（分析化学专业论文）基于未端保护分析的生物传感器研究.pdf

l 一 i i ll r r l jiirljjjiii iifilli j f l l i ll y 19 0 7 2 9 6 t e r m i n a lp r o t e c t i o na n a l y s i sa p p l i e di nb i o s e n s o rr e s e a r c h b y g u om i n b s ( x i a n g t a nu n i v e r s i t y ) 2 0 0 8 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o r t h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e l n a n a l y t i c a lc h e m i s t r y i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rj i a n gj i a n h u i m a y , 2 0 1 1 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名：秀i 易曼 日期：弘1 1 年y 月7 钾日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 1 保密口，在年解密后适用本授权书。 2 不保密l41 0 ( 请在以上相应方框内打 ) 作者签名： 豸p 叙 日期：加j 1 年f 月冲日 导师签名：哥云膨久、一 日期： 圳年广月切旧 硕士学位论文 摘要 生物标志物是一种通常用于指示生物状态的生化指标。通过测量或评估生物 标志物可指示生物体所处的正常生理状态，发病进程，药物反应，干预治疗等各 个阶段。人体内存在多种生物标志物，其中三类重要的分子水平上的生物标志物 包括特定的小分子、蛋白质和突变的基因。不断开发检测小分子和蛋白质、突变 基因的生物传感器具有重大的意义。另外，生命体内许多重要的生物过程是由有 机小分子和生物活性大分子( 蛋白质、核酸等) 的识别和相互作用介导并完成的。 它们之间的相互作用是构成信号传导、能量传递、物质代谢和功能调控的基础。 从化学的角度出发，研究小分子和生物大分子之间的相互作用，特别是小分子与 蛋白之间相互作用对于开发化学药物和筛选探针具有重要的研究价值。近年来， 已发展了很多研究有机小分子和蛋白质相互作用的分析方法，如荧光共振能量转 移法、表面等离子共振法和荧光偏振法等，但是这些方法存在易受干扰、灵敏度 不高、适用性不强等缺点，所以迫切需要发展一种高灵敏和高选择性的技术方法。 另外，随着人类基因组测序工作的完成，利用生物学检测方法测定个体基因型的基 因分型技术也成为研究者们广泛关注的焦点。当前大多数单核苷酸多态分型方法 对大量d n a 样品的s n p 研究均很昂贵。鉴于之上所述，本文开创了一种新型的 分析技术，利用小分子标记的末端保护分析来研究有机小分子和结合蛋白的相互 作用和s n p 基因分型分析。具体内容如下： ( 1 ) 第二章中阐述小分子标记d n a 的末端保护分析的基本原理。末端修饰 了小分子的单链d n a 与小分子受体蛋白结合后可以阻碍核酸外切酶i 的降解。此 发现将小分子与蛋白相互作用分析转化为特定d n a 序列分析，这样就可以利用各 种各样的d n a 序列扩增和检测技术来探测有机小分子和受体蛋白的相互作用。基 于未被结合蛋白保护的小分子修饰的单链d n a 的在单壁碳纳米管表面选择性自 组装，我们发展了一种新型的电化学末端保护。通过调控单壁碳纳米管在1 6 巯基 十六酸自组装金电极上的吸附作用而获得不同的氧化还原信号，该方法可以保证 实质上的信号扩增放大和低背景电流。我们利用此方法进行了叶酸和叶酸受体f r ( 一种肿瘤标志物) 相互作用分析并进行了定量检测，检测下限f r 浓度为3 p m ， 结果证明了电化学末端保护具有理想的特异性和灵敏度。 ( 2 ) 第三章中进一步报道普遍的末端保护现象，小分子标记的d n a 与小分子 蛋白受体结合后能阻碍各种核酸外切酶的降解。该通用技术将小分子和蛋白质相 互作用转化为不同结构的d n a 分析，为检测小分子提供了一个有用的技术。在此 基础上，本章发展了基于荧光染色的小分子和蛋白质相互作用的均相分析方法， 1 基于末端保护分析的生物传感器研究 另外，本章中设计了一种基于小分子标记的单链d n a 聚合酶延伸的免标记s n p 基 因型分析技术。利用亲和素一生物素的小分子一蛋白模型体系和3 9 为密码子人1 3 球 蛋白基因的s n p 模型体系证明了该方法的可行性。结果显示该方法检测小分子和蛋 白质相互作用的动态响应范围是从o 5 1 0 0 n m ，检测限为0 1 n m 。s n p 分型技术的 动态响应范围是o 1 2 0 0 n m ，检测限为0 0 2 n m 。除了理想的灵敏度之外，该项技术 还具有高选择性，极好的重现性，低消耗和简单的操作步骤。 