（生物化学与分子生物学专业论文）水稻染色质调控因子功能分析.pdf

l i l l t l l lutl l l l l l lt i l li l 0 华中农业大学学位论文独创性声明及使用壬y 1 8 0 5 3 7 5 学位论文 石 如需保密，解密时间年月日 是否保密 矽 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生挠狮噜 帆沙7 年朋罗日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照 学校要求提交- y - - 位论文的印刷本和电子版本；- y - 校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。本人同意华中农业大- - y - 可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的 论文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者张馘哥峰撕始夕司够 签名日期：加7 年c9 月7 日签名日期：夕丫年f p - 月尸日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 水稻染色质调控因子的功能分析 目录 华中农业大学2 0 0 9 届博士研究生学位论文 2 1 0 组蛋白的抽提和w e s t e r nb l o t 2 6 2 1 1 水稻全基因组基因芯片分析2 6 2 1 2 染色质免疫共沉淀。2 7 2 1 3 体外组蛋白结合实验2 8 2 1 4 酵母双杂交2 8 2 1 5m m s 处理2 8 3 结果与分析3 3 3 1 水稻c h d 基因的序列分析与转基因材料的获得3 3 3 1 1 水稻c h d 基因的序列分析。3 3 3 1 2 遗传转化材料的获得3 7 3 2 转基因材料分析与c h d l 功能研究4 1 3 2 1c h d l 的基因结构分析以及c d n a 全长的分析4 1 3 2 2c h d l 的表达模式4 1 3 2 3c h d l 突变体和c h d lr n a i 转基因植株出现相同的表型4 2 3 2 4c h d l 植株叶片和茎的细胞数目减少4 5 3 2 5c h d l 植株叶片上表面表皮毛增多且叶片的叶绿素含量下降4 7 3 2 6w e e l 在c h d l 中的表达量上升4 8 3 2 7 水稻w e e l 和c h d l 对d n a 诱变剂m m s 呈现相反的表达变化5 0 3 2 8c h d l 突变体中w e e l 的上升表达仅在田间种植的叶片中发生5 2 3 2 9 如以较野生型对m m s 更敏感。5 3 3 2 1 0d n a 损伤早期诱导的基因在幽以中的表达量没有变化5 5 3 2 1 1 幽以植株全基因组芯片分析5 6 3 2 1 2w e s t e r nb l o t 检测c h d l 植株各种组蛋白修饰的变化5 9 3 2 1 3c h d l 的p h d 结构域可以在体外与h 3 k 2 7 m e 3 结合6 1 3 3 水稻上属川的功能分析一6 1 3 3 1 水稻l 船工基因的结构以及c d n a 全长的获得6 1 3 3 2 l h p l 的表达谱分析6 3 3 3 3 l h p l 的c h r o m o s h a d o w 结构域可以形成二聚体6 3 3 3 4l h p lr n a j 转基因植株没有表型6 4 3 4h d a c l l 的互作蛋白的筛选6 5 水稻染色质调控因子的功能分析 3 4 1 酵母双杂交筛选h d a c l l 的互作蛋白6 5 3 4 2 筛选出来的蛋白为水稻特异基因并在籼粳之间存在多态性6 7 3 4 3 重新转化验证互作6 9 3 4 4h d a p 蛋白的n 端不参与与h d a c l l 的互作7 0 3 4 5h d a p 与h d a c l l 的表达谱分析7 1 4 讨论7 2 4 1c h d l 在d n a 损伤信号传导中的作用7 2 4 2 水稻l h p l 可能有别于拟南芥同源基因的功能7 4 4 3c h d l 抑制基因的表达可能需要h 3 k 2 7 的三甲基化7 4 4 4c h d l 可能在水稻发育中也具有重要作用7 5 参考文献7 7 附录i 部分实验的操作流程8 7 附录i i 作者简历9 8 致谢：1 0 0 譬 一 a b b r e v i a t i o na n d a c r o n y m s 缩略符号英文全称中文名称 c h d s m l h p l r n 赴 c h p 脚 h d a c l s d l p h d p c s 珏泓 m i r n a k r p c d k m m s s u m o c h r o m o d o m a i n h e l i c a s e d n a b m d i n g s u c r o s en o n f e r m e n t i n g2 l i k e - h e t e r o c h r o m a t i np r o t e i n l r n ai n t e r f e r e n c e c l n o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o n h i s t o n ea c e t y l t r a n s f e r a s e h i s t o n ed e a c e t y l a s e l y s i n es p e c i f i cd e m e t h y l a s e1 p l a n th o m e o d o m a i n p o l y c o m b s m a l li n t e r f e r i n gr n a m i c r o r n a k i p r e l a t e dp r o t e i n c y c l i n - d e p e n d e n tx i n a s e m e t h y lm e t h a n e s u l f o n a t e s m a l lu b i q u i t i n l i k em o d i f i e r 含有c h r o m o d o m a m 、解旋酶 和d n a 结合域的蛋白 类异染色质蛋白 r n a 干涉 染色质免疫沉淀 组蛋白乙酰化酶 组蛋白去乙酰化酶 赖氨酸特异去甲基化酶 植物同源盒结构域 多梳蛋白 小干扰r n a 小r n a k i p 相关蛋白 依赖于周期蛋白的激酶 甲基磺酸甲酯 小的类泛素修饰 华中农业大学2 0 0 9 届博士研究生学位论文 于两要 染色质调控因子主要分为两大类：一类是染色质修饰因子，主要包括d n a 甲 基化酶以及组蛋白修饰酶；第二类是除了这些酶以外与表观遗传调控相关的因子， 包括能够识别特定修饰位点的蛋白以及染色质变构因子等等。