（应用化学专业论文）铜配合物生物活性的微量热研究.pdf

捅晏 铜是日常生活中最常见的金属之一，也是一种非常重要的生命微量元素。 在人体中分布于器官与组织中，对于维持入的生命活动发挥着重要作用。人体 缺乏铜会引起多种疾病如贫血、骨质疏松、冠心病、白癜风及妇女不孕或胎儿 及婴儿发育不良等，故适当的摄入铜是有益的。但铜吸收过多可发生铜中毒， 如心律失常，严重时会出现肾功能衰竭、尿毒症、休克等。慢性铜中毒，会引 起呼吸系统疾病、眼部疾病、皮肤疾病等。由于铜对人体的重要性，近年来成 为引人注目的研究对象。迄今为止，不断有新的铜配合物合成，配合物的合成 方法及配合物的物理化学性质、晶体结构以及配合物的抗菌活性是目前研究热 点之一。 本文根据现有条件，本着创新性和系统性的思想，用微量热法和显微成像 法研究了铜化合物对细菌、四膜虫的相互作用以及铜与重金属离子或苯酚等有 机物的联合毒往作用。主要工作内容如下： 1 采用微量热法研究了四种铜配合物对四膜虫的毒性，我们得到了四膜虫 的生长代谢曲线，并计算出了生长速率常数k 、抑制率，、半抑制浓度i c s o 、传 代时间纯等热力学及动力学数据，讨论了k 、地x 与c 的关系，并用显微镜表 征了在药物作用下四膜虫的形态变化。结果表明，从出现最高峰的位置所对应 的时间( 瓦t a ) 【) 来比较的话，这四种药物的毒性大小为 c u ( p h c n ) 3 c i 2 6 h 2 0 ( c 9 h 6 n o ) 2 c u c u ( p h c n h c l z 6 h 2 0 c u c l 2 。 2 用微量热法分别测定了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在四种铜配合物作用 下的生长代谢曲线，结果表明对于同一种药物同一浓度作用下，两种细菌的代 谢曲线不一样，抑制程度也不太一样，对金黄色葡萄球菌的抑制率明显低于大 肠抒菌的：通过a f m 理察了在【c u ( p h c n ) 2 c 1 2 - 6 h 2 0 作用后大肠杆菌表面超细微结 构，结果表明大肠杆菌经过处理之后，其缅胞膜结构已经被破坏，细胞壁和膜 通透性增加，细胞质流失继而细菌死亡。 3 以大肠杆菌为实验对象，用微量热法研究了铜与锌、汞、镉、铅、苯酚、 硝基苯等的联合作用，计算了大肠杆菌与铜和这些毒物的联合作用下的生长速 率常数，并根据生长速率常数与浓度的关系，初步探讨了它们之间联合作用的 机理，得到了一些有意义的结果。 关键词：微量热；铜配合物；代谢；细菌；四膜虫；联合作用 a b s t r a c t c o p p e ri sa l le s s e n t i a lb i o l o g i c a lt r a c ee l e m e n t ，w h i c hi st h em o s tf a m i l i a rm e t a l i nt h ed a i l yl i f e i tp l a y sa l li m p o r t a n tr o l e si np h y s i o l o g i c a la c t i v i t y s d e f i c i e n c yo f c o p p e rw i l lc a u s ed i s e a s e ss u c ha sa n a e m i a ，o s t e o p o r o s i s ，c o r o n a r yh e a r td i s e a s e ， v i t i l i g o ，f e m a l ei n f e r t i l i t ya n de ta 1 s oi ti sb e n e f i c i a lt ot a k ep r o p e ra m o u n tc o p p e r b u ta b s o r b i n gs u p e r a b u n d a n c e c o p p e rc a n l e a dt o c o p p e rt o x i c i t y , i n d u c i n g a r r h y t h m i a , e v e nr e n a lf a i l u r e ，u r a e m i a ，a n d s h o c k c h r o n i cc o p p e rt o x i c i t yw i l lb r i n g r e s p i r a t o r yd i s e a s e 、d i s e a s eo fo c u l a gc o n j u n c t i v i t i s ，s k i nd i s e a s ea n d s oo n s i n c et h e i m p o r t a n c eo fc o p p e rt oh u m a nb o d y , m u c ha t t e n t i o nw a sf o c u s e dr e c e n ty e a r s t h e s y n t h e s i sm e t h o d