（微生物与生化药学专业论文）米多霉素产生菌的诱变育种和原生质体的融合研究.pdf

摘要 摘要 新型核苷类农用抗生素米多霉素( m i l d i o m y e i n ，m i l ) 对各种植物的粉 状霉菌有强烈的拮抗作用，著具有很低的毒性。本文对米多霉素生产菌的诱 变育种和原生质体融合进行了较系统的研究，其中包括米多霉素筛选方法、 诱变育种、原生质体制各、融合和再生工艺以及原生质体诱变育种的研究。 l 、建立了米多霉素产生菌的初筛和复筛方法，采用了以红酵母为敏感菌的 琼脂块法生物测定法，并与高效液相色谱的精确测定法进行了对比。 2 ) 开展了米多霉素高产菌的诱变育种。利用物理化学诱变，根据米多霉素 生物合成途径选用代谢类似物抗性筛选，进行米多霉素高产菌的选育。 最终筛选到高产菌d 一6 2 2 和z d 5 1 9 ，在较优化工艺条件下米多霉素的摇 瓶发酵产量达到了1 0 3 4m g l ，z d 5 1 9 则达到了6 9 8m g l ，分别比原始 菌株提高了2 7 5 和1 9 倍。 3 ) 完成了米多霉素产生菌的原生质体制各和再生工艺研究，制备浓度达到1 10 8 个m l ，再生率达5 7 4 。 4 ) 进行了米多霉素产生菌的原生质体融合育种的研究，其中双亲热灭活和 紫外火活的原生质体融合，融合率达到5 2 。筛选得到的米多霉素高产 菌5 1 1 9 在较优化工艺条件下摇瓶发酵产量达到1 0 3 5m g l ，比出发菌株 z d 5 1 9 提高了4 5 。 5 1 初步进行了米多霉素产生菌原生质体诱变育种的研究，筛选得到的米多 霉素高产菌5 1 1 9 在较优化工艺条件下摇瓶发酵产量达到1 3 9 5m e i 。 关键词：米多霉素，诱变育种，原生质体，融合 a b s t r a c t m i l d i o m y c i n ，an e wn u c l e o s i d ea n t i b i o t i c ，s h o w e dr e m a r k a b l eb i o l o g i c a l a c t i v i t ya g a i n s tp o w d e r ym i l d e w so fm a n yp l a n t sw i t hl o wt o x i c i t y as y s t e m a t i c i n v e s t i g a t i o nw a sc a r r i e do u tt oi m p r o v et h em i l d i o m y c i n p r o d u c i n gs t r a i nb y u s i n go fm u t a t i o nb r e e d i n g ，p r o t o p l a s tf u s i o nt e c h n i q u e ，i nw h i c h ，m u t a t i o n b r e e d i n g ，p r e s c r e e n i n g a n dr e s c r e e n i n g m e t h o d s ，p r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n d r e g e n e r a t i o n p r o t o p l a s tf u s i o na n dp r o t o p l a s tm u t a t i o nw e r ea d o p t e df o rh i 曲 m i l d i o m y c i n - p r o d u c i n gs t r a i n sb r e e d i n g 1 ) p r e s c r e e n i n ga n dr e s c r e e n i n gm e t h o d so fm i l d i o m y c i nw e r ed e v e l o p e d t h e r a p i dd e t e r m i n a t i o nm e t h o dc a l l e da g a r - b l o c kw a sa d o p t e dw i t hr h o d o t o r u l a s p a st h et e s tm i c r o o r g a n i s ma n dt h ec o m p a r i s o n so ft h i sm e t h o dw i t h c o n v e n t i o n a lh p l cm e t h o ds h o w e dt h ec o n s i s t e n tr e s u l t s 2 ) a m u t a n tb r e e d i n gp r o c e d u r eo f m i l d i o m y c i n p r o d u i c n gs t r a i nw a sd e v e l o p e d a c c o r d i n g t ot h es u g g e s t e db i o s y n t h