（分析化学专业论文）基于溶胶凝胶电化学生物传感器的研究.pdf

复旦大学硕士学位论文 摘要 摘要 生物传感器是一门涉及化学、生物学、物理学、医学、电子技术等领域的交 叉学科。在各种固定方法制作的传感器中，结合溶胶凝胶技术研制的酶传感器 已经引起了极大的关注。众多研究结果表明，以硅为基质的溶胶一凝胶是一种非 常理想的固定材料。本文使用表面带正电荷的三氧化二铝溶胶凝胶固定几种生 物分子制备成酶传感器，研究其电化学性质。同时又尝试采用二氧化锆溶胶凝 ， 胶固定介体及酶，初步探讨其固定条件及传感器的电化学性质。( 论文包括以下五 部分内容： 一概述溶胶凝胶技术及其在生物传感器中的应用 从以下几个方面对该领域研究概况进行评述 ( 1 ) 生物传感器的发展概况 ( 2 ) 溶胶凝胶固定的机理 ( 3 ) 溶胶凝胶传感器的发展及展望 ( 4 ) 本论文工作的目的与意义 二三氧化二铝溶胶凝胶固定过氧化氢酶介体过氧化氢传感器 本文研究了种新型的过氧化氢传感器，用a 1 2 0 3 溶胶一凝胶将过氧化氢酶和 亚甲基蓝固定到玻碳电极上，电子扫描显微镜观察固定膜的结构，循环伏安及相 关的电化学测量表明：与酶共同固定的亚甲基蓝仍具有很好的稳定性，并在酶和 电极之间起到了很好的电子传递作用。研究了过氧化氢在电极上的电催化作用， p h 值的影响。传感器具有较好的选择性，三个星期内仍保持较好稳定性。 三三氧化二铝溶胶。凝胶固定辣根过氧化物酶介体过氧化氢传感器 三氧化二铝溶胶凝胶将辣根过氧化物酶及硫堇固定在玻碳电极上，紫外可 见光谱表明在纯酶以及固定化酶在4 1 0 r i m 处均有吸收并能催化过氧化氢还原， 说明固定化酶保持较好的生物活性。该传感器在p h 7 0 ，2 5 ，外加电压为一0 2 2 v 时响应较好，在过氧化氢浓度为1 7 6 1 0 - 35 5 1 0 五m o l l 的范围内呈线形，在 信噪比为3 时，检出限为1 1 1 0 4 m o l l ，电极的选择性较好，电极使用三个星 期后，仍能保持其响应活性的8 0 。 复旦大学颁士学位论文 摘要 四三氧化二铝溶胶凝胶固定微生物膜传感器 将酵母菌固定在溶胶一凝胶的网状结构中形成微生物膜，修饰在氧电极上制成 新型b o d 生物传感器，该传感器制作简便，响应快速，结果与五日工作法测试 的b o d 值相符，形成微生物膜的时间为1 5 分钟，响应时间为2 0 分钟，在b o d 值1 0 - 5 0 m g l 范围内呈线性，b o d 的重现性为1 0 ，室温下b o d 生物传感器的 寿命超过3 0 天。 五二氧化锆溶胶凝胶固定辣根过氧化物酶的过氧化氢传感器 初次采用二氧化锆溶胶一凝胶固定过氧化物酶，分别固定在经电聚及溶胶凝 胶固定硫堇修饰的电极上制作成过氧化氢传感器。研究该传感器的电镜形貌、电 化学活性、园二色性和红外活性证明二氧化锆溶胶凝胶可以很好地固定酶，保 持其生物活性、电化学活性。该方法成膜速度快，固定条件简单，对过氧化氢响 应灵敏、迅速( 响应时间1 秒钟) ，线形范围大，提高了传感器室温下响应的线 性、稳定性和重现性。、刁 关键词：三氧化二铝溶胶凝胶二氧化锆溶胶凝胶生物传感器 l 复旦大学顾士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t b i o s e n s o r sh a v ed e v e l o p e dt ob eaf r o n t i e ra n d n e w l y i n t e r d i s c i p l i n a r yi n c l u d i n g c h e m i s t r y , b i o l o g y , p h y s i c s ，m e d i c a ls c i e n c ea n de l e c t r o n i c ss i n c et h ed e v e l o p m e n t o f t h ef i r s tb i o s e n s o ri n1 9 6 7 av e r y i m p o r t a n tf a c t o r i n e n z y m e b a s e d e l e c t r o d e d e v e l o p m e n t i st h ei m m o b i l i z a t i o no f e n z y m e s a m o n gt h em e t h o d s ，s o l g e lp r o c e s s h a sb e c o m ea na t t r a c t i v ea v e n u ef o rt h ei m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l ei nc o n n e c t i o n w i t ht h ed e v e l o p m e n to fn e wb i o s e n s o r s ，o fw h i c hs is o l g e lh a sb e e n p r o v e d t ob ea e x c e l l e n tm a t e r i a lf o re n z y m ei