关键词：末端保护；小分子标记d n a ；小分子和结合蛋白相互作用；单壁碳纳米 管；基因分型；单核苷酸多态性 i i i l 一 a bs t r a c t b i o m a r k e ri si ng e n e r a las u b s t a n c eu s e da sa ni n d i c a t o ro fa b i o l o g i c a ls t a t e i ti s ac h a r a c t e r i s t i ct h a ti s o b je c t i v e l ym e a s u r e da n de v a l u a t e da sa ni n d i c a t o ro fn o 瑚a 1 b i o l o g i c a lp r o c e s s e s ，p a t h o g e n i cp r o c e s s e s ，o r p h a r m a c o l o g i cr e s p o n s e st o a t h e r a p e u t i ci n t e r v e n t i o n t h e r e r em a n yk i n d so fb i o m a r k e r s ，a m o n gw h i c ht h em o s t i m p o r t a n ta r es p e c i f i cs m a l lm o l e c u l e ，p r o t e i na n dm u t a n tg e n e i t s s i g n i f i c a n tt o d e v e l o pt h eb i o s e n s o rf o rt h ed e t e c t i o no fs m a l lm o l e c u l e ，p r o t e i na n dm u t a n tg e n e o t h e r w i s e ，m a n yi m p o r t a n tb i o l o g i c a lp r o c e s s e si nv i v oa r ea c h i e v e d t h r o u g ht h e r e c o g n i t i o na n di n t e r a c t i o nb e t w e e ns m a l l o r g a n i cm o l e c u l e sa n db i o a c t i v e m a c r o m o l e c u l e st h a t r ep r o t e i n ，n u c l e i ca c i da n dh y d r o c a r b o n t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n t h e mi sb a s i sf o rt h es i g n a lt r a n s d u c t i o n ，e n e r g yt r a n s m i s s i o n ，m e t a b o l i s ma n df u n c t i o n r e g u l a t i o n f r o mt h ec h e m i c a lp o i n to fv i e w , i t si m p o r t a n tt os t u d yt h ei n t e r a c t i o n e s p e c i a l l yb e t w e e ns m a l lo r g a n i cm o l e c u l ea n dp r o t e i nf o rd r u gd i s c o v e r ya n dp r o b e s c r e e n i n g i nr e c e n ty e a r s ，t h e r eh a sb e e nd e v e l o p e dm a n ym e t h o d si n s t u d i n gt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e ns m a l lm o l e c u l ea n d p r o t e i n ，s u c ha sf l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r ，s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c ea n df l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o n ，e t c h o w e v e rt h e s e m e t h o d sh a v et h e w e a k n e s s e s o f s t r o n gi n t e r f e r e n c e ，l o w s e n s i t i v i t y , s t r a i t a p p l i c a b i l i t y i tu r g e n t l yn e e d st of i n dah i g h l ys e n s i t i v ea n ds e l e c t i v et e c h n i c a l m e t h o d s i na d d i t i o n ，w i t ha c c o m p l i s h m e n to ft h eh u m a n g e n o m es e q u e n c e 。