（生物化学与分子生物学专业论文）植物psba基因的适应性进化分析.pdf

中文摘要 植物p s b a 基因的适应性进化分析 专业：生物化学与分子生物学 硕士生：陈晓霞 指导教师：苏应娟副教授 中文摘要 p s b a 是叶绿体基因组中重要的光合作用基因，其编码产物d 1 蛋白是光系 统i i 反应中心的两个核心蛋白之一，对维持p s i i 反应中心构象的稳定、原初电 荷的分离以及电子的传递至关重要，所以在植物的光合作用中发挥着重要作用。 p s 6 a 不仅是编码p si i 组分的1 4 个叶绿体基因中被最先分离、克隆和鉴定的基 因，而且也被研究得最多。这些研究多集中于p s b a 基因的克隆、测序、定位及 序列结构、密码子使用特性、表达调控及d l 蛋白的光抑制现象等方面，而适应 性进化分析则还未见有文章报道。 在基因水平进行适应性进化检测，进而识别重要的氨基酸结构和功能位 点，除了有助于揭示生物的进化历程，还能加深对基因结构和功能变异的理解。 本研究采用机理式模型( m e c h a n i s t i cm o d e l ) 、m e c 模型( m e c h a n i s t i c e m p i r i c a l c o m b i n a t i o n m o d e l ) 以及d a t a m o n k e y ，分别研究p s b a 基因在苔藓植物细鳞苔科 以及在植物界的适应性进化。 细鳞苔科( l e j e u n e a c e a e ) 是现存苔类植物中物种最丰富的科，其物种丰富 的原因可能与被子植物的协同进化有关。对其进行适应性进化分析，不仅可以 深入理解细鳞苔科辐射式物种分化的分子适应机制，而且还可以探讨叶绿体单 拷贝基因是否存在适应性进化。结果显示，细鳞苔科的p s b a 基因序列未检测到 统计上显著的正选择位点，说明负选择对其起主导作用。研究结果支持叶绿体 d n a 编码的单拷贝基因不发生适应性进化的观点。另外，基于u c l d 分子钟 估算出的细鳞苔科各分支的分歧时间表明，该科物种丰富度的辐射式增长发生 在新生代渐新世。因此，和蕨类植物一样，细鳞苔科是在被子植物兴起后也能 产生物种分化的另一个例证。 本文还通过选取藻类、苔藓、蕨类、裸子以及被子植物的代表物种，研究 中文摘要 p s b a 基因在植物界的适应性进化。同样地，分析结果均未检测到统计上显著的 正选择位点，负选择在植物p s b a 基因的进化过程中居主导地位。根据进化经典 理论可推断p s b a 基因由于比较古老，无论对低等的植物还是高等的植物而言都 在光合作用中扮演着不可缺少的角色，已经基本趋于稳定。强烈的负选择压力 有助于维持p s b a 基因功能与结构的稳定。这些结果对认识叶绿体基因的分子进 化具重要价值。 关键词：细鳞苔科；p s b a 基因；分歧时间；正选择；负选择 a d a p t i v e e v o l u t i o n a n a l y s i so f t h e p s b a g c ni np l a n t w e n e n m a j o r ：b i o c h e m i s t r y & m o l e c u l a rb i o l o g y n a m e ：c h e nx i a o x i a s u p e r v i s o r ：s uy i n g j u a n a s s o c i a t ep r o f e s s o r a bs t r a c t t h ep s b ag e n e w h i c he n c o d e sd 1p r o t e i n ，i sam a j o rp h o t o s y n t h e s i sg e n ei n c h l o r o p l a s tg e n o m e t h ed 1p r o t e i ni so n eo ft h et w oc o r ep r o t e i n si np h o t o s y s t e m i ir e a c t i o nc e n t e r w h i c hp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei np h o t o s y n t h e s i s a m o n gt h e14 c h l o r o p l a s tg e n e so fp h o t o s y s t e mi ir e a c t i o nc e n t e r , t h ep s b ag e n ew a sn o to n l y t h e f i r s tt ob ec l o n e d ，s e p a r a t e da n di d e n t i f i e d ，b u ta l s ob es t u d i e dm o s t t h e s es t u d i e s f o c u so nc l o n i n g ，s e q u e n c i n g ，p o s i t i o n ，s t r u c t u