s ，t h ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e s ，c r y s t a ls t r u c t u r eo ft h e c o m p o u n d sa n da n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw e r et h eh o t s p o t s b a s e do nt h ei d e ao fi n n o v a t i o na n d s y s t e m i c r e s e a r c h , w eu s e d m i c r o c a l o r i m e t r ya n dm i c r o s c o p yt os t u d yt h ea c t i o no fc o p p e rc o m p l e xo nt h e m e t a b o l i s mo fb a c t e r i aa n dt e t r a h y m e n at l l e r m o p h f l a t h ea s s o c i a t e dt o x i ce f f e c t b e t w e e nc o p p e ra n dh e a v ym e t a lo rp h e n o lb ym i c r o c a l o d m e t r yw e r es t u d i e d t h e w o r ki n c l u d e s ： 1 t h ea c t i o no ff o u rc o p p e rc o m p l e x e so nt e t r a h y m e n at h e r m o p h i l ag r o w t h m e t a b o l i s mw a ss t u d i e db ym i c r o c a l o r i m e t r y w eo b t a i n e dt h em e t a b o l i s mc u r v e so f t e t r a h y m e n at h e r m o p h i l a ，c a l c u l a t i n gs o m et h e r m o d y n a m i c sa n dd y n a m i c sd a t as u c h a st h eg r o w t hc o n s t a n tk ，i n h i b i t i n gr a t e 厶h a l f - i n h i b i t i n gc o n c e n t r a t i o n c s 0 ， g e n e r a t i o nt i m ef g w eh a v ed i s c u s s e dt h er e l a t i o n s h i pa m o n g k ，丁t m a xa n dc ， o b s e r v i n gt h em o r p h o l o g yc h a n g e so ft e t r a h y m e n at h e r m o p h i l au n d e rt h e m e d i c a m e n t sb yt h em i c r o s c o p e t h er e s u l t ss u g g e s t ，w h i c hs h o w sf r o mt h eh i g h e s t a p e x ，c o m p a r i n gt h er e s p e c t i v et i m e ( z m a x ) ，t h et o x i c i t yo f f o u rm e d i c a m e n t si s 【c u ( p h e n ) 3 c 1 2 6 h 2 0 ( c 9 h 6 n o ) z c u 【c u ( p h e n ) 2 c 1 2 。6 h 2 0 c u c l 2 2 t h ea c t i o no ff o u rc o p p e rc o m p l e xo nt h ee s c h e r i c h i ac o l ia n ds t a p h y l o c o c c u s a u r e u sw a ss t u d i e db ym i c r o c a l o r i m e t r y t h er e s u l ts h o w st h a t ，f o rag i v e nc o m p l e x i nt h es a m ec o n c e n t r a t i o n ，d i f f e r e n tg r o w t hc u r v e sa n di n h i b i t i n ge x t e n to ft h et w o k i n d sb a c t e d aw e r eo b