m m o b i l i z a t i o n i nt h i st h e s i s ，w eh a v ee m p l o y e dan e w a 1 2 0 3s o l g e ld e r i v e db i o s e n s o r sa n dt r i e dt os t u d yt h ep r o p e r t i e so fz r 0 2s o l g e l d e r i v e db i o s e n s o n 1 i n t r o d u c t i o no f s o l - g e lp r o c e s sa n ds o l - g e lm a t e r i a l sf o rb i o s e n s o r s ar e v i e wo n s o l - g e lp r o c e s sa n di t sa p p l i c a t i o ni n b i o s e n s o r si s p r e s e n t e d a s p e c t s d e t a i lr e v i e w e di n c l u d e ( 1 ) b r i e f i n t r o d u c t i o no f b i o s e n s o r sa n di m m o b i l i z a t i o n s ， ( 2 ) m e c h a n i s mo f s o l g e lp r o c e s sf o rb i o s e n s o r s ， f 3 ) d e v e l o p m e n t a n df i e n do f s o l g e ld e r i v e db i o s e n s o r ( 4 ) c o n c l u s i o no f t h i st h e s i s 2 a n a m p e r o m e r t i c b i o s e n s o rf o r h y d r o g e np e r o x i d a s e b a s e do nt h e c o - i m m o b i l i z a t i o no fc a t a l a s ea n dm e t h y l e n eb l u ei na ua 1 2 0 3s o l - g e lm o d i f i e d e l e c t r o d e an o v e lb i o s e n s o rf o rt h ea m p e r o m e t r i cd e t e c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d ew a s d e v e l o p e db a s e d o nt h ec o - i m m o b i l i z a t i o no fc a t a l a s ea n dm e t h y l e n eb l u eo na n a 1 2 0 3s o l g e lf a b r i c a t e dg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e t h es t r u c t u r eo ft h em e m b r a n eo f t h e s o l g e l i m m o b i l i z e d c a t a l a s ea n dm e t h y l e n eb l u ew a ss t u d i e dw i t hs c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y c y c l i c v o l t a m m e t r y a n d a m p e r o m e t r i c m e a s u r e m e n t s d e m o n s t r a t e dt h a tm e t h y l e n eb l u ec o - i m m o b i l i z e dw i t hc a t a l a s ei nt h i sw a yd i s p l a y e d g o o ds t a b i l i t ya n dc o u l de f f i c i e n t l ys h u t t l ee l e c t r o nb e t w e e n t h ei m m o b i l i z e de n z y m e 【 复旦大学颂士学位论文a b s t r a c t a n dt h ee l e c t r o d e e l e c t r o c a t a l y t i cr e d u c t i o no f h 2 0 2 w i t hr e s p e c tt os o l u t i o np h ，o p e r a t i n gp o t e n t i a la n d s t a b i ea tl e a s tf o r3w e