r e ，c h a r a c t e r i s t i c so fc o d o nu s a g e ， e x p r e s s i o nr e g u l a t i o na n dp h o t o i n h i b i t i o np h e n o m e n o no f d1 p r o t e i n ，e t c h o w e v e r , t h e r ew a sn o tr e p o r t e do na d a p t i v ee v o l u t i o na n a l y s i so f t h ep s b ag e n e i tc a l ln o to n l yr e v e a lt h ee v o l u t i o n a r yp r o c e s s ，b u t a l s o d e e p e n o u r u n d e r s t a n d i n go nt h ev a r i a t i o no ft h eg e n es t r u c t u r ea n df u n c t i o nb yd e t e c t i n gt h e a d a p t i v ee v o l u t i o no fg e n ea n di d e n t i f y i n g s i t e so ft h ea m i n oa c i d s t h i ss t u d y t h ei m p o r t a n ts t r u c t u r a la n df u n c t i o n a l u s e dt h em e c h a n i s t i cm o d e l ，t h e m e c h a n i s t i c e m p i r i c a lc o m b i n a t i o n ( m e c ) m o d e la n dd a t a m o n k e y t oe x a m i nt h e e v o l u t i o n a r yp a t t e r n so ft h ep s b ag e n ei nl e j e u n e a c e a ea n d s o m eo t h e rp l a n tg r o u p s l e j e u n e a c e a e i st h em o s t s p e c i e s r i c hf a m i l y o fl i v e r w o r t s i t ss p e c m s a b u n d a n c em a yb ee x p l a i n e db yc o e v o l u t i o nw i t ha n g i o s p e r m s b yt h ea d a p t i v e e v o l u t i o na n a l y s i so ft h ep s b ag e n ei nl e j e u n e a c e a e ，w ec a nf u r t h e ru n d e r s t a n dt h e m o l e c u l a ra d a p t a t i o nr e l a t e dt ol e j e u n e a c e a er a d i a t i o n ，a n dt op r o v i d em o l e c u l a r e v i d e n c ea st ot h a tw h e t h e ro rn o tt h e r ei sa d a p t i v ee v o l u t i o ni nt h es i n g l e 。c o p yg e n e o fc h l o r o p l a s t o u rr e s u l t ss h o w e dt h a tn os i g n i f i c a n ts i t e sw e r eu n d e r g o i n gp o s i t i v e i i i 英文摘罄 s e l e c t i o n ，a n dn e g a t i v es e l e c t i o nh a sp l a y e dad o m i n a n tr o l ed u r i n gt h ee v o l u t i o no f t h ep s b ag e n ei nl e j e u n e a c e a e ，w h i c hs u p p o r t e dt h ev i e w p o i n tt h a tt h e r ei sn o a d a p t i v ee v o l u t i o ni ns i n g l e - c o p yg e n ee n c o d e db yc h l o r o p l a s td n a m o r e o v e r , t h e p h y l o g e n e t i ct r e er e c o n s t r u