pm i x t u r ed h 值应为7 o 9 0 ，其酸性环境下易水解。d n t p 浓度剩高，错配率生高。 3 、引物浓度1 0 p m o l 足够3 0 个循环，浓度太高与模板非特异性结 合增强，扩增非特异片段增多，浓度太低，扩增效率低。 4 、扩增轮数一般3 0 轮以内就可以使模板扩增1 0 6 倍，超过3 0 轮， 错配率升高。 ( 四) p c r 产物回收： 1 琼脂糖凝胶电泳检测后，将p c r 产物琼脂糖凝胶纯化试剂盒 ( t a k a r 日a g a r o s eg e lp u r i f i c a t i o n k i t v e r 2 0 ) 回收。具体操作如下： 1 将p c r 产物行琼脂糖凝胶，在紫外灯下切下目的条带尽量减小 凝胶体积，提高d n a 回收率。动作尽量迅速，不要将d n a 长时间暴 露于紫外灯下，以防止d n a 降解损伤。 2 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1m g = lm l 进行计算。 3 按3 个凝胶体积量向胶块中加入胶块融化液i ( d r ib u f f e r ) 。 4 均匀混合后7 5 。c 加热融化胶块。此时间断振荡混合，使胶块充 分融化( 8 分钟) 。否则将会严重影响d n a 的回收率。 5 向上述胶块融化液中加入d r ib u f f e r 量的l 2 体积量的缓冲液 胶块融化液i i ( d r i ib u f f e r ) ，均匀混合。当分离小于4 0 0b p 的d n a 片段时，应在此溶液中再加入终浓度为2 0 的异丙醇。 6 将试剂盒中的s p i nc o l u m n 插到负压装置的插口上，将 二述操 作步骤7 的溶液转移到s p i nc o l u m n 中，开启调节负压装置，缓慢吸 走s p i nc o l u m n 中的溶液( 流速控制在1 滴秒) 。 7 将负压调至最大，向s p i nc o l u m n 中加入5 0 0m l 的洗涤缓冲液 a ，吸尽s p i nc o l u m n 中溶液。 8 向s p i nc o l u m n 中加入7 0 0m l 的洗涤缓冲液b ，吸尽s p i n c o l u m n 中溶液。 9 重复操作步骤1 0 ，然后从负压装置上取下s p i nc o l u m n ，将其 安置于试剂盒中的收集管上。 1 0 1 2 ，0 0 0 9 离心1 分钟。 11 将s p i nc o l u m n 安置于新的1 5m i 的离心管上，在s p i nc o l u m n 膜的中央处加入2 5m l 洗脱缓冲液( 加热至6 0 ) ，室温静置1 分钟。 1 2 1 2 ，0 0 0 9 离心1 分钟洗脱d n a 。 ( 五) p c r 产物双酶切一目的基因的制备 将p c r 产物用n d ei e c o ri 进行双酶切，取e p 管，加入下列物 质： p c r 回收产物n d ei e c o ri 双酶切反应体系 1 0 x hb u f f e r 4 p ! n d ei2 l l l e c o r i 2 9 l p c r 回收产物 5 p 1 d d h ：o3 7 9 l 3 7 水浴酶切过夜 乙醇沉淀：将酶切产物加2 5 9 l 酚，2 5 9 l 氯仿异戊醇，混匀，1 0 0 0 0 9 离心5 分钟，取上层液，转至另e p 管中，加2 5 倍体积的无水乙醇， 1 1 0 体积的乙酸钠，混匀，2 0 c 沉淀小时，1 0 0 0 0 9 离心1 0 分钟， 弃上清，7 0 乙醇洗一次，干燥，加2 0 9 l 保存液，此产物即为插入片段。 酶切产物检测：取l “l ，用1 琼脂糖凝胶( 含o 5 p g m l 溴化乙锭) 进行琼脂糖凝胶电泳。在3 0 2 n m 波长的紫外灯下观察酶切产物。 【技术要点】 l 、无底物豹内切酶在室温下会很快失活，必须保持在冰浴中。 2 、e c o r i 有s t a r 活性，高甘油浓度、m n 2 十存在、低离子强 度条件下，识别序列会发生变化。 3 、n d ei 酶切出的突出末端，比一般的2 个碱基突出末端的 连接效率低须使用平滑末端的连接条件。 4 、内切酶的用量不能超过反应体积的1 1 0 ，否则酶中的甘油会影 响酶切反应。 5 、d n a 制品中的污染( 如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、e d t a 、s d s 、 高盐浓度等) 均能抑制内切酶活性。 ( 六) 载体片段的制备一质粒p c o i d 1 1 5 5 双酶切 将( 二) 中提取的质粒p c o l d 1 5 5 用n d e i e c o ri 进行双 酶切，取e p p e n d o r f 管，加入下列物质： p c o l d i b s15 5n d ef e c o ri 双酶切反应体系 1 0 hb u f f e r n d e i e c o r i p c o l du b s l 5 5 d d h 2 0 4 0 1 2 f l 2 1 x l 5 0 1 3 7 n l 5 0 1 a l t o t a l 3 7 。c 水浴酶切过夜。 酶切产物取5 山进行琼脂糖凝胶电泳。用d n a 凝胶回收试剂盒 ( t a k a r aa g a r o s eg e lp u r i f i c a t i o nk i tv e r 2 o ) 回收载体。具体步骤同 ( 五) 。取1 u l 进行琼脂糖凝胶电泳。 ( q z ) 插入片段与载体的连接与转化 双酶切后获得的目的基因和载体片段用d n a 连接试剂盒( t 擞a i h d n a l i g a t i o nk i t 中的s o l u t i o ni ) 进行连接。连接反应体系如下： 插入片段 5 1 t l p c o i d i l 川 s o l u t i o i li 6 0 1 t o t a l 1 2 0 1 1 6 ，3 0 m i n 。 将连接产物应用c a c l 2 法转化至感受态大肠杆菌j m l 0 9 ( e c o l i c o m p e t e n tc e l lj m l 0 9 ) 中。具体方法如下： 1 宿主菌e c o l ij m l 0 9 接种于2 0 m l l b 中培养过夜。 2 部分上述菌液移至5 0 m l l b 三角烧瓶中，3 7 3 0 0 r r a i n 震荡培养2 3 h ，使细菌浓度达到5 x 1 0 7 个细菌m l 。此时，细菌o d 6 0 0 。 一般在0 2 0 3 之间，为对数生长期或对数生长前期。 3 培养物于冰上放置1 0 m i n ，然后转移至5 0 m l 离心管中， 4