e k s a tt h ee l e c t r o d ew a se v a l u a t e d s e l e c t i v i t y t h eb i o s e n s o rw a s 3 a 1 2 0 3s o l g e ld e r i v e dh y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o r h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ew a ss e l e c t e da sam o d e le n z y m et of a b r i c a t ean o v e l b i o s e n s o rb a s e do nt h ec o i m m o b i l i z a t i o no ft h i o n i n e t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n e n z y m ea n ds o l g e lw a sf u r t h e rs t u d i e db yu v v i ss p e c t r u m ，w h i c hs h o w e dt h a t s o l g e l d i dn o ta f f e c tt h eb i o a c t i v i t yo ft h ee n z y m e t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r e p h 7 0 ，2 5 * c ，t h ea p p l i e dp o t e n t i a lw a s - 0 2 2 v t h eb i o s e n s o r h a daf a s tr e s p o n s ew i t h a l i n e a rc a l i b r a t i o nr a n g eo f l 7 6 1 0 - 3 5 5 1 0 。m o l l w i t h t h ed e t e c t i o n l i m i to f t h e b i o s e n s o rw a s1 1 10 4m o l l t h es e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t yo ft h eb i o s e n s o rw a s i d e a l t h eb i o s e n s o rr e m a i n e d8 0 o f i t s a c t i v i t ya f t e rt h r e ew e e k s 4 a 1 2 0 3s o l - g e li m m o b i l i z e db i o s e n s o r f o rb o dd e t e r m i n a t i o n an o v e lb o db i o s e n s o rf a b r i c a t e dw i t ht h em i c r o b i a lm e m b r a n eo na no x y g e n e l e c t r o d ew a si n t r o d u c e d b yu s i n gp o r o u sa 1 2 0 3s o l g e li n o r g a n i c m a t r i xt o i m m o b i l i z et h ey e a s t ，w h i c hi sc o n v e n i e n t ，r a p i d ，c o r r e l a t i n gt ot h er e s u l t so fb o d 5 a n dc o u l db e e m p l o y e d f o rc o m m e r c i a l a v a i l a b i l i t y i nt h ef u t u r e t h e i n d u c e d i n c u b a t i o nt e c h n i q u ew a su s e dt oo b t a i nh i g ha c t i v ey e a s t ，a n dt h i sp o i n t e s p e c i a l l yc o n t r i b u t e d t oh i g h e rs e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t y t h eg e l a t i o nt i m et of o r m m i c r o o r g a n i s m sm e m b r a n e w a sl e s st h a n15m i n u t e s t h et y p i c a lr e s p o n s et i m ew a s l e s st h a n2 0 m i n t h er e s p o n s ew a so b t