c t e db yu n c o r r e l a t e dl o g n o r m a ld i s t r i b u t e dr e l a x e dc l o c k m o d e ls h o w e dt h a t l e j e u n e a c e a e r a d i a t i o n so c c u r r e d d u r i n g t h e o l i g o c e n e t h e r e f o r e ，j u s tl i k ef e r n s ，l e j e u n e a e e a ea l s oc o u l db ed i v e r s i f i e d a st h er i s eo f a n g i o s p e r m s t h i ss t u d ya l s o s e l e c t e dt h er e p r e s e n t a t i v es p e c i e so fa l g a e ，m o s s e s ，f e r n s ， g y m n o s p e r m sa n da n g i o s p e r m st ou n d e r s t a n dt h ea d a p t i v ee v o l u t i o no ft h ep s b a g e n ei np l a n t s i m i l a r l y , t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn os i g n i f i c a n ts i t e sw e r eu n d e r g o i n g p o s i t i v es e l e c t i o n ，a n dn e g a t i v es e l e c t i o nh a sp l a y e dad o m i n a n tr o l ed u r i n gt h e e v o l u t i o no ft h ep s b ag e n ei np l a n t b a s e do nt h ec l a s s i c a le v o l u t i o n a r yt h e o r y , w e c o u l di n f e rt h a tt h ep s b ag e n eh a sr e m a i n e ds t a b l ea n dp l a y sa ni n d i s p e n s a b l er o l ei n p h o t o s y n t h e s i sb o t hi nl o w e ra n dh i g h e rp l a n t s s t r o n gn e g a t i v es e l e c t i o np r e s s u r e c o u l dm a i n t a i nt h es t a b l es t r u c t u r ea n df u n c t i o no ft h ep s b ag e n e t h e s er e s u l t s p r o v i d e du s e f u li n f o r m a t i o nf o rt h ee v o l u t i o no fc h l o r o p l a s tg e n e si np l a n t k e y w o r d s ：l e j e u n e a c e a e ；p s b ag e n e ；d i v e r g e n c et i m ee s t i m a t e ；p o s i t i v es e l e c t i o n ； n e g a t i v es e l e c t i o n i v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对 本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：陈疏霞 日期：夕。扣年厂月l o 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的 电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内 容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存 学位论文。 学位论文作者签名：陈疏最导师签名：蓟压砺 日期：j 。扣年厂月和日 日期：加b 年6 月f p 日 第一章前育 第一章前言 1 1 p s b a 基因的研究进展 植物能借助光台作用高效地吸收、传递和转换光能。它们通过叶绿体中的 色素吸收光能后，使之一部分将水分子光解为氧和氢；而另一部分经过电子传 递，最终使a d p 与磷酸基( p i ) 结合生成a t p ( 图1 1 ) 。 