e s i s p a t h w a yo fm i l d i o m y c i n h i g h p r o d u c i n gm u t a n t sw e r es e l e c t e dw i t ht h er a t i o n a lb r e e d i n gt e c h n o q u ea f t e r p h y s i c a la n dc h e m i c a lm u t a t i o n t w os t r a i n s ，d 6 2 2a n dz d 519 ，w e r e o b t a i n e dw h i c hc o u l dp r o d u c e10 3 4m g la n d6 9 8m g lm i l d i o m y c i n ，w h i c h w e r ef o u ra n dt w ot i m e sh i g h e rt h a nt h a to ft h e o r i g i n s t r a i nz d 615 r e s p e c t i v e l y 3 ) p r o t o p l a s ts e p a r a t i o n a n dr e g e n e r a t i o n t e c h n i q u ew a se s t a b l i s h e d a n d p r o t o p l a s tf o r m a t i o nc o n c e n t r a t i o nw a sr e a c h e dt o1 10 8 m la n d5 7 4 p r o t o p l a s tr e g e n e r a t i o nw a so b t a i n e d 4 ) t h ef u s i o no f b i p a r e n t a li n a c t i v a t e dp r o t o p l a s t sw a ss t u d i e d a n d5 2 f u s i o n r a t i ow a sa c h i e v e d o n eh i g h e s tp r o d u c e r , 5 1 1 9 ，c o u l dp r o d u c e1 0 3 5m g l m i l d i o m y c i n ，a b o u t4 5 h i g h e rt h a nt h a to f t h eo r i g i ns t r a i n ， 5 ) w i t h p r e l i m i n a r ys t u d y o n p r o t o p l a s t m u t a t i o n b r e e d i n g o f m i l d i o m y c i n p r o d u c i n gs t r a i n ，o n eh i g h e s tp r o d u c e r , 5 1 - 1 9 + w a so b t a i n e dt h e m i l d i o m y c i np r o d u c t i v i t yo f13 9 5m g m k e y w o r d s ：m i l d i l m y c i n ，m u t a t i o nb r e e d i n g ，p r o t o p l a s t ，f u s i o n i i 第一章文献综述 1 1 前言 第一章文献综述 t a k a s h i1 w a s a 等人于1 9 7 3 年从新几内亚的土壤中分离出的放线菌 s t r e p t o v e r t i c i l l i u mr i m o f l t c i e n sb 9 8 8 9 1 的培养液中提取到一种新型的核苷类抗 生素。试验表明，这种物质能够强烈抑制白粉菌，对大麦白粉病有显著的药 效。源于这一特殊的生物学特性，科研人员把它命名为m i l d i o m y c i n ( 米多霉 素，m i l ) l l j 。 除了米多霉素外，仅多氧菌素对粉霉病也有根治作用。米多霉素对环境 污染小，制备条件温和，能耗低，是一种符合我国可持续发展战略要求的抗 生素产品，具有广阔的市场前景。 1 2 米多霉素的研究概况和市场前景 1 2 1 米多霉素的生物功效 米多霉素对格兰氏阳性及阴性菌，致植物病真菌和一些酵母显示弱的抑 制活性，而对各种粉霉的q i 长具有强烈的抑制活性，在3 1 2 6 2 5 p p m 浓度 下在温室栽培实验中它能很好地控制大麦粉霉病( 如表1 1 ) ，同时对动物的 急性毒性实验表明米多霉素是低毒性的，因此被用作抗粉霉剂与除虫剂。 