a i n e dw i t hal i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e s e n s o rc u r r e n ta n dt h eb o d v a l u er a n g i n gf r o m1 0 5 0m 班t h er e p r o d u c i b i l i t yo f b o de s t i m a t i o nw a sl e s st h a n1 0 t h el i f e t i m eo f b o d b i o s e n s o rw a so v e r3 0d a y s u n d e ra m b i e n t t e m p e r a t u r e 5 z r o zs o l g e ld e r i v e dh y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o r an o v e lh 2 0 2b i o s e n s o rh a sb e e nd e v e l o p e db a s e do nt h ec o i m m o b i l i z a t i o no f h r pa n dt h i o n i n ei nz r 0 2s o l g e lm e m b r a n eo nt h ec a r b o ng l a s s ye l e c t r o d e i th a s b e e nf o u n dt h a tz r 0 2s 0 1 g e l i s p e r f e c t l y b e n e f i c i a lt ot h eh r pi m m o b i l i z a t i o n ， b e c a u s ei tn o to n l yp o s s e s s e dt h eg e n e r a la d v a n t a g e s o fs o l g e l ，b u ta l s oi sa n e f f 色c t i v ed r o m o t e ro ft h eb i o s e n s o r t h es t o c k ys u r f a c ea r e a ，p o r o u sm o r p h o l o g y a n d f 塑塑堕生兰垡坚 坐! 型 h y d r o p h i l i cp r o p e r t yo ft h es o l g e lm a t r i xr e s u l ti n h i g he n z y m el o a d i n g ，a n dt h e e n z y m ee n t r a p p e di nt h i sm a t r i xr e t a i n si t s a c t i v i t yt oal a r g ee x t e n t t h eb i o s e n s o r w a s q u i c k ，s e n s i t i v ea n dr e m a i n e d9 0 a c t i v i t ya f t e r3 0d a y s k e yw o r d s ：a 1 2 0 3s o l g e l ，z r 0 2s o l g e l ，b i o s e n s o r 1 1 1 复旦大学硕士学位论文 第一章溶胶一凝胶技术及其在生物传感器方面的应用 第一章溶胶凝胶技术及其在生物传感器方面的应用 第一节生物传感器的发展概况 生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗 透成长起来的新学科，这种交叉学科在理论上和技术上均有许多新的问题要进行 探索和开发，在应用上则有极为宽广的领域有待开拓。 基于电化学、光学、热学或压电晶体等不同类型的生物传感器，其探头均由 两个主要部分组成：感应器，由对被测定的物质( 底物) 具有高选择性分子识别 功能的膜构成；转换器，它能把膜上进行生化反应中消耗或生成的化学物质，或 产生的光、热等转化为电信号，最后把所得的电信号经电子技术的处理后，在仪 器上显示或记录下来。其中，起生化换能器作用的生物敏感膜又称分子识别元件， 是生物传感器的关键部分，同时也是传感器进行选择性检测的基础。其所含生物 元素可以是酶、组织、细菌、酵母、抗体抗原、脂质体、类脂质体及受体。生 物传感器按其分子识别元件，可分为酶传感器、免疫传感器、组织传感器、微生 物传感器、细胞传感器等。 在上述的生物传感器当中，研究和应用最多的是酶传感器。这种将酶作为电 极结合试剂的概念是1 9 6 2 年由c l a r k 和l y o n s t l l 建立，他们提出可以通过检测酶 催化反应所消耗的氧来测定葡萄糖的含量。u p d i k e 和h i c k s t 2 l 报道了在极谱氧电 极表面采用聚丙烯酰胺膜固定葡萄糖氧化酶的第一支酶电极，它可以通过检测酶 反应的产物过氧化氢来测定葡萄糖。继这些开创性的工作之后，在酶电极和生物 传感器方面每年均有大量的工作发表，涉及到反应池的设计和几何学、固定化方 法、能识别的功能性膜的组成、电极的表面构象等。