h 由 一州# 煞 圈1 1 光合作用过程图解 一”+ j “ j 种肆 阜如傩化 、- = ，+ ( o h i o l 培 l 应 光系统i i ( p s i i ) 反应中心在这一过程中起着关键作用，这主要涉及光能 的转换、电子和质子的产生以及分子氧的释放，即水的裂解和质体醌的还原【l o i 。 p s i i 反应中心是主要集中于类囊体膜垛叠基粒膜区的多亚基色素蛋白复合体 ( 图1 - 2 ) ，至少台有2 5 种蛋白亚基。它由以下四部分构成：( 1 ) 由围绕p 6 8 0 的c p 4 3 和c p 4 7 这两个色素蛋白复合体组成的近侧天线和主要由l h c i i 捕光 复合体组成的远侧天线共同组成的捕光天线系统。( 2 ) 由d i d 2 蛋白( 3 2k d a ) ， 以及原初供体y z 、中心色素p 6 8 0 、原初受体p h e o 、q 、q e 和铁原子所构成的 反应中心电子传递链。( 3 ) 由”、2 3 及1 7k d a 三种外周多肽以及与放氧有关 的锰簇和氯与钙离子组成的水氧化放氧系统。( 4 ) 与d i d 2 多肽紧密结合的9 k d a ( o ) 和4k d a ( 1 3 ) 两个多肽构成的细胞色素1 - 5 5 9 1 i 。 第一章前言 鸭 图1 - 2p si i 反应心复合体的结构【2 1 c y t b 5 5 9 ：细胞色素b 5 5 9 ；p 6 8 0 ：反应中心叶绿素a 分子： p h e o ：去镁叶绿素；q a 、q b ：为初级和次级电子受体；p q 质醌 f i g1 - 2 t h es t r u c t u r eo fp h o t o s y s t e mi ir e c t i o nc e n t e r 2 】 d 1 蛋白是p sh 反应中心的两个核心蛋白之一，与d 2 蛋白共同构成了p s i i 反应中心的基本框架，有序地结合着各种与原初电荷分离及电子传递有关的 辅助因子i l 圳。研究表明，不仅d 1 蛋白含有p sh 电子传递链中最重要的组分z ( 一个酪氨酸残基侧链) 和d ，而且其t y r l 6 1 和h i s l 9 0 还直接参与水的光解。 另外，原初电子供体p 6 8 0 、初级电子受体去镁叶绿素p h e 和次级电子受体q b 以及与水裂解相关的锰簇也分别与d 1 蛋白相连。因此，d 1 蛋白对维持p s i i 反 应中心构象的稳定、原初电荷的分离以及电子的传递至关重要【l 捌。 d l 蛋白由p s b a 基因编码：它不仅是编码p si i 组分的1 4 个叶绿体基因中 被最先分离、克隆和鉴定的基因，而且也被研究得最多。这些研究多集中于p s b a 基因的克隆、测序、定位及序列结构、密码子使用特性、表达调控及d 1 蛋白 的光抑制现象等方耐4 弓j 。下面就这一些研究进展作一简要综述。 1 1 1 p s b a 的克隆与测序 芦拗基因是编码p s i i 组分的1 4 种叶绿体基因中首先被分离、克隆、鉴定 的基因。目前为止，所有植物类群包括蓝细菌、藻类植物、苔藓植物、蕨类植 物、裸子植物以及被子植物均有代表物种克隆了该基因。p s b a 的克隆与顺序分 析也大大地丰富了人们对d 1 蛋白的认识：第一，最初合成的d 1 蛋白含有3 5 3 个氨基酸残基，其分子量为3 8 9 5 0d a ；第二，d 1 蛋白通常不含赖氨酸而富含 2 f献耋 第一章前言 疏水性氨基酸，这些疏水性氨基酸促使d l 蛋白形成5 个典型的a 跨膜螺旋； 第三，d l 蛋白和d 2 蛋白的氨基酸顺序与光合细菌r v i r i d i s 的光反应中心l 和 m 的氨基酸顺序有较高的同源性，据此推测d l 蛋白和d 2 蛋自在高等植物中所 起的作用可能与l 和m 在光合细菌中一样，该观点在以后的研究也得到了证实 【5 】 o p s b a 基因之所以得到如此广泛的关注，是由其本身具有的独特功能和特性 所决定： 1 ) 其编码产物d 1 蛋白( 又称3 2k d a 蛋白、q b 蛋白或快速标记的除草剂 结合蛋白) ，是p si i 反应中心的2 个核心蛋白之一，在光合作用中介导 电子传递。 2 ) 该基因的表达过程中受光的调控，对其进行研究有助于揭示光的调控机 制。 3 ) 其启动区的3 5b o x 、p r i b n o wb o x 、转录起始序列以及s d 序列等共有 序列与e c o l i 的同源性非常高，可被e c o l ir n a 聚合酶识别，并且有 s d 序列可供核糖体结合，所以p s b a 基因能够在e c o l i 中转录并翻译， 从而为进一步深入研究该基因表达特性提供方型6 。 4 ) d l 蛋白中有均三氮苯类除草剂的结合位点，在不同植物中，其2 l l 、2 1 9 ( v a l - l i e ) 、2 51 ( a l a - i l e ) 、2 5 5 ( p h e t y r ) 、2 5 6 、2 6 4 ( s e r - g l y 或a l a ) 、2 6 6 及2 7 5 ( l e u p h e ) 位密码子中的任何一个发生突变都可能产生不同的除 草剂抗性表型，因此它对研究植物对除草剂的抗性机制有重要的意义 【7 】 o 5 ) p s b a 基因高度保守，广泛用于较高水平如属以上水平的分子系统发育 关系的比较1 8 剐。 