嵌1 1 米多霉素对大麦白粉病的作用【2 】 t a b l e1 1i n h i b i t o r ye f f e c to fm i l d i o m y c i no np o w d e r ym i l d e w so fb a r l e y c h e m i c a l sc o n c e n t r a t i o n p e r c e n ta r e ao fl e s i o n s ( ) ( a i p p m )6 t h l e a r9 t h l e a f a $bcbc m i l d i o m y c i n 15 60 42 10 82 31 0 5 3 1 2 0 32 o 1 3 0 31 3 6 2 5o 10 100 50 4 b e n o m v lw p $ $ 1 2 5o 3 0 4 o _ 21 31 6 c o n t r 0 18 41 0 01 0 06 8 51 0 0 + a ：i od a y sa f t e rt h ef i r s ts p r a yw h i c hw a sc a r d e do u to n6 - l e a f s t a g eb a r l e yp l a n t s 第一章文献综述 1 1 前言 第一章文献综述 t a k a s h i1 w a s a 等人于1 9 7 3 年从新几内亚的土壤中分离出的放线菌 s t r e p t a v e r t i c i l l i u mr i m o f a e i e n sb 9 8 8 9 1 的培养液中提取到一种新型的核苷类抗 生素。试验表明，这种物质能够强烈抑制白粉菌，对人麦白粉病有显著的药 效。源于这一特殊的生物学特性，科研人员把它命名为m i l d i o m y c i n ( 米多霉 素，m i i ) 忆 除了米多霉素外，仅多氰菌素对粉霉病也有根治作用。米多霉素刘环境 污染小，制各条什温和，能耗低，是一种符合我国可持绩发展战略要求的抗 牛素产品，具有广词的一丁场前景 1 2 米多霉素的研究概况和市场前景 l - 2 1 米多霉素的牛物功效 米多霉素对格兰氏阳性及阴性菌，致植物病真菌和一些酵母显不弱的抑 制活性，而对各种粉霉的生长具有强烈的抑制活性，在3 i 2 6 2 5 p p m 浓度 下在温室裁培文验中它能很好地控制大麦粉霉病( 如表1 i ) ，同时对动物的 急性毒性实验表明米多霉素是低毒性的，因此被用作抗粉霉剂与除虫剂。 急性毒性实验表明米多霉素是低毒性的，因此被用作抗粉霉剂与除虫荆。 嵌1 1 米多霉素对大壶白粉病的作用【2 1 t a b l e l 1 i n h i b i t o r ye f f e c t o f m i l d i o m y c i no n p o w d e r y m i l d e w ao f b a r l e y c h e m j e a l sc o n c c n t r a t i o np e r c e n ta r e ao f l e s i o n s ( ) ( a i p p m )6 t h l e a f9 t h l e a f a 丰bcbc m i l d i o m y c i n 1 5 60 42 10 g231 0 5 3 1 20 32 o1 3 o _ 31 3 6 2501010 05o 4 b e n o m v 】w p 幸幸1 2 5030402131 6 c o n t r 0 1841 0 01 0 06 8 51 0 0 4 a ：1 0d a y sa 1 1 e r t h e f i r s ls p r a y w h i c h w a sc a r r i e d o u t o i l6 - l e a f s t a g eb a r l e yp l a n t s 第一章文献综述 b ：1 0d a y sa f t e rt h es e c o n ds p r a y c ：1 0d a y sa f t e rt h et h i r ds p r a y 4 + b e n o m y l m e t h y l1 - ( b u t y l c a r b a m o y l ) - 2 一b e n z i m i d a z o l e c a r b a m a t e ) w e t t a b l ep o w d e r 1 2 2 米多霉素的市场分析 白粉病是由粉状霉菌引起的一种植物叶面疾病，在世界范围分布很广， 对多种植物有极大的危害，是农业及林业生产中重点控制病种口1 。白粉病主 要发生在植物的叶、茎和果实上，造成叶面破裂、坏死，引起落叶，降低光 合作用，使果实变小；在花期感染病菌可造成落果、果实锈病( 褐斑) 或作 物大量减产( 可高达5 0 ) 。在我国小麦白粉病现象比较普遍( 如图1 1 ) ， 从7 0 年代以来小麦白粉病在我国大部分地区都有发生，对我国农业造成的减 产损失很大。 图1 1 中国小麦白粉病气候分区图 f i g 1 1d i s t r i b u t i o no f w h e a tp o w d e r ym i l d e w si nc h i n a 另外白粉病的发生受气候条件的影响很大，如风、温度、湿度、叶片活 动情况和日照时间等，其中温度的影响最大【4 】。因此，当环境条件适宜时， 有可能大面积集中爆发，此时危害更大。