根据酶与电极间电子转移的 机理，大致可将生物传感器分为三代：采用酶的天然介体氧的催化原理设计制 作的酶传感器为第一代生物传感器；第二代生物传感器将人工合成的媒介体掺入 酶层中，改进了分析参数并简化了处理步骤，能进行无试剂测量；第三代生物传 感器是指在无媒介体存在下，利用酶与电极间的直接电子转移制作的酶传感器， 也有人认为第三代传感器包括传感体中的电子信号处理、微型化与多功能传感。 一直以来，生物传感器引起的巨大关注长盛不衰，相当多的公司与研究单位开展 皇羔苎兰塑型苎! 堡兰垫 兰二里塑鉴：鳖堕垫查墨苎垄生塑堡堕墨查画堕窒旦 了生物传感器的研究与开发，相关的文章和专利也急剧增加【3 15 1 。 第二节生物传感器中生物识别分子的固定化 早期的生物活性物质测量法，如酶分析法，是在水溶液状态下进行的。由于 酶在水溶液中一般不太稳定，且酶只能和底物作用一次，因此，使用起来很不方 便。要使酶作为更稳定生物敏感膜形式存在且能多次重复使用，就必须研究如何 将酶固定在各种载体上。将具有分子识别能力的生物功能物质，如酶、抗原、抗 体等，包藏或吸附于某些高分子材料、生物高分子材料或无机材料内制备成感应 器，这称为生物功能物质的固定化。这是生物传感器的研究和开发中最为重要的 工作。为了研制廉价、灵敏度高、选择性好、寿命长的生物传感器，固定化技术 已成为国内外许多研究组竞相研究和探索的目标。经过近2 0 年来的不断工作， 已经建立了对各种不同的分子功能物质的固定化方法，主要包括夹心法，吸附法， 包埋法，共价键合法，交联法，如图1 1 所示。 器瓣 爿( d ) ，k r _ 誓潮、 f i g1 1 酶的固定方法 ( a ) 夹心法，( b ) 吸附法，( c ) 包埋法，( d ) 共价键，( e ) 交联法 这些固定方法的主要特点归纳如下： f 1 ) 吸附法 是一种较为简单的固定化技术。物理吸附具有无需化学试剂、活化和清洗步 骤少、生物组分不易降解、对生物活性影响小等优点。但它对溶液的p h 变化、 温度、离子强度和电极基底较为敏感，需对实验条件进行优化，且生物组分易从 电极表面脱落，生物组分的寿命较短。 ( 2 、共价键法 物娜 皇皇苎羔竺坠苎：! 燮一笙= 皇鳖堕：堂鉴塾查墨壁垄生塑生壁璺查雯堕壁旦 通过共价键与电极表面结合将生物物质固定的方法，要求低温( o ) 、低离 子强度和生理p h 条件，缺点是需加底物防止生物物质活性部位与电极表面发生 键合。该方法因稳定而被广泛应用。 ( 3 ) 聚合物包埋法 将生物分子或细胞包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构中，对生物 活性影响小，膜的孔径和几何形状可控，包埋的物质不泄漏，可固定高浓度的活 性生物组分，可结合其它固定化技术如共价键或交联进一步改进包埋的稳定性。 但该技术采用物理方法将聚合物限制到电极表面，使传感器难以微型化。 ( 交联法 采用双功能团试剂，在生物分子之间、生物分子与聚合物之间交联成网状结 构，该方法的局限是膜的形成条件不易确定，需控制p h 、离子强度、温度及反 应时间。 第三节溶胶凝胶固定方法原理 以上几种生物活性物质的固定方法，物理吸附稳定性较差，被吸附物质容易 脱落；共价连接往往导致蛋白质结构的改变及酶活力下降n 6 】；聚合高分子在溶剂 中经过长时间的浸泡发生溶胀，会导致检测信号漂移。溶胶凝胶作为一种以无 机多孔材料为载体的新型材料，具有许多高分子材料无法比拟的特性，如物理刚 性，化学惰性，溶剂中可以忽略的溶胀性，对光、化学、热和生物降解的高稳定 性 1 7 - 1 9 ) ，实验条件温和，适用范围广泛，包埋于溶胶凝胶中的生物物质可以保 持较高的生物活性和特异性，小分子物质可通过溶胶凝胶的孔道与生物物质接 触。另外，溶胶凝胶的孔径大小具有一定的可调性1 2 0 1 ，进一步提高了生物化学 反应的选择性，使之在生物传感器的研制中广受重视。 溶胶。凝胶法是将金属醇盐等原料配制成均质溶液，在饱和条件下经水解凝 聚等化学反应，生成物聚集成溶胶，再经蒸发干燥转变为凝胶，在低温下制备纳 米粉末或多孔玻璃的一种技术 1 7 , 2 1 1 。 溶胶凝胶过程包括溶胶的形成( s 0 1 ) 、溶胶的凝胶化为湿凝胶( g e l ) 和湿 凝胶的干燥等几个步骤眦2 2 2 3 。 ( 1 1 水解、缩合而成溶胶 复邑大学颂士学位论文 第一奄溶胶凝胶技术及其在生物传感器方面的应用 溶胶凝胶技术用分子量低的金属烷氧基化合物m ( o r ) x ，m 为s i 、a i 、t i 等金属：r 为甲基、乙基、异丙基等，作为前体分子( p r e c u r s o r ) 和水反应。由 于硅氧烷和水不互溶，通常加入相应的醇作为共溶剂。溶胶形成的化学反应有三 种类型：酯的水解、硅羟基之间的缩合、硅羟基与酯的缩合。以正硅酸甲酯 ( t m o s ) 为例，发生水解反应： s i ( 0 c h 3 ) 4 + x h 2 0 s i ( o h ) 4 ( o c h 3 ) 4 。+ x c h 3 0 h ， 缩聚反应：一s i o h + r o s i 一s i o s i 一+ r o h 一s i o h + h o - s i 一一s i 一0 一s i 一十h 2 0 ( 2 ) 凝胶化 在缩聚的初始阶段，胶体粒子表面负电荷之间的排斥作用使胶粒稳定。