r e s e a c h e r s g r a d u a l l yf o c u so nc o n s i d e r i n gt h em e t h o d sf o rd e t e c t i n gi n d i v i d u a lg e n o t y p e s m o s t r e s e a r c ho ns i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s mt y p i n go f h u g eq u a n t i t i v ed n as a m p l e si s v e r ye x p e n s i v e s i n c et h a t ，w eh a v ed e v e l o p e dan e wa n a l y t i c a lt e c h n i q u e st h a ti s t e r m i n a lp r o t e c t i o na s s a ya p p l i e di ng e n o t y p i n ga n a l y s i sa n dd e t e c t i o no fi n t e r a t i o n b e t w e e ns m a l lm o l e c u l ea n dt h e i rr e c e p t o rp r o t e i n t h ec o n c r e t ec o n t e n ti sa sf o i l o w s ： ( 1 ) t h es e c o n dc h a p t e rf i r s t l yd e s c r i b e st h ep r o o f - o f - p r i n c i p l eo fat e r m i n a l p r o t e c t i o na s s a yo fs m a l l m o l e c u l e l i n k e dd n a t e r m i n a lp r o t e c t i o na s s a yi sb a s e do n o u rn e wf i n d i n gt h a ts i n g l e s t r a n d e d d n a ( s s d n a ) t e r m i n a l l yb i n d e dt oas m a l l m o l e c u l el sp r o t e c t e df r o mt h ed e g r a d a t i o nb ye x o n u c l e a s ei ( e x oi ) w h e nt h es m a l l m o l e c u l em o i e t yi sb o u n dt oi t sp r o t e i nt a r g e t t h i s f i n d i n gc o n v e r t st h eb i n d i n go f s m a l lm o l e c u l e st o p r o t e i n si n t ot h ep r e s e n c eo fas p e c i f i cd n as e q u e n c e 。w h i c h e n a b l e su st od e t e c tt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns m a l lo r g a n i cm o l e c u l e sa n dt h e i rp r o t e i n t a r g e t su t i l i z i n gv a r i o u sd n as e q u e n c ea m p l i f i c a t i o na n dd e t e c t i o nt e c h n o l o g i c s 0 n i v l 基于末端保护分析的生物传感器研究 t h eb a s i so fs e l e c t i v ea s s e m b l yo fs i n g l e - w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ( s w n t s ) w i t h s u r f a c e t e t h e r e ds m a l l m o l e c u l e l i n k e ds s d n an o tp r o t e c t e db yp r o t e i nb i n d i n g ，a n o v e le l e c t r o c h e m i c a ls t r a t e g yf o rt e r m i n a lp r o t e c t i o na s s a yh a sb e e nd e v e l o p e d t h r o u g hd e t e c t i n g t h er e d o x s i g n a l m e d i a t e d b y s w n ta s s e m b l yo na 16 - m e r c a p t o h e x a d e c a n o i ca c i d b l o c k e de l e c t r o d e ，t h i ss t r a t e g yi sa b l et oe n s u r e s u b s t a n t i a ls i g n a la m p l i f i c a t i o na n dal o wb a c k g r o u n dc u r