1 1 2 p s b a 的定位及序列结构 陆生植物( 包括苔藓植物、蕨类植裸子植物以及被子植物) 的p s b a 一般是 无内含子的单拷贝基因，且大多数定位于叶绿体基因组中的l s c 邻近i r a 的位 置上。其5 上游是t r n k 基因，3 下游则是r p s l 9 或t r n h 基因。但也在部分裸子 植物以及蕨类植物的p s b a 基因中出现双拷贝的现象。在裸子植物中，扭叶松 ( p i n u sc o n t o r t a ) 有2 个相同的拷贝，在基因组中的位置为p s b ai t r n k - p s b ai i 护玎一1 0 】；黑松( p 加猫t h u n b e r g i i ) | 1 、红松( p i n u sk o r a i e n 5 i s ) f 1 2 】和小叶买麻藤( 锄2 f 姗 p a r v i f o l i u m ) 1 3 1 也有两个拷贝，但是两个拷贝的长度不相等，分别为1 0 6 2 、8 1 和 1 0 6 2 、2 7 9b p ，是由于i r b 发生了不完全丢失造成的。在蕨类植物中，铁线蕨 第一章前吉 ( a d i a n t u mc a p i l l u s v e n e r i s ) d 4 1 ( a 厶o p h i t as p i n u l o s a ) 1 5 1 均具有2 个相同的拷贝， 均分别位于i r a 和i r b 中( r p s 7 - p s b a t r n h ) 。陆生植物p s b a 的编码区( 不包 括终止密码子) 长1 0 5 9 b p ，可编码一个含有3 5 3 个氨基酸残基的多肽。除欧龙 牙草( a g r i m o n i ae u p a t o r i a ) 和大麦( h o r d e u mv u l g a r e ) 分别在7 1l b p 处有一编码赖 氨酸残基的密码子外，其余陆生植物的p s b a 均无编码该氨基酸残基的密码子 【4 - 5 】 o 藻类和蓝细菌p s b a 的情况相对复杂。在藻类中，莱茵衣藻( c h l a m y d o m o n a s r e i n h a r d t i i ) 的p s b a 有2 个相同的拷贝，分别位于i r a 和i r b 中，而且每个拷 贝中都有4 个第1 类内含子1 6 】；纤细裸藻( e u g l e n a g r a c i l i s ) 中p s b a 虽是单拷贝， 但也有4 个第1 i 类内含子【l6 1 。蓝细菌的p s b a 则通常以基因簇的形式存在，即含 有3 或4 个紧密相关但不尽相同的成员( p s b ai i v ) ，如s y n e c h o c o c c u ss p p p c 7 9 4 2 有3 个成员，a n a b a e n ap p c 7 1 2 0 有4 个成员【l 7 1 。在藻类及蓝细菌中， 芦鲥编码区的长度及密码子使用特性均有较大的变化：如莱茵衣藻的p s b a 的 编码区长1 0 5 6 b p ，不含赖氨酸密码子；纤细裸藻的p s b a 的编码区长1 0 3 5 b p ，含 5 个赖氨酸密码子；a n a b a e n a7 1 2 0 的p s b ai 的编码区长1 0 8 0 b p ，含2 个赖氨 酸密码子p 1 。 序列高度保守是叶绿体基因组( c p d n a ) 的特性之一，作为c p d n a 中的 一个基因，p s b a 也不例外，其序列高度保守【4 弓】： 1 )启动区核苷酸序列的同源性在单子叶植物和双子叶植物中分别达9 5 和9 2 ，在单、双子叶植物之间也可达8 0 左右。 2 ) 编码区的序列同源性也很高，如双子叶植物之间可达9 0 以上。 3 _ ) 3 非翻译区( 3 u t r ) 的保守程度相对要低得多，但都能形成一类似于 原核终止子的茎环结构，而且这些茎环结构距翻译终止密码子距离相 等。 4 ) 编码产物氨基酸序列保守性就更高，如水稻( o r y z a s a t i v a ) 、高梁( s o r g h u m v u l g a r e ) 、菠菜( s p i n a c i ao l e r a c e a ) 、烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) 、大豆( g l y c i n e m a x ) 等植物之间氨基酸同源性高达9 8 以上，藻类等低等植物之间的 氨基酸同源性一般为8 4 , - - 9 0 。 1 1 3 p s b a 的密码子使用特性 根据g r a n t h a me ta l ( 1 9 8 6 ) 的基因组假说，以及m o r t o n ( 1 9 9 3 ) 对地钱 ( m a r c h a n t i a p o l y m o r p h a ) 、水稻和烟草等植物中叶绿体基因组密码子使用的研 究，表明叶绿体基因组对密码子的使用具有偏好性，即对n n a 、n n t 的选择 4 第一章前言 优于同义密码子n n c 、n n g 【1 8 - 1 9 1 。