s e r v e d ，t h ei n h i b i t i n gr a t et os t a p h y l o c o c c u sa u r e u ai so b v i o u s l o w e it oe s c h e r i c h i ac o l i t h eu l r a m i c r o s t r c t u r eo fe s c h e r i c h i ac o l io b s e r v e db y a f m u n d e r 【c u ( p h e n ) 2 c 1 2 6 h 2 0s h o w e dt h a te s c h e r i c h i ac o l i sm e m b r a n es t r u c t u r e h a sb e e nb r o k e n , l e a d i n gt oi n c r e a s i n gt h em e m b r a n ep e n e t r a t i o n ，l o s i n gc y t o p l a s m a n dd i e d 3 t h ea s s o c i a t e de f f e c t sb e t w e e nc o p p e ra n dz i n c , m e r c u r y , c a d m i u m ，l e a d , p h e n o la n dn i t r o p h e n o lw e r eo b s e r v e db ym i c r o c a l o r i m e t r y , t h ee s c h e r i c h i ac o l da sa m o d e lr o l e a c c o r d i n gt ot h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h eg r o w t hr a t ec o n s t a n t sa n dt h e c o n c e n t r a t i o n ， w eh a v e p r e l i m i n a r i l y s t u d i e dt h em e c h a n i s mo ft h e c o m b i n a t i o n ，w h i c ho b t a i n e ds o m es i g n i f i c a t i v er e s u l t s k e yw o r d s ：m i c r o c a l o r i m e t r y ；c o p p e rc o m p l e x ：m e t a b o l i s m ：b a c t e r i a ；t e t r a h y m e n a t h e r m o p h i l a ；a s s o c i a t e df u n c t i o n i i l 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得武汉理工大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：鸥堑羔垂一日期：掣妒 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权 保留、送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保留的论文在解密后应遵守此规定) 签名： ( 注：此页内容装订在论文扉页) 导师签名缓日前：型必产 武汉理工大学硕士学位论文 第1 章引言 1 1 铜配合物生物活性的研究进展 铜作为生命起源的一种必需元素是在1 9 2 8 年由h a r t 发现的，铜在人体中的 含量为0 0 0 1 ，仅次于铁和锌而位居第三位，它在生命体中起着重要的作用。 远在1 8 4 7 年，h a r l e s s 已经指出软体动物血内的铜具有重要作用；1 8 7 8 年，f r e d e r i g 首先从章鱼血内的蛋白质配合物中将铜分离出来，并称该蛋白为血铜蓝蛋白； s e v e r y 还在1 9 2 3 年比较精确地测定了很多海洋动物各种组织内的含铜量【l 叫。 铜对于结缔组织的形成，神经系统的发育，以及骨骼的发育都是十分必要 的。铜也参与铁和能量的代谢。铜在许多酶的反应中消耗分子氧而充当还原剂 的作用，这些酶包括超氧化物歧化酶、细胞色素氧化酶、赖偶酰( 1 y s i l ) 氧化酶、 多巴胺羟化酶及其他氧化酶等【宝6 1 。铜的主要生理功能有以下几种：1 ) 维护正常 造血机能和铁的代谢。在食物中，铁通常里f e ( i i i ) 态，并在胃和肠道中被还原为 r e ( 1 1 1 而被吸收，它与脱辅基铁蛋白结合后又转为f e ( i i i ) 并形成铁蛋白而贮存起 来，但可以再一次还原成r e ( 1 1 1 形式后释放到血浆中。但是，进入血流中的铁必 须再氧化成f e ( i i i ) 形式与铁传递蛋白相结合才能向需要它的部位( 骨髓) 转移。