但随 着水解和聚合过程的进行，水被消耗。溶剂蒸发，胶粒浓度随之增大，使这种稳 定作用减弱从而发生凝胶化。 ( 3 ) 干燥和陈化 在凝胶化的最后阶段，随着水和溶剂的挥发，毛细管力使凝胶网络聚集而 发生收缩。此时往往会发生凝胶的干裂，h e n c h 等【2 4 】建议在溶胶凝胶过程中加 入一些表面活性剂如t r i t o n x 以防止这种现象发生。乙醇能使生物分子变性而导 致活性降低，甲醇的极性和水相近，在甲醇溶液中的生物分子失活程度比在乙醇 溶液中小得多，因而在进行生物分子包埋时，通常选择甲醇为共溶剂，t m o s 为 前体分子。最近改进的不用共溶剂而用超声分散的方法能够使前体分子和水充分 混合，进一步克服了溶剂的影响【2 5 】。t m o s 和水的反应是惰性的，酸催化可以 加速反应的进行，但高酸性不利于生物分子的稳定存在。解决这一问题的途径是 先将水解得到的溶胶和缓冲溶液混合并调至合适的酸度，再将生物活性物质与其 混合均匀，从而既可以防止生物活性物质的失活，也可以控制凝胶化的速度。 溶胶一凝胶过程可简单概括为图1 2 f 2 6 ，2 。 第四节溶胶凝胶包埋蛋白质分子 在陈化步骤时，将待固定的生物组分如酶、蛋白质、微生物等加入到凝胶中， 待干燥后，生物组分就被有序地包埋在凝胶的网状结构之中。图1 3 是生物组分 有序地在溶胶凝胶中的整个过程2 8 。3 0 1 。 皇兰苎苎塑坠兰型塑垒墨一一 笙二里塑堕：塑堕垫查墨基垄圭塑堡堕塑立堕塑壁璺 e l l e r b y 等口”最先利用溶胶一凝胶法包埋蛋白质，通过溶胶凝胶过程成功地将 细胞色素c ( c y t c ) 、铜锌超氧化物歧化酶( c u z n s o d ) 、肌红蛋白( m b ) 包 埋于透明的二氧化硅溶胶一凝胶中，并研究其生物活性。血红素蛋白( h e m e p r o t e i n ) 具有特征的光谱性质和对n o 、c o 、0 2 等小分子的键合能力，成为近 年来研究溶胶凝胶法包埋对蛋白质性质影响的主要代表化合物3 2 1 。 h y d r o l y s i s 唧f l i + l f l d _ + u c o h k + x r o h m - 乳m 札b7 x “ l 一m 一州+ 的一一_ - - m 0 - - 1 l f if 一m 一埘+ h o - - h m - - o - - i ill p o l y c o n d e n s a t i o n x c 一 一。一 一，+ t 一 一。一 一，。 f i g1 2s t e p so f s o l g e jp r o c e s s t r o h 一+ i 棚 对肌红蛋白和血红蛋白( h b ) 的光谱研究表明，包埋于溶胶一凝胶中的蛋白 质的吸收光谱与水溶液中的基本相同。处于孔道中的蛋白质仍具有对小分子如 ( n o 、c o 、o z ) 的键合能力，键合后的u v v i s 光谱形状和位置也与在水溶液 中的基本一致f 3 3 ，3 引。 利用这些性质制备的传感器用以检测溶解于水中的氧分子，检测的精度可达 到1 0 缶m o l l 数量级，响应时间在几分钟之内【3 5 ，3 6 】。研究结果表明，在溶胶凝胶 中h b 与氧分子的键合作用是非协同性的，且蛋白质的四元结构在包埋时被固定 f 3 7 】。w u 等 3 8 】比较了水溶液中和包埋于溶胶凝胶中的c y t c ，m b 和h b 催化氧 化二苯基噻吩的反应。结果表明，包埋后的蛋白质的催化效率几乎和溶液中的相 同。由于固定于二氧化硅溶胶凝胶中的蛋白质容易和溶液分离且可重复利用， 因而它更有可能成为实用的生物催化剂。在对蛋白质的稳定性研究中发现，包埋 于溶胶。凝胶中的蛋白质的耐热性和耐酸性都比在溶液中有所提高，酸诱导构型 变化的速率也比溶液中的低f 3 9 1 。更有意义的是，q i n 4 0 1 等的研究显示，包埋于溶 胶凝胶中的f e m b 和f e c y t c 能够氧化c o 为c 0 2 ，首次得到血红素蛋白形成 望墨尘苎墅生兰兰垡丝l 一塑二里堕堕：塑鉴垫查壁茎垄皇塑堡壁竖塑堕箜查旦 f e c 0 2 加合物的光谱证据。 f i g1 3 溶胶凝胶固定生物组分过程。r = a l k y lg r o u p ；r 1 = s p e c i a lf u n c t i o n a l i t y ( a m i n o a c y l f e r r o c e n y l ，g l u c o r y l ，e t c ) 包埋于溶胶一凝胶中的c y t c 不仅具有和溶液中相同的光学光谱及对小分子 0 2 、c o 和n o 等的键合能力【4 卜4 3 1 ，而且包埋也未对其结构产生显著的影响。 s h e n t 2 5 1 等利用u v v i s ，圆二色性和共振喇曼等光谱手段系统研究了包埋于溶胶- 复旦大学颁仁学位论文 第一章溶胶一凝胶技术及其在生物传感器方面的应用 凝胶中的f e c y t c 和z n c y t c 。结果表明，溶胶凝胶包埋只对c y t c 的多肽骨 架有轻微的影响，而血红素基团未受到扰动。