r e n t t h i ss t r a t e g yi s d e m o n s t r a t e df o rq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so ft h ei n t e r a c t i o no ff o l a t ew i t hat u m o r b i o m a r k e r o ff o l a t er e c e p t o r ( f r ) ，a n dad e t e c t i o nl i m i to f3p mf ri sr e a d i l ya c h i e v e d w i t hd e s i r a b l es p e c i f i c i t ya n ds e n s i t i v i t y ( 2 ) t h et h i r dc h a p t e rf u r t h e rr e p o r t san e wf i n d i n go fg e n e r a l i z e dt e r m i n a l p r o t e c t i o nt h a ts m a l lm o l e c u l e - d n ac h i m e r a sa r ep r o t e c t e df r o md e g r a d a t i o nb y v a r i o u sd n ae x o n u c l e a s e s ，w h e nt h es m a l lm o l e c u l em o i e t i e sa r eb i n d e dt ot h e i r p r o t e i nt a r g e t s t h i sg e n e r a l i z a t i o nt r a n s l a t e ss m a l lm o l e c u l e p r o t e i ni n t e r a c t i o na s s a y s i n t ot h ed e t e c t i o no fd n ao fv a r i o u ss t r u c t u r e s ，a f f o r d i n gau s e f u lm e c h a n is mf o rt h e a n a l y t i c so fs m a l lm o l e c u l e s o nt h eb a s i so ft h i sm e c h a n i s m ，al a b e l f r e eb i o s e n s o r s t r a t e g yh a sb e e nd e v e l o p e df o r ah o m o g e n e o u sa s s a yo fp r o t e i n s m a l lm o l e c u l e i n t e r a c t i o n sb a s e do nt h ef l u o r e s c e n c es t a i n i n gd e t e c t i o n a l s o ，al a b e l f r e es n p g e n o t y p i n gt e c h n i q u ei sd e s i g h e db a s e do np o l y m e r a s ee x t e n s i o no fas i n g l en u c l e o t i d e w i t has m a l lm o l e c u l el a b e l t h ed e v e l o p e dt e c h n i q u e sa r ed e m o n s t r a t e du s i n gam o d e l p r o t e i n - s m a l lm o l e c u l es y s t e mo fb i o t i n s t r e p t a v i d i na n dam o d e ls n ps y s t e mo f h u m a n1 3 - g l o b i ng e n ea r o u n dt h ep o s i t i o no fc o d o n39 t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h e p r o t e i n s m a l lm o l e c u l ei n t e r a c t i o na s s a ys t r a t e g ys h o w sd y n a m i cr e s p o n s e si nt h e c o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m0 5t o10 0n mw i t had e t e c t i o nl i m i to fo 1n m ，a n dt h es n p t y p i n gt e c h n i q u eg i v e sd y n a m i cr e s p o n s e si nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o mo 1t o2 0 0 n mw i t had e t e c t i o nl i m i to fo 0 