这 一步反应受血浆铜蓝蛋白的调控，它通过催化铁( i i ) 离子的氧化控制铁传递蛋白 结合铁的速度的因素，铜蓝蛋白减少使细胞可用的铁减少，网状红细胞中血红 蛋白的合成受到影响，可见血浆铜蓝蛋白与铁代谢有密切的关系；2 ) 维护中枢 神经系统的健康。铜与锌、铁等一样，也是大脑的“益友”，在维持正常的脑功 能方面功不可没，因为他们都是神经递质的重要成分，如果摄取不足可致神经 系统失调，大脑功能会因之而发生障碍。铜缺乏将使脑细胞色素氧化酶减少， 活力下降，出现记忆衰退、思维紊乱、反应迟钝以及步态不稳、运动失常等症 状；3 1 保护毛发正常的色素和结构。铜元素与黑色素的代谢密切相关，缺铜可 使人体内的酪氨酸酶形成困难，导致酪氨酸变成多巴的过程受阻，多巴则为多 巴胺的前体，而多巴胺又是黑色素的中间产物，最终妨碍黑色素的合成，遂引 起头发变白；4 ) 维护骨骼、血管、皮肤的正常；5 ) 保护机体细胞免受超氧离子 的毒害 5 - 8 1 。 武汉理工大学硕士学位论文 铜在体内经血浆铜蓝蛋白运输。成年人体内大约含有8 0 m g 铜( 主要集中在 肝和大脑组织1 ，成年人铜的摄入量中位数在1 0 1 6 m g d 。膳食铜的良好来源是 肝及其他内脏、牡蛎、坚果、种子、黑巧克力和谷类。人体缺乏铜引起的疾病 主要如下：1 贫血因为铜的减少而影响铁的吸收，从而引起缺铁性贫血。2 缺 铜可导致骨质疏松，易骨折。3 会引起冠心病。4 会引起白癜风。5 会导致妇女 不孕或胎儿及婴儿发育不良。6 可招致胶原及蛋白合成障碍和高尿酸血症，引起 心血管畸形，也可能引起缺血性心肌病变。铜吸收过多可发生铜中毒，急性铜 中毒会出现各种症状，如心律失常，严重时会出现肾功能衰竭、尿毒症、休克 等。慢性铜中毒，会引起呼吸系统疾病、眼部疾病、皮肤疾病等。另外，铜在 肝和肾中沉积中毒会产生肝脏疾病和肾功能受损。 由于铜对人体的重要性，近年来成为引人注目的研究对象。铜配合物在医 药中的应用据文字记载可追溯至古希腊时代。铜配合物不仅具有抗癌活性，还 具有抗炎、抗溃疡、抗抽搐、抗糖尿病和抗诱变剂等作用。1 9 6 6 年，梅氓【1 】等 从放线菌分离得到抗生素博来霉素，并从微生物的培养液中按1 ：1 配合形成 c a ( 1 1 1 博来霉素。据研究报道，它可用于治疗皮肤癌、头颈癌和子宫颈癌、恶性 淋巴肿瘤等；尹富玲【1 1 】等合成了2 ，2 ，联吡啶和去甲基斑蝥酸根桥联双核铜( ) 配合物，该配合物中两个铜原子呈六配位的拉长畸变八面体构型，配位后增加 了配合物的亲脂性，使其更易跨膜进入细胞内，而b i p y 平面对癌细胞d n a 的插 入将破坏d n a 碱基对间的氢键，使d n a 失去复制功能，生物活性测试结果表 明该配合物具有较强的体外抗肿瘤活性；何水样【1 2 1 等合成了2 羰基丙酸水杨酰 腙铜配合物，抑菌实验结果表明，质量分数为0 5 0 的配合物对辣椒疫霉菌的抑 制率高达1 0 0 ，对烟草赤星菌的抑制率也达到6 6 0 2 ，分别是0 1 0 的硫酸铜 溶液对同种菌抑制率的1 8 倍和4 倍。这可能是因为配体和c u “的抑菌协同作用 所致。配体的抑制率也远远高于硫酸铜的抑制率，但明显不如配合物。 1 2 复合污染的研究进展 随着工农业生产的迅猛发展，越来越多的污染物质，尤其是人工合成的各 种有机污染物通过各种途径进入到环境中，并在环境中共存。长期的毒理学研 究己揭示出大量单一化学品的物理化学性质和环境毒性效应，但很多环境效应 无法用单一污染物的作用机理来解释，因为在多数情况下，两种或多种化学物 2 武汉理工大学硕士学位论文 质联合作用于生物时，会引起与各物质单独作用时完全不同的毒性反应，因此 复合污染研究逐渐成为环境毒理学研究发展的重要方向之- - 1 1 3 4 1 。1 9 3 9 年b l i s s 首次提出对复合污染的联合毒性进行拮抗作用、加和作用、协同作用的划分【1 4 1 。 在以后的研究中，不同的研究者提出了许多不同的分类方法与判断指标陋1 6 】( 详 见表1 1 1 。 表1 1 污染物交互作用类型与判断指标 3 武汉理工大学硕士学位论文 1 2 1 复合污染的分类 所谓复合污染( c o m b i n e dp o l l u t i o n1 ，是指2 种或2 种以上不同种类不同性 质的污染物；或同种污染物的不同来源；或2 种及2 种以上不同类型的污染在 同一环境中同时存在所形成的环境污染现象。 按污染物的类型分，可分为有机复合污染、无机复合污染、有机无机复合 污染。 1 2 1 1 有机复合污染 多种有机物共存于环境中时，在各种环境条件和生物作用下所产生的复合 作用十分复杂，但由于采用的方法体系及参考模型不同，结果相差较大。如 l a n g e 1 7 l 等在研究硝基苯和二硝基苯的复合污染毒性时运用了多种方法，用等值 线和复合污染指数法时，结果表明是相加作用，而用m a r k i n g 相加指数法的结果 则是拮抗作用。有机复合污染的性质取决于各种有机污染物的加入比例。 