l i n 等4 1 】在室温下测定的e s r 信号 表明，只有在一1 0 0 。c 以下测定才能得到满意的结果。包埋于溶胶一凝胶中的c y t c 耐热性增加，酸诱导构型变化的p h 与溶液中不同【3 2 】，且能抵抗由醇引起的蛋白 质失活| 4 “。 溶胶一凝胶包埋蛋白质的另外一个例子是对细菌视紫红质( b r ) 的固定。该 蛋白质存在于h a l o b a c t e r i u mh o l o b i u m 细菌的紫膜中。当有光线照射时，蛋白质 的构型发生变化，导致质子从细胞质向外进行跨膜运送，由此产生的膜的内外 p h 梯度作为a d p 合成a t p 时的质子推动力。k o y a m a 等【4 3 1 利用这一性质将b r 固定于不同的底物上以设计光电装置。w u l 4 4 ，4 5 1 等用溶胶一凝胶将b r 固定。研究 表明，包埋于溶胶凝胶中的b r 能保持其光敏性和质子传递能力。另外还发现， 掺有b r 的溶胶凝胶能吸收和释放一些离子。 第五节溶胶一凝胶生物传感器 溶胶一凝胶材料的诸多优势，如合成简便、孔径可调、低温包埋、化学惰性、 透光性好、非溶胀性、机械稳定性，保证了这种材料在发展化学传感器和生物传 感器中可占有一席2 _ t 地1 1 8 ，2 2 , 4 6 1 。由于硅的良好的透光性，基于其溶胶凝胶过程 的传感器已经被制作成光敏性设备。溶胶凝胶过程和材料本身的多变性使得它 在电化学设备的制作方面也提供了非常有用的信息。 在溶胶- 凝胶应用于生物传感器时，通常在形成溶胶凝胶时加入生物元素， 并混合均匀。随着硅烷聚合物链的形成，生物分子被无机氧化物构成的载体包埋。 多孔的溶胶一凝胶载体能够支持生物试剂，并与待分析物在同相中相互作用。由 于溶胶凝胶制备过程由几个重要过程参数决定，如作为前体分子的金属烷氧基 化合物、水和硅的摩尔比、p h 值、溶剂、催化剂、温度等，这些参数影响了水 解、凝聚的速度，从而能够控制最终产物的纳米结构和微米结构。这种控制在防 止被包埋的生物分子渗透，调节待分析物和生物分子平衡过程中起到了至关重要 的作用。渗透的程度取决于孔径和生物分子的大小。尽管传统的溶胶凝胶合成 过程需要很极端的p h 值和大量的醇，可能损害生物分子活性部分，但经过改良 后的合成条件相对温和了许多，从而对生物传感器不会造成任何损害。 垄兰羔兰堂生竺苎；! 鲨 笙二垦鲨鉴：竖堕垫查垦些垄皇塑堡些竖立堕堕壁旦 一、溶胶- 凝胶电化学生物传感器 对溶胶一凝胶制作的安培型电化学生物传感器的有关报道均基于两个基本过 程：生物陶瓷复合物及生物修饰( 见图13 ) 。 f i g 1 3e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r sb a s e do n ( a ) t a i l o r i n gt h ee l e c t r o d e s o l u t i o ni n t e r f a c e ，o r ( b ) m a n i p u l a t i n gt h ee l e c t r o d ei n t e r i o r mi st h em o d i f y i n ge n t i t y 1 复合生物电极 溶胶一凝胶制作的电极在设计安培型电化学生物传感器方面发挥了有利的作 用m 4 8 1 o l e v l 4 7 1 研究组首先报道将酶和碳糊均匀分散到溶胶凝胶溶液中，该 方法可得到牢固、多孔、具导电性的生物复合物，它可以浇铸成玻璃管或做成圆 盘形状。由碳粉和硅溶胶凝胶形成的生物复合物不仅能保持被包埋的生物大分 子的活性，还可以通过简单的抛光步骤得以更新，反复使用。为减少响应时间， o l e v i 4 8 以v 2 0 s 溶胶凝胶制备了导电薄膜，由于四价态的钒离子有很好的电子 导电性，并且膜对铂和其它基底附着力强，因而适用于作为活性蛋白质的支持载 体材料。通过改变硅前体分子可制备表面具有亲水性或憎水性的复合电极，例如 将甲基三甲氧基硅烷( m e t h y l t r i m e t h y o x y s i l a n e ) 替代四甲氧基硅烷 ( t e t r a m e t h o x o s i l a n e ) ，所得的复合电极背景电流很低，更有利于生物传感器的响 应功能，故大多的实验往往采用前者作为研究对象。 为了提高氧化态的安培型传感器的性能，通常需要使用媒介体或电子传递的 催化剂。对于溶胶凝胶法制作的生物传感器来说，由于硅中缺少电子传递物， 加入介体就更为关键。已经报道的采用二茂铁( f e r r o c e n e ) 为媒介体的葡萄糖氧 化酶( g o x ) 传感器，在溶胶凝胶中固定媒介体和酶，修饰在具有良好导电性 复旦大学坝七学位论文 第一章溶胶凝胶技术及其在生物传感器方面的应用 的石墨电极上，可促进电子的传递【4 9 】。另外，也可将金属微粒如钯( p d ) 均匀 分散在溶胶一凝胶中以提高电子传递的速度来检测溶液中游离的过氧化产物f 4 ”。 新型的安培型流动检测器( a m p e r o m e t r i cf l o wd e t e c t o r s ) 就是基于溶胶凝胶的碳 复合电极，它适用于在线的生物响应检测【5 0 1 。 