而p 鲥基因却对n n c 的选择优于n n t ， 并且只有叶绿体基因组自身编码的t i 矾a 与n n c 配对。 另一特点是t u b a 内无或极少赖氨酸密码子。如前面提到的，除欧龙牙草和 大麦分别在7 1 l b p 处有一赖氨酸密码子外，其余陆生植物的声6 a 均无此密码子。 莱茵衣藻中也无此密码子，但纤细裸藻中有5 个；而蓝细菌a n a b a e n a7 1 2 0 有2 个。 1 1 4 p s b a 的表达调控 基因的表达是指基因通过转录与翻译表现其生物功能的过程。表达调控包 括转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平四个级别的调控。 1 1 4 1 转录水平的调控 早期对豌豆( p 括u ms a t i v u m ) 、玉米( z p 口聊删) 和菠菜的研究表明，光确 实能诱导邵mm r n a 的积累，由此认为光调控卵鲋转录，并推测由光敏色素 介导或者由于筇鲥中存在光响应因子( l r e ) 的作用序列。此后在蓝细菌中也 发现光强对其3 个卵醐的转录具有不同的调控【2 0 1 。 现在也有相当一部分学者倾向于筇6 a 转录的非光调节观点，认为筇6 a 也 是定型转录。相关的研究表明，光暗交替虽然导致烟草、紫萍( 印，0 如，口p o l 吵h i z a ) 的d 1 蛋白量急剧变化，但却对m r n a 量几乎没有影响，据此认为光对t u b a 转录的影响是非直接的；其m i a 积累受发育控制，而d 1 蛋白的合成确实在 翻译水平受光的调控【4 弓】。 1 1 4 2 转录后水平的调控 与大多数基因的表达调控一样，p s b a 的表达过程中也存在转录后水平的调 控，即对m r n a 稳定性的调控。m i a3 端非翻译区( 3 u t r ) 中可转录的、 短的、反向重复序列所形成的茎环结构担负着对m r n a 稳定性的调控。该茎环 结构的去除或者只是个别碱基的改变都可能导致其m r n a 稳定性下降。大多数 情况下，该茎环结构功能的发挥需要结合蛋白的协同作用【4 吲。 1 1 4 3 翻译水平的调控 第章前言 针对大麦、紫萍( s p i r o d e l ap o l y r h i z a ) 以及衣藻( c h l a m y d o m o n a s ) 的研究表 明，d l 蛋白的合成在黑暗中无法进行，转入光下却能迅速合成，而其m r n a 含量却几乎不变【2 卜2 3 1 。可见，d 1 蛋白的合成受到光的严格控制，且发生于肽链 延伸阶段而不是起始阶段，依据之一是黑暗条件下仍有大量分子量为1 5 2 5 x 1 0 3 d a 的d l 中间产物合成1 2 4 彩j 。通过对烟草、衣藻的研究证实，d 1 蛋白合成的光 调控元件主要位于其m r n a5 非翻译区( u t r ) 【2 6 2 7 1 。 1 1 1 4翻译后水平的调控 翻译后水平的调控包括对多肽链的剪辑、折叠以及最终成为具有活性的三 维结构等一系列过程的调控。针对水稻、菠菜的研究表明，p s b a 表达过程中存 在翻译后水平的调控。 在水稻中，d 1 蛋白前体含有3 5 3 个氨基酸，在成熟加工过程中移去了3 6 个氨基酸，所以其d l 蛋白只有3 1 7 个氨基酬2 引。 在菠菜中，d 1 蛋白前体c 端存在切割作用的保守特异位点，该位点移去9 个氨基酸使成熟的d 1 蛋白的c 端以丙氨酸结尾。有趣的是，纤细裸藻的编码 区恰好终止于该加工位点【2 9 】。此外，菠菜d 1 蛋白前体n 端发生包括去除起始 的甲硫氨酸，而对成为n 端首位氨基酸的苏氨酸进行乙酰化和磷酸化【3 0 1 。另外， 由于d l 蛋白是在叶绿体基质中合成，然后再转运到叶绿体基粒和基质片层中。 有人据此提出在d 1 蛋白的成熟过程中还发生棕榈酰化作用，从而调节它在基 粒和基质片层中的分布1 3 。 1 1 5 d 1 蛋白的光抑制现象 当光能超过光合系统所能利用的数量时，光合功能下降的现象，这就是植 物的光抑制现象，该现象普遍存在于需养光合作用。在自然条件下，晴天中午 植物上层叶片常常发生光抑制，当强光和其他环境胁迫因素如低温、高温或干 旱等同时存在时，光抑制加剧，甚至即使在中低光强下也会发生。植物本身对 光抑制有一定的保护性反应。 1 1 5 1 光抑制的直观表现 光抑制主要发生在p si i ，即强光下p sl i 受损；对其修复需要光、叶绿体 翻译活性以及d i 蛋白的快速降解，尤其是后割4 , 3 2 1 。因此，光抑制的直观表现 6 第一章前言 是，光调控下快速合成的d 1 蛋白同时也快速降解。该降解过程可能由p si i 本 身组分之一的膜结合的内源蛋白水解酶催化，可被丝氨酸型蛋白酶抑制剂如 p m s f ( 苯甲基磺酰氟) 、d f p ( 异丙氟磷) 特异地阻断 4 , 3 3 】。 1 1 5 2 光抑制的微观表现【5 l d 1 蛋白是p sl i 还原端第二个稳定的电子受体，与q b 结合疏松。当q b 从 q a 得到一个电子时，形成半醌阴离子q a 而与d l 蛋白紧密地结合；当得到第 二个电子时，形成q b 2 。