t r i p a t h i 1 8 】等研究发现，将两种杀软体动物剂( m o l l u s c i c i d e ) 按一定比例( 1 ：4 6 ) 加 入后呈协同作用，i c 5 0 值下降1 0 0 倍；与m g k 2 2 6 4 这种脂酶阻物以1 - 4 6 ：5 比例加入时，三者毒性明显大于前二者毒性，协同作用更加明显。 1 2 1 2 无机复合污染 2 种或2 种以上无机污染物同时作用所形成的环境污染现象。重金属元素之 间的复合污染是当前无机复合污染研究的重点。 b r a e kc ta l ”j 的研究表明，c u 和z n 对双鞭甲藻( d i n u f l a g e l l a t e ) 的前沟藻属 ( a m p h i d i n i u m ) 、四鞭藻属、( c a r t e r i a ) 和硅藻的海链藻属( t h a l a s s i v s i t a ) 有明显的 协同作用，而对硅藻的褐指藻属( p h a e a f a c t y l u m ) 的效应则表明它们相互拮抗； p i e t i l a i n e n l 2 0 j 的研究则表明p b 和c d 的交互作用关系与两者的浓度比有关，当 p b c d 1 时，它们对浮游植物初级生产力的影响为拮抗作用，当p b c d c u ( p h e n ) 2 c 1 2 6h 2 0 c u c l 2 。 从图2 5 中可以看出，c u c l 2 在4 x 1 0 4 m o l l 出现最高峰的位置对应的时间 f f m a x ) 为1 9 1 8 m i n ，( c 9 h 6 n o ) 2 c u 在4 1 0 4 m o l l 时的z k x 为2 3 5 4 m i n ， 【c u ( p h e n ) 2 c 1 2 6 h 2 0 在4 1 0 5 m o l l 时的为1 7 2 3 m i n ，【c u q h e n ) 3 c 1 2 6 h 2 0 在4 x1 0 s m o l l 时的a ，【为8 0 6 0 m i n ，如果从出现最高峰的位置所对应的时问 ( a x ) 来比较的话，这四种药物的顺序为 c u ( p h e n ) 3 c 1 2 6 h 2 0 ( c _ ，9 h 6 n o ) 2 c u 【c u ( p h e n ) 2 c 1 2 6 h 2 0 c u c l 2 。 【c u ( p h e n b c 1 2 - 6h 2 0 在所观察的浓度范围内，七几乎不随着药物浓度的变化 而变化，但从图2 3 可明显的看出生长代谢曲线整体往后推移，出现最高峰所对 应的时间随浓度的增加越来越长，这说明虽然k 所受影响不大，但比在没有药物 作用下四膜虫完成生长代谢所需时间长，说明了药物对四膜虫生长代谢的抑制 作用。【c u q h e n ) 3 c 1 2 6 h 2 0 作用与四膜虫的微量热结果与其他三种化合物有很大 的区别，有可能是该种药物与四膜虫的作用方式与其他的药物不同，其具体的 作用机理有待进一步的探讨。 武汉理工大学硕士学位论文 第3 章铜配合物对细菌的生长代谢作用研究 3 1 铜配合物与大肠杆菌生长代谢作用研究 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) ，革兰氏阴性短杆菌，大小0 5 x l 3 微米，周身 鞭毛，能运动，无芽孢，能发酵多种糖类产酸、产气，是一种在人和温血动物 肠道内常见的细菌，归属于埃希氏菌属，是生物学上研究得最彻底的生物之一， 通常作为药理学或毒理学的作用目标微生物。大肠杆菌的特点是易于在实验室 操作、生长迅速，而且营养要求低。大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌、病毒 生长繁殖，为详细研究病毒的性质和复制提供了可能。 微量热法灵敏度高，能准确测定缓慢过程的热效应，与传统方法相比，微 量热法为研究抗菌药物提供了很好的手段。微量热法已用于研究微生物与化学 物质之问的相互作用，己得到许多有用的信息。本节以四种铜化合物为研究对 象，以大肠杆菌为作用目标，通过等温微量热法研究了铜化合物对大肠杆菌的 生长抑制作用。根据生长产热曲线求算了在铜化合物作用下，大肠杆菌生长代 谢的速率常数k ，抑制率，等热动力学参数。 3 1 1 实验部分 3 1 1 1 材料 大肠杆菌( a b 9 1 1 1 2 ) ，由武汉大学典型培养物保藏中心提供。 培养基为肉汤蛋白胨培养基，配方为：n a c l ( 5 9 ) ，牛肉膏( 3 曲，蛋白胨( 1 0 酚，溶 于1 0 0 0 m l 蒸馏水，调至p h - - 7 0 ，1 2 0 c 高压灭菌后备用。 多聚赖氨酸( s i g m a 公司) w a t e rp r op l u s 超纯水器( l a b c o n c oc o 1 a d ) 。 铜化合物的结构见第二章。 3 1 1 2 微量热测试方法 本实验采用瑞典t h e r m o m e t r i ca b 公司生产的8 通道t a ma i r 等温热导式 武汉理工大学硕士学位论文 量热仪( 3 1 1 4 3 2 3 6 t a ma i ri s o t h e r m a lc a l o r i m e t e r ) 。