金属陶瓷复合生物电极一般先将酶加入到溶胶凝胶溶液中，再将金属粉末 分散到溶胶一凝胶与酶的混合物中l s l i 。黄金一陶瓷生物电极符合电子在金表面的动 力学特征，显示了溶胶凝胶复合物材料良好的可再生性、可修饰性、可改变性。 尽管众多的溶胶凝胶复合电极主要采用硅为前体分子，其它的金属醇盐也 同样有利于制作生物传感器。脱氢酶辅酶n a d h 在电极表面有较大的过电位， 而且反应产物易富集在电极表面而污染电极，因而n a d h 很难直接在固体电极 表面氧化。j w a n g t 5 2 】研究组发现使用钛、锆陶瓷复合电极可将表面沉积的影响 降低到最小，溶胶凝胶载体结构大大提高了氧化还原媒介体麦二多拉蓝 ( m e l d o l ab l u e ) 的持久性，有益于n a d h 的检测。 2 厚膜安培型酶电极 由于筛印技术具有重现性好、产率高、价格低等特点，因而广泛应用于一次 性长条状生物电极( s t r i pb i o e l e c t r o d e ) 的批量生产。j w a n g 队5 3 1 研究组研制了 基于生物凝胶的碳墨和金墨，应用于筛印技术。他们把酶、羟丙基纤维素一起加 入到溶胶凝胶溶液中，然后在常温下进行溶胶一凝胶碳墨的熟化，避免了传统的 厚膜碳墨的热熟化。该技术解决了包埋热敏性酶分子的问题，有利于一次性酶条 带的制备。他们发现，在酸催化前体分子水解时，控制水的量，可以调节溶胶一 凝胶条带的微孔结构，从而改变它们的响应性能【5 4 1 。同时发现二茂铁媒介体在低 水量时，固定得更牢固。在溶胶凝胶碳墨中混合加入具有电催化作用的金属粉 末( 如铷) ，能够降低酶催化反应中产生的过氧化氢的过电位，从而提高了检测 葡萄糖的选择性【5 5 i 。在溶胶凝胶中加入表面活性剂二( 2 乙基己基) 磺化丁二 酸，可以避免使用共溶剂和酸催化剂睁“。 3 生物陶瓷膜 溶胶一凝胶制备成膜的突出优点就是可与传统的电极转换器( 如普通圆盘电 极) 结合制成电化学生物传感器。这些膜可通过喷洒或滴注的方式固定到电极表 面。已经报道的电化学生物传感器的制备方法有：( 1 ) 生物活性物质包埋于溶胶 望圭丛苎塑生兰鲨! l 塑二兰鲨鉴：塑鉴垫查丝些垄皇塑堡壁堂查堕塑生里 凝胶的载体中：( 2 ) 溶胶一凝胶酶溶胶凝胶夹心结构；( 3 ) 酶溶胶一凝胶双层 结构。 3 1 涂布的溶胶嗾t 胶膜 s a n c h e z 和其同事1 5 7 1 将葡萄糖氧化酶涂布在以t m o s 为前体分子的溶胶一凝 胶上，固定到电极表面，同时将媒介体二茂铁固定到溶胶一凝胶中，并检测对葡 萄糖的响应，酶在胶中能保持其8 0 的活性。g l e z e r 和o l e v l 5 8 1 利用五氧化二 钒溶胶一凝胶的高导电性设计了葡萄糖生物传感器，g o x v 2 0 ，溶胶凝胶膜覆盖 在铂电极转换器上，得到很好的响应。y a n g 5 9 】等最近设计了一种葡萄糖微型传 感器，使用酸、碱催化t e o s 两步法得到溶胶一凝胶，然后将涂布有葡萄糖氧化 酶的溶胶一凝胶膜覆盖在光印制作的微硅干胶片上，外面再包一层n a t i o n 膜来消 除有可能共存的其它物质的干扰。 3 2 多层结构 n a r a n g l 6 0 1 等首先研究了溶胶一凝胶酶溶胶一凝胶夹心结构，该结构即刻受到 了广泛的注目。这种结构的优点是响应迅速，可固定较多酶，可保护电极表面不 受偶合试剂影响，可防止酶因剧烈的实验条件而失活。t a n 工作组利用夹心结构 分别将辣根过氧化物酶和酪氨酸酶固定在碳糊电极上而制成过氧化氢【6 1 1 和酚类 1 6 2 1 生物传感器。这类传感器响应迅速，可用于快速流动注射测量。在溶胶凝胶 溶液中加入表面活性剂c t a b 可防止膜的破裂。由无机支持物的溶胶一凝胶制得 的过氧化氢夹心结构生物传感器在非水介质中同样具有较好的响应【6 3 】。 酶一氧化还原媒介体聚合物溶胶凝胶双层结构1 6 4 6 6 1 由s m y t h 研究组首先报 道。安培型乳酸生物传感器是将乳酸氧化酶和锇氧化还原介体涂布在玻碳电极表 面，然后覆盖层甲基3 乙氧基硅烷( m t e o s ) 6 4 o 他们用类似的方法将辣根 过氧化物酶和锇聚合物固定在溶胶一凝胶中，利用氰化物对酶的抑制作用进行氰 化物的定性定量检测【6 5 】。这种结构还曾用于酚类的分析检测【6 6 1 。 二、溶胶凝胶电化学免疫传感器 除了基于生物电催化的电化学生物传感器以外，包埋抗原的溶胶- 凝胶膜已 用于制作免疫传感器。电化学免疫传感器将免疫反应的高度专一性和电化学的高 灵敏度结合起来，引起学术界极大的重视6 ”。固定在溶胶一凝胶中的抗体能保持 其对抗原的亲合性和专一性。新的筛印免疫传感器，用低温熟化墨的方法，将免 复旦大学倾士学位论文 第一章溶胶凝胶技术及其在生物传感器方面的应用 疫蛋白、石墨粉和粘合剂一起分散在溶胶凝胶中，包埋的抗原与标记酶作用， 得到电流型的酚类生物传感器。该传感器的响应性能可通过调节碳一陶瓷的孔径 大小来调节。j w a n g 等将兔子免疫血红蛋白g 固定在溶胶凝胶中，包埋的抗原 对采用酶烷基磷酶( a l k a n l i n e p h o s p h a t a s e ) 标识的抗体有灵敏的响应