目前普遍使用的控制方法是使用硫 和其他化学农药杀菌剂( 脱甲基抑制剂，苯并眯脞类内吸杀菌剂 b e n z i m i d a z o l e s ，固醇生物合成抑制剂等) 5 1o 重复大量使用化学农药，一是 第一章文献综述 因为化学农药不是环境相容性的，会造成严重的环境污染；二是使得白粉菌 已经产生抗性，而且大多数抗性菌株可存活几年，继续使用同样的药剂会进 一步加强耐药性。因此，需要新的作用方式，开发新品种来控制自粉病。 米多霉素是一种新型的农用抗生素，能够安全高效地控制和根治植物白 粉病的发生。与化学农药相比，米多霉素具有无可比拟的优势。首先，它的 作用浓度小，对人畜安全，对各种植物的粉状霉菌有很好的抑制作用，可用 作高效抗粉霉剂与除虫剂。其次，米多霉素作为新发现的抗生素，粉状霉菌 尚未对它产生抗性，且米多霉素的很多衍生物具有更高药效和抵抗致病菌抗 药性的潜力。因此，米多霉素在农业上的应用前景将非常广阔。 1 3 米多霉素的性质 1 3 1 米多霉素结构性质【6 1 一般名：米多霉素( m i l d i o m y c i n ) 。 化学名：( 2 r ，4 r ) 一2 - ( 2 r ，5 s ，6 s ) 一2 一( 4 - a m i n o 一1 ，2 一d i h y d r o - 5 一h y d r o x y m e t h y l 一2 - o x o p y r i m i d i n 一1 一y 1 ) 一5 ，6 一d i h y d r o - 5 一l - s e r y l a m i n o 一2 h - p y r a n - 6 一y 1 一5 - g u a n i d i n o 一2 ，4 一d i h y o x y v a l e r i ca c i d 。 结构式：米多霉素的结构式如图1 2 所示。 o h “2 7 - - n h 2i n h - - c h i c - - c h2 ii h i h o c c o o h n h 2 f h o c h cc h g o 也一n n m 、 c h2 0 h 图1 2 米多霉素结构式 f i g 1 2m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f m i l d i o m y c i n 分了式：c 1 9 h 3 0 n 8 0 9 分子量： 5 1 4 5 0 外观：白色吸湿性粉末 第幸文献综述 溶解性：易溶于水，微溶于甲醇、乙醇，略溶于吡啶、二甲基亚砜、二 甲基乙酰胺、二氧六环及四氢呋喃，不溶于乙酸乙酯、( 二) 乙醚。 稳定性： 基本特征 弱酸性一中性中稳定，强酸及强碱下不稳定，常光下稳定：用 2 n 的h c l 水解米多霉素2 小时得到5 一羟甲基胞嘧啶和l 一丝氨 酸：用o 2 n 的n a o h 水解2 小时得到氨和一种含脲基化合物。 熔点3 0 0o cd a j k ，比旋光度为 a 召= + 1 0 0 。，各基团p k a 值 分别为2 8 ( - c o o 一) 、4 2 ( 3 - n h + = ) 、7 2 ( 2 _ n h 3 + ) 、 1 2 ( 胍基) 。 特征颜色反应：米多霉素显示阳性的反应有s a k a g u c h i ( 坂口反应) ， g r e i b l e a b a c k ，k m n 0 4 和茚三酮试剂等。 米多霉素是。种水溶性的碱性抗生素。结构式中嘧啶环上的r 基团可以 是氢、卤素、小分子的烷基或羟甲基，构成了一系列米多霉素衍生物盯l 。通 常，r 基为羟甲基时，称为米多霉素( 如图1 2 ) 。米多霉素含有5 一羟甲基胞 嘧啶( 5 一h y d r o x y m e t h l c y o i n e ，h m c ) 结构，含一个胍基基团，因而具有强 碱性【8 】。 1 3 2 米多霉素的毒理性质 将米多霉素对大白鼠( r a t ) 和小白鼠( m o u s e ) 分别进行静脉注射和皮 下注射，急性毒性试验表明，皮下和静脉注射的半数致死剂量( l d 5 0 ) 为 5 0 0 1 0 0 0 m g k g ：经u 的半数致死剂量为2 5 - 5 0 9 k g 。在为期1 0 天的观测期 间，浓度为1 ，0 0 0 p p m 的米多霉素浴液对大白兔的角膜和皮肤均无刺激现象； 在7 天时间内，2 0 p p m 的米多霉素对鲻鱼无明显的毒性效应【8 l 。进一步利用 大白鼠及小白鼠作米多霉素粉剂及5 5 水溶液各种途经下的急性毒性实验。 实验表明，使用米多霉素粉剂时，自鼠在经口、皮下、腹腔及静脉内注入等 情况下自发运输能力低下，在蹲着及伏卧等姿势下呈现中毒症状，另外白鼠 在除经口投入以外的注入方式下均出现血尿现象，但未见其它的中毒现象， 而经皮注入方式下几乎未见任何异常。以上各种方式下的实验动物不论死亡 还是生存经解剖均未见器官异常；使用米多霉素5 5 溶液情况下，白鼠的经 第一章文献综述 口及经皮投入方式下均未见中毒症状，解剖也未见异常6 | 。根据实验结果发 现，米多霉素水溶剂对人体及动物的毒副作用非常小，因而米多霉素是一种 绿色环保的生物农药。 