实验时系统控温于3 7 。其 他有关仪器的细节详见文献。 本实验采用安瓿瓶法进行，其基本操作过程是：测量系统获得稳定的基线 后，在2 5 m l 安瓿瓶中，将生长至稳定期的大肠杆菌接种一环5 m l 的培养基中， 再加入一定浓度的铜配合物溶液。将安瓿瓶放入微量量热仪( t a ma i r ) 中，计算 机将自动地记录数据，并绘出相应的热功率曲线。 3 1 1 3 原子力显微镜测试方法 原子力显微镜使用美国m i ( m o l e c u l a rh n a 西n 曲公司的p i c o s c a n 型a f m 仪 器，使用的扫描头扫描范围为3 0 3 0 p a n 2 。采用m a c 模式进行数据采集。针尖 是m i 公司的m a c i e v e rt y p ei i 型，力常数为o 3 5n m ，共振频率为6 9 k h z 。扫 描速度一般控制在1 5 2 0l i n e s s 的范围内进行，图像没有经过过滤处理。所有 图像使用的是2 5 6 2 5 6 的像素。所有实验均在室温下进行。 取两支装有5 m l 培养基接种一环大肠杆菌的试管，一支作为对照，另外一 支加入浓度为0 0 0 1 4 m o l l 的 c u ( p h e n ) 2 c 1 2 6h 2 0 1 0 1 x l ，3 7 。c 摇床上培养8 个小 时，然后将菌液在1 2 0 0 0 9 冷冻离心两分钟，弃上清搜集菌细胞，再将其重新悬 浮于去离子水中，离心两次，得细胞悬液用于成像。 将1 2 x 1 2 m m 2 的盖玻片用p i r a n h a 洗液( 浓h 2 s 0 4 与3 0 1 - 1 2 0 2 的体积比为3 ： 1 ) 浸泡过夜，再用超纯水反复冲洗干净，氮气吹干。然后用取样枪取配制好的 p h = 8 0 ，含1 0 m mt r i s h c i 缓冲的0 5 m g m l 聚赖氨酸溶液2 0 1 l 滴加于清洗好 的盖玻片上，放置1 小时自然干燥，用大量超纯水冲洗干净，n 。吹干备用。再用 取样枪取细菌溶液5 0 1 ，滴加于聚赖氨酸修饰的盖玻片上孵育1 5 m i n 后，用大 量超纯水冲洗，n 2 吹干，用于a f m 成像观察。 3 1 2 实验结果与讨论 3 1 2 1 大肠杆菌的生长产热曲线 武汉理工大学硕士学位论文 图3 13 7 时大肠杆菌生长代谢的产热曲线 大肠杆菌在3 7 的生长代谢曲线如图3 1 所示，从该图中我们可以看出大 肠杆菌存在两个生长峰，这可能是由于细菌某种酶系统的启动，使其在完成第 一生长峰后又进入一个新的生长周期。 图3 2 、3 - 3 、3 4 、3 5 中的曲线分别是大肠杆菌在不同铜化学物浓度的存在 下的前4 ( ) 0 m i n 的第一生长峰的生长产热曲线。在相同的实验条件下，有非常好 的重现性。从图中可以看出，在加入铜配合物之前和之后，大肠杆菌的生长代 谢曲线形状基本一致，但随着加入铜化合物的浓度的增加，大肠杆菌传代时间 延长，生长产热曲线上的停滞期延长，生长峰后移，最大发热功率也随之减小， 说明这四种铜化合物对大肠杆菌均有抑制作用。 图3 23 7 4 c 时大肠杆菌在c u c h 作用下生长代谢的产热曲线 a 0 2m m o l l b 0 4 m m o i l c 1 2m m o l l d 1 6m m o l l e 2 0m m o l l 武汉理工大学硕士学位论文 t ( m i n ) 图3 3 3 7 c 时大肠杆菌在( c g h 6 n o ) 2 c u 作用下生长代谢的产热曲线 丸5 6 “m o 儿b 1 1 2 m o l l c 1 6 8 h m o l l d 2 2 4 p m o l l e 3 3 6 1 n n o l l 图3 43 7 。c 时大肠杆菌在 c u ( p h e n ) 2 c 1 2 6 h 2 0 作用下生长代谢的产热曲线 a 0 3 i i m o l l b 1 4 i l m o l l c 2 8 “m o l l d 5 6 f t m o l l e 1 1 2 p m o l l e1 4 0 肛m o l l 图3 53 74 c 时大肠杆菌在 c u ( p h e n ) 3 c 1 2 6 h 2 0 作用下生长代谢的产热曲线 a 0 3 恤m o l l b 1 4 m o l l c 2 8 i t m o l l d 5 6 斗m o l l e 1 1 2 m o l l 武汉理工大学硕士学位论文 3 1 2 2 大肠杆菌的生长速率常数和传代时间 在细胞的指数生长期，产热功率p 。与速率常数之间有： p t = p o e x p ( k t ) 或l n p t = n p o - t - a( 3 ) 以l np t 对t 作图，用计算机进行线性拟合可得到生长速率常数k 。 同时， 由公式f g = l n 2 k ( 4 ) 可计算出大肠杆菌在不同药物作用下的传代时间t o 、k 及j 的结果如表3 1 所示。 