2n m b e s i d e sd e s i r a b l es e n s i t i v i t y , t h ed e v e l o p e d s t r a t e g i e sa l s oo f f e rh i g hs e l e c t i v i t y , e x c e l l e n tr e p r o d u c i b i l i t y ，l o wc o s t ，a n ds i m p l i f i e d o p e r a t i o n s k e yw o r d s ：t e r m i n a lp r o t e c t i o n ；s m a l lm o l e c u l e l i n k e dd n a ；p r o t e i nb i n d i n g ； s i n g l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ( s w n t s ) ；g e n o t y p i n ga s s a y ，s i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ( s n p ) v l 硕士学位论文 目录 学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t i v 第l 章绪论1 1 1 生物标志物的检测意义1 1 1 1 小分子和蛋白质相互作用的意义及研究方法2 1 1 2s n p 基因分型的检测意义及研究方法6 1 2 电化学生物传感器8 1 2 1 电化学生物传感器的电极表面修饰9 1 2 2 电化学生物传感器的电信号表征l o 1 3 碳纳米管在电化学生物传感器中的应用l l 第2 章电化学分析末端保护应用于小分子和蛋白质相互作用的研究一1 3 2 1 前言1 3 2 2 实验部分1 5 2 2 1 试剂与仪器1 5 2 2 2 制备叶酸标记的d n a 探针1 6 2 2 3 制备d n a s w n t 复合物17 2 2 4 金电极的处理与组装1 7 2 2 5 末端保护分析的电泳实验17 2 2 6 末端保护分析的电化学检测1 8 2 3 结果与讨论18 2 3 1 末端保护的电泳表征1 8 2 3 2 电化学末端保护分析2 3 2 3 3 电化学末端保护分析的表征和定量性质2 5 2 4 小结2 9 第3 章末端保护的推广及s n p 基因分型应用研究3 0 3 11 箝言3 0 3 2 实验部分31 3 2 1 试剂与仪器31 3 2 2 末端保护凝胶电泳分析3 2 3 2 3 基于生物素链霉亲和素相互作用的荧光光谱末端保护分析3 2 v i 基于末端保护分析的生物传感器研究 3 2 4 基于基因分型荧光光谱末端保护分析3 2 3 2 5 基因组样品制备和p c r 扩增3 3 3 3 结果与讨论3 3 3 3 1 末端保护阻止酶切的通用性评估3 3 3 3 2 小分子蛋白相互作用实验设计3 6 3 3 3 基于末端保护的s n p 基因分型实验设计3 9 3 3 4 基于末端保护的s n p 基因分型定量表征4 2 3 4d 、结4 5 结论4 6 参考文献4 7 致 谢一5 5 v l 一 硕士学位论文 第1 章绪论 生物传感器的历史始于1 9 6 2 年英国科学家l e l a n dc c l a r k 发明的第一个酶电 极生物传感器【l 】。生物传感器( b i o s e n s o r ) 是指用固定化的生物体成分( 包括酶、抗 体、抗原、核酸等生物活性物质) 或生物体本身( 微生物、细胞等) 作为敏感材 料识别元件的传感器，将生物化学反应能转换成电信号的分析测试装置。生物传 感器，顾名思义包含两个部分：“生物 部分和“传感器部分。“生物”部分( 比 如酶) 用于识别特定的被分析物而“传感器部分则将生物分子中产生的变化转 导成各种可检测的信号。生物部分产生的信号可以转换为电化学信号、光学信号 和声信号等。分子识别部分是传感器选择性测定的基础，如抗体和抗原结合，酶 与底物结合等，选择合适的识别元件是生物传感器极为重要的前提。而根据分子 识别的敏感元件所引起的生物化学反应能变化来选择信号转导装置是研制生物传 感器的另一重要环节。根据生物传感器中分子识别元件即敏感元件可分为五类： 酶传感器、抗免疫传感器、微生物传感器、细胞传感器、和组织传感器。根据生 物传感器的信号转导装置可分为电化学生物传感器、离子灵敏性生物传感器、热 学检测生物传感器、光学检测生物传感器、声学生物传感器等【2 j 。近2 0 多年来， 在生物科学、信息科学和材料科学的发展成果推动下，生物传感器研究取得迅速 发展，生物、化学、物理、材料科学等各个领域研究团队都纷纷致力于发明更精 致可靠的、成熟的生物传感设备应用于疾病诊断、临床医药，食品检测、生物技 术，农业，环境监测、军事司法等方面，并取得了突破性的进展。特别的，生物 传感器是发展生物技术必不可少的一种先进的检测与监控技术，也是对物质在分子 水平上进行快速和微量分析的重要手段。在生物分析和临床检验【3 】等生命科学领 域，不断开发新型的生物传感器一直是科学家们研究的主要方向。 1 1 生物标志物的检测意义 生物标志物是一种可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能由 于受到环境影响而发生改变或可能发生改变的生化指标【4 】。