q b 2 。从基质中捕获2 个氢离子形成p q h 2 后，被d 1 蛋 白释放进入类囊体膜上的质体醌库中。 在莱茵衣藻中，q b 的阴离子可能与氧相互作用产生氧自由基，并导致了d l 蛋白的损伤。当d 1 蛋白的损伤速率大于更新速率时，出现光抑制现象。 在高等植物中，q b 的损伤也是光抑制现象的主要原因之一。q b 在光下易降 解，其降解速度随光强的增加而加剧；但可被p s 电子传递抑制剂如d i u r o n ( 取代脲类除草剂敌草隆) 和a t r a z i n e ( 均三氮苯类除草剂阿特拉津) 所抑制。 1 1 6d 1 蛋白的阿拉特津抗性 d 1 蛋白是分子量大约为3 2k d a 的内在性膜蛋白，有均三氮苯类除草剂的 结合位点。均三氮苯类除草剂与质体醌q b 竞争d l 蛋白的同一结合部位，当其 与d 1 蛋白结合后，抑制了p s l i 电子传递链中质体醌的电子传递，从而使能量 传递中断光合作用终止植物死亡。在不同植物中，其2 l l 、2 1 9 ( v a l 1 i e ) 、 2 51 ( a l a - l i e ) 、2 5 5 ( p h e - t y r ) 、2 5 6 、2 6 4 ( s e r - g l y 或a l a ) 、2 6 6 及2 7 5 ( l e u - p h e ) 位 密码子中的任何一个发生改变都可能产生不同的除草剂抗性表型，因此它研究 植物对除草剂的抗性机制有重要的意义【4 。5 ，。7 1 。已有的研究表明，阿拉特津抗性 作物一般比感性的干物质产量有所下降，但其原因需要进一步深入研究。 鉴亍：p s b a 独具的功能和特性，它已成为植物叶绿体基因组中研究最广泛而 且深入的基因之一。 7 第一章前言 1 2 适应性进化的研究 1 2 1 适应性进化的概念 在适应性进化的研究中，同义替换( s y n o n y m o u ss u b s t i t u t i o n ) 是指不导致 氨基酸变异的核苷酸变异，一般发生于密码子的第三位；非同义替换 ( n o n s y n o n y m o u ss u b s t i t u t i o n ) 则是指导致氨基酸变异的核苷酸变异，一般发生 于密码子的第一和第二位。同义替代一般不受自然选择的影响，其速率往往和 中性替代发生的速率相等，选择为近中性。在很多基因中，同义替换发生的速 度是相近的，除非这些基因的密码子偏移或者存在其它干扰因素。相比之下， 非同义替换的速率远远低于同义替换，并且发生的速率依基因的不同而大相径 庭，这被认为是负选择或者清除选择( n e g a t i v e p u r i f y i n gs e l e c t i o n ) 的结果，同 义替换和非同义替换变异位点的数目因基因而异。然而，在有的基因中，非同 义替换的速率会高于同义替换的速率，这些非同义替换位点就可能受到了正选 择( p o s i t i v es e l e c t i o n ) 作用。一般来讲，当序列和( 或) 位点受到的负选择减 弱时，或者受到正选择，它的功能正在趋异 3 4 1 。 同义替换率( d s ) 或非同义替换率( d n ) 是一年中或一个世代内一个同义 位点上发生同义替换的数目或一个非同义位点上发生非同义替换的数目。实际 上，由于不知道两个序列的分歧时间，因此，习惯上总是考虑一对序列的平均 每个同义位点上发生同义替换的数目或平均每个非同义位点上发生非同义替换 的数目。用d n 和d s 的比值c o 来测度选择压力，进而判断自然选择对同义突变 的固定是起了推动还是阻碍作用【35 | 。如果非同义突变有害，那么净化选择就会 降低这些突变的固定速率，使得d n l 。所以，t o l 的显著性可被当做基因发生适应性进化的证据。 基因水平的适应性进化是一个遗传群体中以一种具有较高适合度的等位基 因替换另一种等位基因的过程。在基因水平检测适应性进化，这不仅有助于揭 示生物的进化史，而且还能加深理解基因的结构和功能变异，同时也能为识别 重要的氨基酸结构和功能位点提供信息p 4 。相对于大量的中性突变和清除选择 而言，正选择极为少见，因为正选择往往发生在密码子序列的少数位点或者某 个很短历史时期，因而很难检测。 正选择是重要的分子进化动力，能够加速同源蛋白的分化【3 6 1 。现在鉴定出 8 第一章前言 的处于正选择下的基因多是参与免疫反应和防御的相关基因【3 7 棚】、毒素蛋白基 因【4 0 水】、识别蛋白基因【4 5 4 7 】以及通过基因复制产生的基因【4 9 1 。 1 2 2 适应性进化的模型 目前，基于密码子置换模型计算得到的非同义一同义替换速率比值油= d n d s ) 常被用来推测作用于蛋白质的选择压力。现在使用的进化模型大体可分为三 类：一是n i e l s e n 和y a n g t 5 0 1 提出的机理式模型( m e c h a n i s t i cm o d e l ) ；二是 s c h n e i d e r 等【5 1 1 建立的经验式模型( e m p i r i c a lm o d e l ) ；三是d o r o n f a i g e n b o i m 和 p u p k 0 1 5 2 1 整合前两种模型而成的m e c ( m e c h a n i s t i c e m p i r i c a lc o m b i n a t i o n ) 模型。 