发光的大肠杆菌PPT课件.pptx

发光的大肠杆菌,朱静宇张明石卉,.,制备感受态细胞,质粒扩增,质粒酶切,目的基因序列扩增,连接,转化,实验方案概述,.,材料,大肠杆菌少量PET28质粒（既为原核质粒又为真核质粒）显示绿色荧光的PEGFP-N3质粒（为真核质粒）,.,制备大肠杆菌感受态细胞,挑取E.coil单菌落接种至2mlSOC培养液，37摇床过夜。挑取0.51ml过夜培养的菌液转种到50mlSOB中，18剧烈震荡，直至A600达到0.6，取出水浴10min44000rpm/min10min.同时冰浴配置TB溶液。弃上清，倒置离心管于滤纸上1mlTB溶液打散菌体沉淀，再加入15mlTB溶液冰浴10-15min。44000rpm/min10min去上清，沉淀重悬于4mlTB中，冰浴10min加入280uLDMSO,混合均匀，冰浴10min分装于EP管中，-80或液氮保存检测感受态细胞的质量（阴性对照）,.,质粒扩增,pet28的质粒扩增,PEGFP-N3质粒扩增,摇菌,转化,提质粒,.,转化,取100ul感受态细胞于冰浴上融化加入1ulpet28质粒和1ulPEGFP-N3质粒，轻轻吹匀，冰浴30min将菌液放入42C水浴热激90s，立即放入冰浴中2min将菌液2000rmp/min离心3min，留200ul上清液将菌体打散，均匀涂布于含卡那抗性的琼脂平板，平板于37C倒置培养过夜。同时进行阳性和阴性对照,.,摇菌+提质粒,将培养过夜的平板取出，用已灭菌的枪尖挑取平板上单个的较大的菌落将移液枪尖打入5ml培养基内，放入37C摇床中rpm/min,摇菌16小时左右运用Omega等品牌的试剂盒对菌液进行小提用浓度为1%的胶，120V20min，用10000的marker做对照验证测浓度,.,质粒的酶切,寻找pet28和pegfp-n3的酶切位点,.,质粒的酶切（两个质粒同时酶切）,确定的酶切位点：EcorRI、XbaI,内切酶：NotI、BamHI内切酶Buffer：cutsmart,37温育4hours,未酶切的质粒作对照，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果,纯化,.,01,02,03,04,05,06,设计引物,PEGFP-N3目的基因扩增,PCR,电泳,胶回收,纯化,测序,.,PEGFP-N3目的基因EGF的PCR引物,PEGFPN55TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG3PEGFPN35GTCGCCGTCCAGCTCGACCA3,Primer2Tm68.5CMolecularweight6863.5g/molExtinctioncoeficient181100.0l/(molcm),Primer#1Tm57.6CMolecularweight6863.5g/molExtinctioncoeficient229700.0l/(molcm)SXJ,.,PCR体系,premix体系,TakaRaTaqdNTPmixturePCRbuffer,PCR反应条件,循环35次,.,02,01,03,加入样品与buffer,混匀，短暂离心,孵育223h,连接,.,01,02,03,04,05,质粒的转化,感受态细胞冰浴融化,加入质粒，混匀，冰浴,菌液热激90s后冰浴2min,加SOD，37摇菌,2000rpm/min3min涂布