这些指标可以是细胞分 子结构和功能的变化、某一生化代谢过程的变化或引起的代谢产物含量异常的变 化、某一生理活动或某一生理活性物质的异常表现、生物个体表现出的异常现象、 种群或群落的异常变化和生态系统的异常变化。对于生物体来说，存在多种生物 标志物，其中三类重要的分子水平上的生物标志物包括特定的小分子、蛋白质和 突变的基因。生物标志分子作为特征性指示分子，对于生命自然现象的科学探索 和研究，病理情况下的疾病预测、诊断、预防和治疗等方面意义重大【5 1 。因此， 检查一种疾病特异性的生物标志物具有非凡的意义。在人类基因组测序计划和随 基于末端保护分析的生物传感器研究 之兴起的蛋白组学飞速发展的推动下，蛋白质、小分子和突变基因的这三类生物 标志物分子成为化学生物学和医学领域的科学家们的研究热点。不断开发检研究 测小分子和蛋白质、突变基因的生物传感器具有重大的意义。 1 1 1 小分子和蛋白质相互作用的意义及研究方法 蛋白质是维持生命活动的基本物质，是生物体性状的直接表达者。没有蛋白 质就没有生命。蛋白质在生物体内具有广泛和重要的作用，它不仅是各器官、组 织的主要化学组成，还是机体内进行新陈代谢的重要催化剂，调节激素水平，发 生免疫反应，接受和传递信息以及调节或控制细胞的生长、分化和遗传信息的表 达等各种重要生理功能。细胞中的生命活动主要是通过蛋白质来承载，它是生命 最重要的物质基础，生命的起源及生物进化均与之密切相关。在人类基因组计划 的实施和推进下，随之兴起的蛋白质组学逐渐清晰地揭示了蛋白质的结构和功能， 为阐述生命活动规律及其发展变化提供基础，也为疾病机理的阐述及攻克提供了 理论依据和解决途径。蛋白质许多重要的生理和药理功能是由小分子参与调控的 【6 j 。小分子和蛋白质等生物大分子之间相互作用是构成信号传导、能量传递、物质 代谢和功能调控的基础。小分子与蛋白质相互作用的研究是现今化学生物学重要 的研究内容，为生命科学，医药临床学提供了非常丰富的信息。深入研究小分子 和蛋白质大分子之间的相互作用，有助于建立快速简便的蛋白质检测方法，且小 分子物质的结构和合成相对简单，对于开发化学药物和筛选探针具有重要的研究 价值，是当前生物分析化学和医药领域研究的前沿和热点之一。以下详细介绍下 几种常见的小分子和蛋白质相互作用研究方法。 1 1 1 1 荧光共振能量转移法 荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r , f r e t ) 技术是现 今研究蛋白质相互作用应用比较广泛的方法之一【7 8 ，9 1 。被称为“光谱尺【1 0 】的f r e t 与荧光显微镜结合后，适用于活细胞和固定细胞内获取蛋白质、d n a 、脂类等定 位和定量信息，能最直观的研究蛋白质问相互作用。f r e t 是由在1 9 4 8 年首次提出 的j ，故又可称之为f 6 r s t e r 能量转移。随后，l a k o w i c z 和v a nd e rm e e r 等分别对 f r e t 的基本理论进行了更加全面的描述【1 2 1 。荧光共振能量转移的基本原理是：两 个荧光团相距1 1 0 n m 之间，且一个荧光团( 供体) 的发射光谱与另一个荧光团( 受 体) 吸收光谱有重叠( 图1 a ) ，两个荧光基团足够靠近时，当供体分子受到入射光 激发，吸收一定频率的光子后通过偶极偶极耦合作用将能量传递给受体分子，受 体分子由基态跃迁至激发态( 图1 b ) ，接着再衰变到基态时发射出荧光，而供体分 子则返回到基态不发射荧光，这就是荧光共振能量转移【1 3 , 1 4 】。简而言之，f r e t 是 从供体分子到受体分子的非辐射能量跃迁，使供体荧光强度减弱而受体的荧光增 强，同时伴随着相应的荧光寿命缩短或延长( 荧光素在激发态的寿命是1 0 9 s ) 。通 重叠区 ( a ) 波长 供体受体 ( b ) 图1 1f r e t 原理图 由于荧光共振能量转移的发生依赖于供体和受体分子间的相对距离，基于这 种距离敏感性，f r e t 被常于研究分子间相互作用，且在生物医药和药物开发中的 应用越来越广泛。g o l d m a n 1 5 】等发展了一种基于大肠杆菌麦芽糖结合蛋白m b p 的 生物传感器( 见图1 2 ) 。在大肠杆菌麦芽糖结合蛋白m b p 上修饰长波激发的花青荧 光染料c y 3 5 ( 作供体部分) ，在1 3 环糊精上标记花青荧光染料c y 5 或q s y 9 ( 作受 体部分) ，当供体和受体共价结合后，发生荧光共振能量转移，c y 5 的荧光被淬灭。 当加入分析物麦芽糖小分子后，麦芽糖取代了d 环糊精在大肠杆菌麦芽糖结合蛋 白m b p 的位点，p 环糊精脱离下来c y 5 的荧光恢复。测得大肠杆菌麦芽糖结合蛋白 与麦芽糖小分子的解离常数是0 1 4 - 2 9 1 t m 。 d m o r a e e a p t o t d o n o r e m i s s 沁n i 一 a c c e p f o r ，一 图1 2 基于大肠杆菌麦芽糖结合蛋白m b p 的生物传感器 以上报道是基于小分子的位点替代使荧光恢复的荧光共振能量转移法，为小 分子和蛋白质相互作用研究提供了很好的选择，但是由于蛋白质和小分子都需要 基于末端保护分析的生物传感器研究 标记等繁琐步骤，且实际应用中实验结果易受分子扩散的影响。 1 1 1 2 平衡透析法 平衡透析法是研究小分子与受体蛋白相互作用的经典方法根据游离的小分 子和与蛋白质结合的小分子在半透膜内形成的扩散压力不同，将两者分离【1 6 1 。扩 散压是分离透析的动力，压力主要是由透析膜两边的浓度梯度形成的( 见图1 3 ) 。 