1 4 米多霉素产生茵的诱变育种和突变株筛选 1 4 1 米多霉素产生菌的诱变育种方法 野生菌株积累产物的能力往往很低，无法满足工业生产的要求，因而必 须对野生菌进行遗传育种，获得高产的突变菌株，以达到工业生产的目的。 工业微生物遗传育种的基本方法有：自然选育、诱变育种、杂交育种、 代谢控制育种、基因工程育种等。 从工业育种发展史上，可以看出，诱变育种是最主要和最基础的育种手 段，但它仍有一定的盲目性。在关于米多霉素高产菌株选育的文献报道中， 主要仍采取诱变育种的方法得到米多霉素高产菌株。 1 4 1 1 紫外线诱变法9 1 紫外线诱变法足微生物育种中最常用和比较有效的诱变剂之一。其诱发 突变的机理是：引起d n a 的移码及染色体的畸变：引起d n a 与蛋白质交联； 引起胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用；使d n a 链断裂；形成嘧啶二聚体。 紫外线的有效光谱为2 0 0 3 0 0 n m ，最有效的是2 5 3 7 n m 。因为d n a 强烈 吸收2 5 3 7 n m 光谱而引起突变。就紫外灯而言，3 0 w 的光谱分布范围广，诱 变效率差；1 5 w 紫外灯，8 0 集中在2 5 3 7 r i m ，诱变效应好。 在紫外诱变处理后，必须经过避光处理。因为d n a 经紫外线照射后形 成嘧啶二聚体，光复活酶和二聚体结合形成一复合物。当复合物暴露在可见 光下，酶即活化并将二聚体分解成单体，酶被释放，使d n a 链的缺口修复 而恢复正常的d n a 双链结构。该种现象称为光修复。文献报道最适紫外线 剂量为：紫外灯1 5 w ，距离3 0 c m ，照射8 0 s 。 1 4 1 2n t g 诱变法9 3 e 第一章义献综述 n 一甲基一n 一硝基一n 一亚硝基胍( n t g ) 是一种烷化剂，由于其突出 的诱变效果，被称为“超诱变剂”。其作用机制为：通过烷化基团使d n a 分 子。卜的碱基或磷酸部分发生烷化作用，d n a 复制时导致碱基配对错误而引起 突变；引起d n a 分子中磷酸和糖之间的共价键发生断裂；使两个鸟嘌呤n 一7 位点形成共价键：一般双功能烷化剂易引起d n a 双链间的交联，形成变异 或死亡；可能造成染色体畸变。 n t g 的化学性质活泼，不太稳定，水溶液中易水解，半衰期短。应用棕 色瓶盛药，并放在干燥器中，冰箱保存。配制时要用一定范围的缓冲液，现 配现用。 n t g 杀菌率低、诱变效应高，实际使用时可以低浓度较长时间处理，从 而获得较高的突变率。文献报道的最适n t g 处理量为1 0 m g m l ，2 8 。c ，9 0 r a i n 。 1 4 1 3d e s 诱变法9 】 与n t g 一样，硫酸二乙酯( d e s ) 也是一种烷化剂。它有两个不稳定的 烷基( c z h 5 ) ，这些烷基能移到电子密度较高的其他分子中去，这种通过烷基 置换其它分子的氢原子的作用，叫做烷化作用。d e s 就是通过这种烷化作用 而改变基凶的分子结构，从而造成基因突变。 1 4 2 突变菌株筛选方法 文献【】报导采取使用选择性培养条件从随机突变株中筛选优化菌株的方 法。 米多霉素含有5 一羟甲基胞嘧啶( h m c ) 结构，而h m c 是米多霉素生物 合成的限制性前体，因此，培养过程中强化h m c 的生物合成将可能促进米 多霉素产量提高。 氨基喋呤( a m i n o p t e r i n ) 对米多霉素的组成部分5 一羟甲基胞嘧啶( h m c ) 的生成有抑制作用，但对s t r e p t o v e r t i c i l l i u mr i m o f a c i e n s 菌株的生长无影响。 这特性可用在高产菌的筛选上。不受h m c 生物合成抑制剂氨基喋呤影响 的菌株就可能是米多霉素的高产菌株。高产菌株能在h m c 生物合成抑制剂 第一章文献综述 氨基喋呤存在时仍能正常生长并生产米多霉素。 将氨基喋呤抗性菌株分离纯化，即词得到所需的目标菌株。 最大的h m c 合成活性发生在发酵3 天时，然后急剧下降。米多霉素的 生物合成与酶的开始合成同步。用坂口反应测得的发酵后期米多霉素量比用 高效液相色谱( h p l c ) 大。说明发酵后期可能有米多霉素类似物生成。 氨基喋呤在1 0i ag m l 时对米多霉素的生产有极大的抑制作用，但对菌种 生长无影响。如同时加入h m c 则抑制作用会减弱。这说明了氨基喋呤抑制 米多霉素的合成主要通过抑制h m c 的合成来实现。氨基喋呤也有可能由其 它途径对米多霉素的生成有轻微的抑制，因为即使在h m c 存在时仍有部分 抑制。 具体操作为：将诱变后的菌种涂布到含氨基喋呤( 1 0 u g m 1 ) 培养基上， 长出菌落后，用打孔器取出，移植到敏感菌红酵母检测培养基上，观察抑菌 圈的大小，判断米多霉素的产量。 另外，文献还报道了用药物抗性菌落富集突变株的方法。检测碱基类似 物，氨基酸类似物，抗生素对菌株的最小抑制浓度。结果发现，低浓度的环 丝氨酸抑制菌体生长，并导致高频的形态突变。这些菌落表现出小同的形念， 甚至菌株移植在不含环丝氨酸斜面培养基上形态也不会改变，不同形态菌落 的米多霉素产量有很大的彳i 同。因此，可以用环丝氨酸筛选突变株。