表2 13 7 1 2 大肠杆菌在铜配合物作用下的生物热化学参数值 武汉理工大学硕士学位论文 3 1 2 3 生长速率常数与铜化合物浓度的关系 由图3 6 可见，生长速率常数k 均随着铜化合物浓度的增加而减小。只是化 合物不同，曲线的形状各有所异，说明他们对大肠杆菌生长代谢过程的影响不 同。c u c l 2 的七- c 曲线大致分为三段，浓度较低时，k 随着药物浓度的增大而显 著降低，随着浓度的增加，七曲线变得平缓，说明药物对大肠杆菌的影响减小， 当浓度继续增大，t 随药物浓度增大变化也越来越明显；( c g h 6 n 0 1 1 2 c u 的七曲 线形状与c u c l 2 相似，呈倒s 形，说明这两种化合物与细菌的作用方式相近； i c u ( p h e l l ) 2 】a 2 6 n ：o 和f c u ( p h e n b c l z t 6 h 2 0 的岛曲线基本上呈线性关系，这有 可能与它们结构相近有关。 d 1 旷“哪j 硝1 旷【m m 图3 6 生长速率常数与铜配合物浓度之间的关系 武汉理工大学硕士学位论文 3 1 2 4 最大放热功率与铜化合物浓度的关系 由图3 7 可见，随着铜化合物加入浓度的增大，生长期的最大发热功率只。 减小。c u c l 2 和( c 9 i 州o ) 2 c u 的p m 。曲线都成倒s 形，【c u ( p h c n ) 2 】a 2 6 h 2 0 和 【c u ( p h e n ) 3 c 1 2 6 h 2 0 的只。- c 曲线基本上呈线性关系，这与上面分析的七- c 曲线 规律一致。药物不同，导致了它们与细菌的作用方式有所差别，从而生长特征 常数发生改变，其具体的作用机理有待进一步的探讨研究。 图3 7 最大放热功率与铜配合物浓度之间的关系 3 2 武汉理工大学硕士学位论文 3 1 2 4 原子力显微镜结果分析 一) 正常大肠 二) 加药物后 s c a nr a n g ：2 0 x 2 0 l l m 2s c a l eb a r ：8 0 0 n l n a 2 s c a nr a n g ：6 6 9 i n 2s c a l eb a r ：8 0 0 r i m 武汉理工大学硕士学位论文 a 3b ， s c a nr a n g ：1x1 i _ t m 2s c a l eb a r ：4 0 n m 1 1u l i l 2 的图所对应的3 - d 图形 图3 8 大肠杆菌的原子力显微镜照片 第一列( a 一，a 2 ，a 3 ) 是对照组大肠杆菌在不同扫描区域下的照片。第二列是经 过2 8 x 1 0 m o l l c u ( p h e n ) 2 c 1 2 6 h 2 0 处理的大肠杆菌细胞。 武汉理工大学硕士学位论文 在本研究中，我们通过了a f m 观察了大肠杆菌表面超细微结构。对照组细 胞和经过 c u ( p h c n h c 1 2 6 h 2 0 处理的细胞分别列在图3 7 中。h j - , a 1 ，b 1 可以看出， 加过药物后作用明显，细菌长度明显变短，这可能是药物与细菌酶作用，影响 了细菌的正常的生长代谢，在与对照组相同的培养时间内，生长明显落后于正 常细胞，a 2 ，b 2 为单个细胞，也可看出与上述分析同样的结果；从a 3 ，a 4 可以 看出，对照组大肠杆菌细胞膜在1 1 岬2 区域内是由圆形、椭圆形等大小较一致 的隆起组成，各隆起结构相互靠近彼此间形成缝隙状凹陷，隆起结构饱满、光 滑，排列疏密程度适中，在三维结构上出较好的平整性，而b 3 ，b 4 的结果显示 经过药物作用后细胞表面形态发生了明显的改变，表面隆起及缝隙局部消失， 变得粗糙、凸凹不平，甚至在一些范围内出现了空洞，从三维结构上也可以看 出膜表面起伏较大。这些结果都表明了大肠杆菌经过 c u ( p h c n ) 2 c l z 6 h 2 0 处理之 后，其细胞膜结构已经被破坏，细胞壁和膜通透性增加，细胞质可能流失继而 细菌死亡。其作用机理可能是带正电荷的游离【c u o h e n ) 2 】2 + 和革兰氏阴性菌细胞 膜中的磷脂中带负电荷的多聚酸根结合，引起细胞膜或渗透屏障的破坏，使细 胞膜的通透性增加，导致细胞内磷酸盐、核酸等成分外漏。 3 2 铜配合物与金黄色葡萄球菌生长代谢作用研究 3 2 1 实验部分 3 2 1 1 材料 大肠杆菌( a b 9 1 1 1 2 ) ，由武汉大学典型培养物保藏中心提供。 培养基为肉汤蛋白胨培养基，配方为：n a c i ( 5 曲，牛肉膏( 3 9 ) ，蛋白胨0 0 9 ) ，溶 于1 0 0 0 m l 蒸馏水，调至p h = 7 0 ，1 2 0 高压灭菌后备用。 铜化合物的结构见第二章。 3 2 1 2 仪器及方法 同本章第一节。 武汉理工大学硕士学位论文 3 2 2 实验结果与讨论 3 2 2 1 金黄色葡萄球菌的生长产热曲线 在3 7 * 0 ，用微量热的方法测得了金黄色葡萄球菌生长代谢的热功率曲线， 如图3 9 所示，图3 1 0 、3 1 1 、3 1 2 、3 1 3 中的曲线分别是金黄色葡萄球菌在 不同铜化学物浓度的存在下的生长产热曲线。在相同的实验条件下，有非常好 的重现性。 