小分子透析的速度与膜的厚度、小分子溶质在膜两边的浓度梯度及透析温度有关。 通过检测小分子可以得到小分子与蛋白质相互作用的稳定结合常数【1 7 】。平衡透析 法保持了作用的各种分子的物理环境，并且具有不需要对分子进行各种修饰，操 作简便，温度易于控制，设备成本不高等优点。但由于透析的平衡时间较长，通 常是几天，溶液体积容易发生变化，还可能由于加入或代谢容易导致被测物质的 降解等【1 8 ，19 1 。 图1 3 平衡透析法中透析膜的扩散压 1 1 1 3 表面等离子共振法 表面等离子共振技术( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c et e c h n o l o g y , s p r ) 是近年来 迅速发展起来的一种广泛用于生物大分子与小分子相互作用研究的检测技术，表 面等离子共振是一种物理光学现象，金属表面存在的自由电子按一定的方向水平 移动，当受到光照射后，光能使金属表面的电子发生共振，入射光强度减弱，导 致发射角度发生偏差。而放射角变化与金属的质量成正比，将配体小分子固定在 芯片上，当分析物受体流过芯片表面时，小分子配体和其结合量的变化导致s p r 信号的产生，s p r 检测原理见图1 4 。与其他生物分子相互作用分析方法相比，s p r 具有无损伤、免标记、灵敏度高和快速在线检测等优点。2 0 世纪8 0 年代，s p r 技术 逐渐商业化。基于s p r 技术，b i a c o r ea b 公司1 9 8 9 年生产了首台用于检测生物分子 之间相互作用的b i a c o r e 分析仪器【2 0 1 。 、 r 硕士学位论文 检测器 反射光 图1 4 表面等离子共振技术检测原理图 尽管表面等离子共振在生化分析领域的应用已经非常广泛，仍存在某些技术 和方法上的问题。例如( 1 ) 传感芯片比较单一；( 2 ) 生物分子在芯片表面的固定 通常难以实现；( 3 ) 分析物在芯片表面的非特异性结合引起假阳性信号；( 4 ) 分 析物与芯片表面的配体结合时易受流体速率、扩散系数和温度的影响；( 5 ) 由于 小分子分析物引起的质量变化不大，则折射率变化不明显致使小分子检测的灵敏 度不高【2 1 1 。 1 1 1 2 毛细管电泳法 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 是八十年代迅速发展起来的新型分 离技术。其工作机理是根据不同样品在电场中具有不同的迁移速率来达到分离和 分析的结果。由于毛细管电泳具有样品耗样量少、高效快速、分离效率高、可同 时进行多种分子的检测及能在类似与生理环境下的缓冲溶液中进行等优点，备受 科学研究者的青睐，已被广泛用于生物分子相互作用分析2 2 ，2 3 1 。现今的毛细管电 泳是由j o r g e n s o n 和l u k a c s 【2 4 】于1 9 8 1 年首次提出，到了2 0 世纪8 0 年代中后期，毛细 管电泳飞速发展。1 9 8 4 年t e r a b e t 2 5 】将胶束引入毛细管电泳，开创了胶束电动毛细 管色谱。1 9 8 7 年h j e r t e n 【2 6 】等将等电聚焦过程转移到毛细管内进行，之后毛细管凝 胶电泳，点色谱等相继发展起来。毛细管电泳技术应用于蛋白和小分子相互作用 分析的基本原理是：游离的小分子靶蛋白与小分子相互作用形成复合物后，其电 泳中的移动速度会受到影响，导致游离的蛋白质和小分子靶蛋白一小分子复合物会 在不同的时间迁移流出，也就是作用前后靶蛋白的电泳淌度发生变化，获得热力 学和动力学参数后，可以依此来定量地测定蛋白和小分子间亲和力结合常数。毛 细管电泳也存在稳定性不高和精密度不够的缺点。 基于末端保护分析的生物传感器研究 1 1 1 3 荧光偏振分析法 荧光偏振法( f l o u r e s c e n c ep l o r i z a t i o n ，f p ) 是利用偏振光和荧光示踪剂小分子 来检测分子取向和迁移率的技术。基本原理是：受到偏振光的激发后，示踪剂小 分子吸附到分子量比较大的分子上，使小分子的旋转速度变慢，产生偏振角，发 射出偏振荧光。荧光偏振分析法检测小分子和蛋白质问的相互作用的原理如图1 5 所示。荧光示踪剂小分子在溶液中自由运动快速旋转，在平面极化光中不能定位， 产生低极化值。而当荧光示踪剂小分子配体结合到蛋白或者其他更大的分子上时， 旋转受到阻碍，具有高极化值。这种方法能直接用于检测示踪分子的相互作用或 结合率。 图1 5 更光偏振分析法原理描述 与其他荧光方法比较，生物分子之间相互作用后无需任何分离游离的荧光标 记物即可直接测定信号，且荧光偏振极化值只与分子体积尺寸有关，和发射光的 荧光强度无关。整个分析过程都在均相溶液中进行，检测时间长短对于结果无影 响，由于荧光偏振分析法具有高灵敏性、重现性和稳定性的优点，已广泛应用于 和高通量筛选药物和生物分子相互作用领域【2 7 ，2 8 1 。 1 1 2s n p 基因分型的检测意义及研究方法 单核苷酸多态性( s i n g l en u e l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p ) 是人类基因组中最 常见的基因遗传变异，随着人类基因组计划的完成，人群中发现了大量的微妙的 变异，而这些变异中最多的是单核苷酸多态性【2 9 0 1 1 。最近报道s n p 数据库中s n p s 的总数超过了9 万种。s n p 是基因组特定位点的单核苷酸突变，不包括基因插入 和基因缺失的多态性。s n p 是等位基因突变，人类