用诱变 剂处理菌株后，将合适的孢子接种到含环丝氨酸( 3 0 4 0ug m 1 ) 的斜面培养 基上。经过两星期，2 8 的培养，培养基上出现了为数不多的菌落，大部分 菌落不生成气丝与孢子。环丝氨酸本身能使d n a 裂解随后d n a 在生长过程 中进行修复。在3 0l - tg m l 的环丝氨酸浓度下仍有约1 0 0 个能产气丝菌落生长。 这些用环丝氨酸筛选的菌株米多霉素产量在1 0 u g m l 氨基喋呤存在下用琼脂 块法测定。结果，c 。r 一1 8 突变株被筛选出来了。它能在氨基喋呤存在时高 产米多霉素，且米多霉素的产量达到了5 1 m d m l 。 然后，用l 一刀豆氨酸抗性菌株继续筛选以提高米多霉素类精氨酸部分的 生物合成活性。用同样的方法，在含1 8 0 pg m l 的刀豆氨酸培养基上得到了 第一章文献综述 火约1 0 0 个菌落，最高的米多霉素产量达到了8 m g m l 。最终得到的一株优秀 菌株，c v r - 4 8 ，米多霉素产量为出发菌株的2 6 倍。 1 5 米多霉素发酵工艺研究 1 5 1 米多霉素生物合成机理 日本的k a t s u m i t s u 等人研究推测了米多霉素的生物合成机理( 如 图1 - 3 ) ，发现细胞内丝氨酸( s e r i n e ) 、精氨酸( a r g i n i n e ) 和5 一羟甲基胞嘧啶 的含量能够促进米多霉素的产量，通过深入的实验研究，推测出米多霉素在 生物体内的合成途径。 a u c o s e p e p ：p h o s p h o e n o l p y r u v a t e ；o a a ：o x a l o a c e t a t e ；2 k g ：2 - k e t c x ：j l u t a r a t e ；r 5 p ：r i b o s e - 5 - p h o s p h a t e ； p r p p ：p h o s p h o r i b o s y l p y r o p h o s p h a t e ；c a r b a r n o y i - p ：c a r b o m o y l p h o s p h a t e ( 1 ) g l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e ；( 2 ) a s p a r t a t ea m i n o t r a n s f e r a s e ；( 3 ) g l u t a m i n es y n t h a s e 图1 3 可能的米多霉素生物合成途径 f i g 1 3p o s s i b l es y n t h e t i cp a t h w a yo f m i l d i o m y c i n 1 5 2 米多霉素发酵过程影响因素研究 1 , 5 2 1f e “对米多霉素发酵的影响 h 3 2 使用不i 司的有机氮源( 玉米浆、黄豆粉、棉籽粉、蛋白胨、麦麸粉) 发 酵米多霉素，发现所有氮源都能大大促进细胞生长，但仅玉米浆加入基本培 养基时中能显著提高米多霉素的产量。通过对玉米浆四种主要成分核酸、金 属离子、维生素和氨基酸的研究，发现促进米多霉素合成的有效成分主要是 第一章文献综述 圈一、 、 图1 4f e 2 + 对米多霉素生物合成作用的町能机理 f i g 1 4m e c h a n i s mo f f 一+ o nt h es y n t h e s i so f m i l d i o m y c i n 比较含f e 2 + 与不含f e 2 + 基本培养基中细胞生长与米多霉素的产量，发现 亚铁离子对细胞生长与葡萄糖消耗几乎无影响。然而，比较可见，含f e ”基 本培养基与不含f e 2 + 基本培养基在米多霉素生产与氨基氮消耗上有显著不 同。在含f e 2 + 的例子中，氨基氮的消耗量非常大，并伴随米多霉素的大量生 成，其米多霉素产量是不含f e ”的4 倍。 卜述现象可以作如卜解释： 因为氨基氮的消耗往往与氨基酸的合成有关，如在g l u 、g l n 、a l a 等氨 基酸的生产中均有氨基氮大量消耗的现象。在米多霉素的生产中，也有此现 象，说明米多霉素的产生可能伴随着氨基酸的代谢。在含f e 2 + 环境中，胞外 肽酶活力在4 天时达到最大，随后迅速下降，而蛋白酶活力持续上升，在1 0 天时达到最大。在不含f e 2 + 环境中，胞外肽酶活力与蛋白酶活力维持在低水 平上，几乎不随时间变化。这些酶活的变化可能可以解释含f e 2 + 时氨基氮快 速消耗的原因。 f e 2 + 只影响米多霉素的生物合成。在f e 2 + 为8ug m l 时获得最高的米多霉 素浓度，但f e ”存在与否儿乎不影响细胞浓度。 f e 2 + 的加入时间对米多霉素的发酵有明显的影响。只有在发酵2 4 h 时加 入f e ”才有明显的作用，此时的细胞正处于对数生长期的早期，米多霉素尚 第一幸文献综述 未开始合成。然而，9 6 h 后加入亚铁离子不会再对合成米多霉素产生促进作 用。上述发现说明f e 2 + 离子摄入与米多霉素产量之问有密切的联系。经过对 数生长期，细胞几乎摄入了所有的f e ”。 