1 2 2 1机理式模型 n i e l s e n 和y a n g 5 0 1 ，y a n g 等5 3 1 和w o n g 等【5 4 】针对编码蛋白质的d n a 序列， 基于转换一颠换偏差、密码子使用频率以及基因内和基因间所受选择作用不同等 理论假设，先后建立、改进了允许不同氨基酸位点取不同c o 值的一系列似然进 化模型。 a 分支模型陋5 6 】 分支模型允许c o 值在不同的分支上有变化。单比率( o n e r a t i o ) 模型是最 简单的模型，该模型假定进化树上所有分支的比率相同，为c o o 。自由比率 ( f r e e r a t i o ) 模型是最全面的模型，该模型假定不同的分支有不同的比率。由 于该模型中参数较多，所以有可能会导致不甚精确的c o 值；然而，该模型的优 势在于，缺少序列信息时，估测值时不会受到影响。在这两种极端模型之间 还有很多中间模型，如：二比率( t w o r a t i o ) 模型和三比率( t h r e e r a t i o ) 模型。 b 位点模型盼5 7 1 位点模型假定各分支有相同的c o 值，但不同氨基酸位点经历不同的选择压 力。通常成对比较模型m l a 和m 2 a 、m 0 和m 3 、m 7 和m 8 或者m 8 和m 8 a 的 统计量2 a t e ( a z = 锄一e 0 ，z l 、分别表示两个模型下的似然值) 依妒分布进行 似然比值检验( 1 i k e l i h o o dr a t i ot e s t ，l r t ) ，自由度为两个模型参数数目的差值。 1 ) 模型m o ( 单- - l t 值模型) 假定所有位点和分支具有相同c o 比值。 9 第章前言 2 ) 模型m l a ( 近中性模型) 假定蛋白质具有两类位点：一类为保守位点， 0 l ；另一类为中性位点，其0 9 - - 1 。 3 ) 模型m 2 a ( 正选择模型) 增加第三类位点，其c o 为自由参数，取值可大 于l 。 4 ) 模型m 3 ( 离模型散) 利用三类位点的离散分布；三类位点对应的比例 p o ，p l ，p 2 和比值，2 ，3 分别由数据估计得出。 5 ) 模型m 7 ( b e t a 模型) 利用b e t ab ( p ，q ) ；随参数p 和q 的改变，该 分布可取不同的形状。 6 ) 模型m 8 ( b e t a & c o 模型) 在模型m 7 基础上增加一类位点，其比例和 由数据估计得出，这样位点的c o 取值就可大于l 。 7 ) 模型m 8 a ( b e t a 和= 1 ) 同m 8 类似，只是将值固定为1 。 c 分支位点模型【4 9 5 8 1 分支位点模型将进化树上的支系分成“前景支( f o r e g r o u n d ) ”和“后景支 ( b a c k g r o u n d ) ”两类，允许国值同时在分支和位点间存有差异，并且只允许在 “前景支”上存在大于1 的位点。 分支位点模型将所有核菅酸位点分为四类：第一类位点在所有分支中高度 保守，其幽以( d ) 值较小；第二类位点经受中性或近中性选择，其幽豳( ，) 值接近l 或者略小于l ；第三类位点在背景分支中高度保守( d ) ，但前景分支 比率( 2 ) 显著大于l ；第四类位点在背景分支经历中性进化或所受选择压力 较小( j ) ，但前景分支比率2 显著大于1 。 分支位点模型包括a 和b 两个模型，a 模型包括2 个检验：检验l 和检 验2 。 在检验1 中，零假设( n u l lm o d e l ) 为模型m l a ，该模型假定在所有分支中 只有两类位点，分别为0 d 1 和i ，= l 。无论前景分支上的位点是处于宽松 压力( d 1 ) ，都可以进行 统计检验。因为备选假设( a l t e r n a t i v e m o d e l ) 比零假设多了2 个参数( p 2 和2 ) ， 所以采用# ，自由度d f = 2 来进行检测分析。 在检验2 中，零假设仍然是a 模型，但是需要设定2 = 1 。该零假设允许 一些位点在背景分支处于选择清除状态而在前景分支中是中性进化。因此，检 验2 可以直接检验前景分中是否在正选择。 经由这些模型验证存在正向选择的位点后，可进一步通过贝叶斯途径将发 生正向选择的氨基酸位点加以鉴定。值得注意的是，s u z u k i 和n e i l 5 9 - 6 0 】的分析 1 0 第一章前言 曾指出上述似然法分析给出假阳性结果。但是，w o n g 等基于模拟研究对似然法 的可信度和统计效力给出有力回应，并特别提到s u z u k i 和n e i 的分析有误。 z h a n g 等也质疑过y a n g 和n i e l s e n t 6 2 1 的分支位点模型易产生假阳性，但随后 z h a n g 等【4 9 1 同y a n g 合作对该模型予以了改进，很好地解决了假阳性问题。 1 2 2 2经验式模型蚓 氨基酸置换的经验模型( e m