图3 93 7 。c 时金黄色葡萄球菌生长代谢的产热曲线 图3 1 03 7 * ( 2 时金黄色葡萄球菌在c u c l 2 作用下生长代谢的产热曲线 a 0 4 m m o i l b 0 8 m m o l l c 1 0 m j n o l l d 1 2 m m o l f l e 1 4 m m o i l e1 6 m a n o ! l 武汉理工大学硕士学位论文 图3 1 13 7 时金黄色葡萄球菌在( c o h 6 n o ) 2 c u 作用下生长代谢的产热曲线 a 5 6 1 _ l m o l l b 1 1 2 1 u i m o l l c 1 6 8 p m o l l d 2 2 4 m o l l n m 图3 1 2 3 7 c 时金黄色葡萄球菌在 c u ( p h e n ) 2 c 1 2 6h 2 0 作用下的产热曲线 a1 4 i i m o l lb 5 6 m o l lc 8 4 p , m o l ld 1 1 2 “m o l le 1 4 0 p m o l l 图3 1 3 3 7 。c 1 对大肠杆菌在 c u ( p h e n ) 3 c 1 2 6h 2 0 作用下生长代谢的产热曲线 a 0 3 p m o l l b 1 4 p m o l l c 2 8 m o l l d 5 6 m o l l e 1 1 2 p , m o l l 3 7 武汉理工大学硕士学位论文 3 2 2 2 金黄色葡萄球菌生长速率常数、传代时间和半抑制浓度 在细菌的对数生长期中，产热功率与时间之间存在指数关系，有： i n p t = l n p o + k t ( 3 1 ) 其中p 0 和只分别是细菌在对数生长期初和时间t 时的热输出功率。将对数 生长期的热功率输出p t 、t 值代入式( 3 1 ) 中进行线性拟合，得到金黄色葡萄球菌 在不同浓度药物作用下的生长速率常数k 。同时，由公式t g = l n 2 k 可计算出金黄 色葡萄球菌在不同药物作用下的传代时间。根据抑制率的定义，我们计算了金黄 色葡萄球菌在不同浓度药物作用下的抑制率l 金黄色葡萄球菌在不同浓度铜化 合物作用下的热动力学参数如表3 2 。 表3 23 7 。c 时金黄色葡萄球菌在不同铜化合物不同浓度下生长的热动力学参数 3 8 武汉理工大学硕士学位论文 3 2 2 3 生长速率常数与铜化合物浓度的关系 不同浓度铜化合物对金黄色葡萄球菌的生长代谢影响程度不同，为了更直观 地比较金黄色葡萄球菌在不同铜化合物作用下的生长速率常数k 的变化与化合 物浓度的关系，根据表3 2 的数据作图，如图3 1 4 所示。从图中可以看出，不 同铜化合物作用于金黄色葡萄球菌，其生长速率常数与铜化合物浓度的关系也 不同。总的来说，金黄色葡萄球菌的生长速率常数随铜化合物的浓度增加而减 小。c u a 2 在所观察的浓度范围内的k - c 曲线分为两段，在0 1 2 m m o l l 范围内， 七曲线有着较好的线性关系，随着浓度继续升高，七曲线出现折点，k 随c 的 增加变化不是很明显。( c g h 6 n o ) 2 c u 在所观察的浓度范 图3 1 4 生长速率常数与铜配合物浓度之间的关系 武汉理工大学硕士学位论文 围内七曲线也分为两段，跟c u c l 2 不同的是，前面变化缓慢后一段变化明显。 c u ( p h c n ) 2 】c 1 2 6 h 2 0 在浓度为1 4 x 1 0 6 m o l l 时观察到刺激现象， c u ( p h e n ) 3 c 1 2 - 6 h 2 0 在浓度为5 6 1 0 m o l l 同样也观察到该现象，说明这两种 配合物对金黄色葡萄球菌的生长有可能起刺激作用。不同铜化合物浓度与生长 速率关系不同，说明它们与金黄色葡萄球菌细胞内的作用机制也不同。 3 2 2 4 最大放热功率与铜化合物浓度的关系 由图3 1 5 可见，随着铜化合物j i a 浓度的增大，生长期的最大发热功率r 。 减小。细菌生长的最大放热功率代表了细菌进行生长代谢的能力a 药物不同， 导致了它们与细菌的作用方式有所差别，从而生长特征常数发生改变，其具体 的作用机理有待进一步的探讨研究。 图3 1 5 最大放热功率与铜配合物浓度之间的关系 4 0 武汉理工大学硕士学位论文 3 3 不同铜化合物结构与活性的关系小结 通常认为，决定毒性水平的主要因素为药物在细胞中的作用模型、作用位点 数以及与被作用体的亲和力。据报道，金属离子进入生物体到达靶部位之前， 要通过各种屏障，例如细胞壁或细胞膜等，物质所带的电荷越小，亲脂性越强， 它就越容易透过生物膜。许多证据表明，药物的亲水亲脂性对药物吸收有很大 的影响。药物通常是通过被动扩散被吸收，而被动扩散的驱动力为脂双层两边 的药物浓度梯度。因此，药物被吸收在水中需要一定的溶解度。生物膜主要由 脂组成，药物要通过磷脂双分子层同时也需要有一定的亲l 旨性。对于那些不溶 于水或水溶性很小的药物都不容易被吸收。一般来说。药物的活性随药物脂溶 性增加而增大。本章所得的结果基本符合这一规律。 本章第一节研究的是药物作用下大肠杆菌的生长代谢规律，第二节研究的 是在药