培养基中的f e 2 + 总量在4 天时达到最低。这一周期分别与对数生长期后 期及细胞停止生长时间一致。因此，f e 2 + 的摄取与细胞生长有关。仅当种子 有强烈的f e 2 + 摄取能力时加入亚铁离子，才能提高氨基氮的消耗与实现米多 霉素产量的大幅提高。 1 5 2 2p 0 4 * 离子对米多霉素发酵的影n l a j 1 2 p 0 4 3 + 在米多霉素发酵生产中主要与f e 2 + 协同作用。在f e 2 + 存在时，加入 适量的无机磷会提高胞外的a t p 量，但在不加f e 2 + 时，无此现象。在f e 2 + 存 在时，磷酸酶活力明显上升。在f e 2 + 浓度为8 1 0 “g m l 时，磷酸酶活力最人。 在f e 2 + 浓度同定为1 0 1 1g m l 时，作7 5 ，1 0 0 ，1 5 0 u g m l 的磷酸盐浓度梯度， 发现1 0 0ug m l 为最适量，此时米多霉素的产量为7 5 m g m 1 因为磷酸盐在一天内消耗完毕而氨基氮不再消耗，所以，采用流加p o 。3 + 的方法，在4 天时开始流加，流加速率为1 0 l ag m l h r 。此时米多霉素的产量 达到了9 m g m l 。采用上述方法，胞外a t p 的浓度比未加p 0 。3 + 时提高了一倍 多，而胞外a t p 的浓度将直接影响氨基氮的耗量。f e 2 + 与p 0 4 3 + 存米多霉素发 酵中的作用如图1 5 所示。 n 了夕4 3 。 提高胞外a t p 量 氨基氮消耗 + 米多霉素的生物合成 图1 5f e “与p 0 4 3 + 在米多霉素发酵中的作用 f i g 1 5e f f e c to ff e 2 + a n dp 0 4 3 + o nm i l d i o m y e i nf e r m e n t a t i o n 1 5 2 3 前体对米多霉素发酵的影响 在培养基中添加n 甲基化合物能大大提高米多霉素的产量。n 一甲基化合 物是指那些至少含有1 个氮原子，其分子中替代了1 4 个甲基团。其中三甲 第一章文献综述 胺、卵磷脂、胆碱、甜菜碱和四甲铵这些物质作为前体加入培养基中对米多 霉素的产量有较好的提高。 表1 2 前体对米多霉素产量的影响 t a b l e1 2e f f e c to f p r e c u r s o r so rm i l d i o m y c i np r o d u c t i v i t y 前体二甲基 无胆碱甜菜碱卵磷脂三甲胺四甲胺 ( 7 m m ) 二丙稀 m i l 产量 1 0 01 8 71 8 61 6 11 7 51 8 71 7 0 相对值 表1 3 胆碱对米多霉素产量的影响 t a b l e1 3e f f e c to f c h o l i n eo i lm i l d i o m y c i np r o d u c t i v i t y 胆碱加入量( m m ) 0o3 51 4 03 51 403 5 07 00 m i l 产量相对值 1 0 01 1 31 3 31 8 01 9 32 0 02 0 0 培养基中n 甲基化合物的浓度范围最高不应超过其能抑制所选微生物 生长的浓度，最低一般高于3 m m 。浓度范围易在4m m 2 0 0m m ，如在7m m 一5 0 m m 范围内则更好。 1 5 3 小型发酵罐上米多霉素发酵研究 根据摇瓶发酵的结果，k a t s u m i t s uk i s h i m o t o 等人于1 9 9 7 年对米多霉素 工业化生产工艺进行了研究。结果发现，与摇瓶发酵情况相比，使用5 l 的发 酵罐( 装液量2 5 l ) 进行米多霉素发酵生产过程中，糖的消耗速度更快，米 多霉素的产量约为摇瓶条件下的6 0 。在摇瓶培养过程中，菌体多以菌丝球 形式存在，其中直径o 3 0 7 m m 的菌丝球约占总数的7 0 ；与此相对，发酵 罐中0 3 0 7 m m 的菌丝球只有8 。菌体粒径不同，培养液的流动特性、溶氧 浓度也有所不同，进而影响到葡萄糖的消耗速度，最终导致米多霉素产量的 偏差。 为了在摇瓶中再现通氧搅拌培养的菌体特性，研究人员在2 0 0 m l 的摇瓶 中投入个玻璃球( 巾4 9 m m ) 、经回转振荡培养，结果出现了培养出的菌体 第一章文献综述 特征及培养特性与5 l 发酵罐中的相似。摄氧速度及好氧性与发酵罐中培养情 况下相似，米多霉素的生产量也减少了约6 0 ，与发酵罐中的产量几乎一样 【l4 1 。说明米多霉素产生菌对剪切力十分敏感。 通气搅拌培养的另一个特征是氨基氮消耗率低，米多霉素产量低下。通 气搅拌培养虽然促进了糖的消耗，但氨基氮消耗的停滞可能是因为糖代谢后 的菌体内能量产生效率比烧瓶中的低，从而导致氨基氮化合所需的体内能量 不足。实验事实证明注入磷酸能增加菌体内a t p 从而加速氨基氮消耗【i “。向 投入玻璃球的摇瓶中注入磷酸盐能够促进氨基氮的消耗，提高米多霉素的生 产率。在注入磷酸盐为前提下使用5 l 发酵罐判定大量生产所需的最适宜条 件，磷酸最适宜的注入速度为1 0ug m l d 。以搅拌动力及溶氧浓度为指标， 实现了由5 l 发酵罐到2 0 0 l 、6 m 3 、1 2 0 m 3 发酵罐的规模扩大。1 2 0 m 3 罐中培 养的米多霉素的产率为7 2 m g m l 。 f3 0 l 发酵液陋呓王型l 坐塑虹旦迎旦墨业笪号- i ! 划4 5 l 滤液毕l 适堂! 芰驾。 絮凝“ 2 0 l a 骘3 1 生! 墅垦! 壁选堕，l 洗脱液 尘业塑堡堕王堕! 生! 罐垫! 攀 或同体积同浓度j 醇洗脱l o 或a m b e r l i t ec g 5 0 ( 6 l ，h + ) 翌堡i ! ! 选l 洗脱液l 型! 垄笪- jo 4 l 浓缩液p 型坐盟三塾二至二墼翌一沉淀 。过滤。过滤“ 图l 6 米多霉素提取流程 f i g , 1 6s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o np r o c e s so f m i l d i o m y c i n 1 6 米多霉素分离纯化的研究 日本学者在他们报道的的专利中1 7 3 6 ，建立了比较可行的提取流程。该流 程较初始的提取方法而苦比较简化，省略了好几步过程，有利于提高产品的 收率。本实验室在文献研究的基础上，进一步优化了米多霉素的提取工艺( 见 图1 6 ) ，使得米多霉素经过吸附，洗脱和脱色，总收率为7 0 左右，粗品纯 度约8 0 1 7 。 第一章文献综述 1 7 米多霉素检测方法 文献报道的米多霉素的检测方法主要有：坂口反应法、生物效价检测法、 i 奇效液相色谱( h p l c ) 法三种。 1 7 1 坂口反应法 坂口反应原是精氨酸的特征反应，由胍基与c 【一萘酚、n a c i o 生成红色物 质。它由日本人坂口于1 9 2 5 年发现。由于米多霉素中含有胍基，因而能用坂 口反应对它进行定性及定量分析。 坂口反应显色很慢，且对胍基有破坏。但用次溴酸钠代替次氯酸钠后， 显色儿乎在瞬间进行，但褪色很快( 1 0 分钟内褪尽) 。然而，显色后立即加 尿素能稳定颜色。它能使精氨酸，甲基胍显色，但对肌氨酸肌氨酸酐，胍， 尿素等无反应。 改进的坂口反应操作方法为： 1 1 耿5 m l m i l 待测样置于冰浴中，稳定。 2 1 依次加入l m l1 0 的n a o h 和l m lo 0 2 c t 萘酚，稳定2 3 分钟。 3 ) 加入2 0 0 u l 新鲜配制的次溴酸钠，快速摇匀，使显色充分，快速加入l m l 4 0 的尿素，摇匀。 4 ) 1 0 分钟内，在5 0 0 n m 下测其吸光值。 1 7 2 米多霉素的生物效价检测法 因为米多霉素具有抑制真菌的特性，因此可以利用该特点来进行生物活 性测定。 米多霉素仅对少数的真菌及细菌有抑制作用。而对绝大多数g r a m + 、 g r a m 一细菌，酵母，腐生真菌，和皮霉藓菌均无明显的抑制作用。在对1 4 0 0 株不唰菌株的米多霉素敏感性实验中，发现了2 l 株红酵母对米多霉素有较高 的敏感性( 米多霉索浓度为1 0 8 0j a g m 1 ) ，其抑菌圈直径均达到了2 0 m m 以上。 第章文献综述 其中，r h o d o t o r u l ar u b r ai f o0 8 7 0 在米多霉素浓度为5 0ug m l 时抑菌圈直径 达8 0 n u n r ”1 。 1 7 3 米多霉素的高效液相色谱测赳2 0 因为发酵液中精氨酸的干扰，坂口反应法很可能存在相当的误差。因此， 必须采用高效液相色谱等检测手段作为精确测定的方法。与坂口反应比较， h p l c 法有耗时多，对仪器要求高的缺点。但其精确度高，可以排除干扰， 分析可靠。在实验中，可用作最终对米多霉素定量的方法。 文献报道米多霉素可用h p l c 分析，先由阳离子交换树脂2 6 1 0 ( 2 1 m m x 4 1 5 m m ) 预处理，除去大部分的色素与培养残液。采用的色谱条件： 流速o 7 m l m i n ，压力1 2 0 k g c m 2 g 。 反相高效液相色谱：寻找合适的h p l c 体系分析米多霉素、米多霉素衍 生物及米多霉素母核的前体物质5 一羟甲基胞嘧啶，发现含2 5 柠檬酸缓冲液 ( o 0 0 5m ，p h 5 8 ) 的流动相能使样品进样量和峰高获得最佳的相关性旧i 。 离子交换色谱：米多霉素在水溶液中处于阳离子状态，因此可以用离子 交换h p l c 来定量分析。研究报道了一种应用离子交换树脂填料的h p l c 方 法。色谱柱填料为阳离子交换捌艏2 6 1 0 ( 2 1 n u n x 4 1 5 m m ) ；流动相为o 3m 硼酸盐缓冲液( 以氢氧化锂调p h 为8 8 ) ，流速为o 7 m l m i n ；压力为 1 2 0 k g c m 2 ；检测波长为2 5 4 n m 。这种方法不仅可以定量分析米多霉素，而且 米多霉素的各种衍生物在合适的条件下出峰时间不同，因此在研究米多霉素 衍生物性质时，该方法比较可行。 1 8 原生质体制备，融合，再生研究 1 8 1 原生质体的制备和再生研究 原生质体是细胞去除了坚韧细胞壁后对渗透压极为敏感的球质体，最外 层是裸露的细胞质膜。失去了细胞壁的原生质体，染色体d n a 在诱变剂作 用下，更易引起死亡突变，敏感性提高。菌种的敏感性