目前在水稻中对于染 色质调控因子特别是第二类的研究相对较少，因此研究水稻这些基因的功能对于阐 明水稻表观遗传调控的分子机理具有重要意义。 本研究主要以水稻的三类基因c h d ( c h r o m o d o m a i nh e l i c a s ed n a - b i n d i n g p r o t e i n ) 类、l h p i ( l i k e 阿狐r o c h r o m p r o t e i n1 ) 以及组蛋白去乙酰化酶 h d a c l l ( h i s t o n e d e a c e t y l a s e1 1 ) 为研究对象，通过克隆、转化以及酵母双杂交等方 法研究了它们在表观遗传调控中的作用，主要得到以下结果： 1 对水稻s i x t 2 家族的基因进行了进化树分析，并确定了水稻c h d 类基因。 2 对c h d 类的基因构建了r n a 干涉( r n a i ) 载体并转化水稻受体得到了转基因 植株，对部分植株进行了检测，找到了c h d 基因的突变体并进行了基因型验证以及 表达量的检测。 3 c h d l 在叶片中的表达量相对较高，特别是在嫩叶中，其表达量是其它部位的几 十倍，即使在成熟的叶片中其表达量较其它部位也要高出许多。 4 c h d l 的r n a i 转基因植株与突变体出现相同的表型，主要表现在：植株矮小、 茎秆变细、叶片包括营养叶和剑叶变窄但长度变化不大、叶片上表面泛白、种子变 窄、在大田中种植根明显减少变短。 5 c h d l 突变体叶片的各种组织或者细胞包括大、小维管束、泡状细胞以及叶肉细胞 等数目都变少，在茎杆中细胞的数目也明显减少，而顶端分生组织的细胞大小和数 目均没有变化。突变体叶片上的表皮毛的数目明显增多，而且叶片叶绿素的含量明 显降低。 6 在c h d l 突变体中w e e l 表达量明显上升，但是只是在田间种植的叶片中有上升， 在其它的部位包括芽、苗和茎均没有变化。w e e l 的表达模式正好与c h d l 互补， 其在叶片中表达量相对较低，特别是在成熟叶片中基本没有表达，而在其它部位表 达量较高。 7 在水稻中w e e l 的表达明显受到d n a 诱变剂m m s 的诱导，但是这种诱导也仅仅 局限于叶片中。而m m s 的处理会使c h d l 的表达量下降。 n 水稻染色质调控因子的功能分析 8c j l l 以突变体对m m s 较野生型更为敏感，而相同浓度的m m s 处理在如枷中的 w e e l 的表达高与野生型没有明显的差别。 “7 9 对c h d l 突变体进行了全基因组芯片分析发现在突变体中有大量的与胁迫相关的 基因均不同程度地上升表达。 1 0 一些组蛋自修饰包括h 3 k 4 三甲基化和h 3 k 2 7 三甲基化在c h d l 突变体中没有明 显的变化，而且c h d i 突变以及m m s 处理对w e e l 的h 3 k 2 7 三甲基化没有影响。 1 1c h d l 蛋白的p h d 锌指结构域可以在体外与三甲基化h 3 k 2 7 结合，两个串联的 c h r o m o d o m a m 也可以与组蛋白结合，但是没有与特殊修饰位点结合的特异性。 1 2 对l h p l 在水稻体内进行了r n a i 干涉，但是在检测的阳性植株中没有发现明显 的表型变化，水稻l h p l 具有不同的剪切体，并且在籼粳两个不同的亚种中剪切体 也有所不同；l h p l 在水稻各个部位均有表达；酵母双杂交实验结果证明l i - i p l 的 c h r o m o s h a d o w 可以产生同源二聚体。 1 3 用酵母双杂交的方法筛选水稻h d a c l l 的互作蛋白，找到了一个水稻特异的基 因，这个基因没有保守的结构域，在其它物种也没有同源的蛋白；这个基因在籼粳 亚种之间还表现多态性，其中有些引起了氨基酸的改变，有些则没有，而2 2 位的胸 腺嘧啶的缺失导致该基因在籼稻中翻译提前终止；这个蛋白的n 端不参与它与 h d a c l l 的互作；它与h d a c l l 的表达谱相似，在水稻各个部位均有表达。： ，忍；一 这一系列的结果表明水稻c h d l 参与d n a 损伤的信号传导。当d n a 损伤时， c h d l 会将信号传递给w e e l ，暂时抑制它的表达，从而延缓细胞周期的进行，这 也揭示了表观遗传调控在细胞周期调控中的重要作用。 关键词：水稻；染色质调控因子；细胞周期调控；c h d 1 1 i g e n e sw e r ei d e n t i f i e d 2 w ec o n s t r u c t e dr n a iv e c t o r so fc h d g e n e sa n dt r a n s f o r m e dt h e mi n t or i c et og e t t r a n s g e n i cp l a n t s t h eg e n ee x p r e s s i o n so fs o m eo ft h e s et r a n s g e n i cp l a n t sw e r et e s t e d m o r e o v e r ，w ef o u n do u tt h em u t a n t so fc h d g e n e sa n dp e r f o r m e dg e n o t y p ea n dg e n e e x p r e s s i o na n a l y s e s 3 t h ee x p r e s s i o no fc h d lw a s c o m p a r a t i v e l yh i g hi nl e a v e se s p e c i a l l yy o u n gl e a v e si n 4 5 w h i c hc h d le x p r e s s i o nw a ss e v e r a ld o z e nt i m e st h a nt h a ti no t h e r s e v e ni nm a t u r e l e a v e st h ee x p r e s s i o no fc h d lw a sm u c h h i g h e rt h a nt h a ti no t h e ro r g a n s t h er n a it r a n s g e n i cp l a n t sa n dm u t a n t so fc h d le x h i b i t e dt h es i m i l a rp h e n o t y p e ： d w a r f , t h i n n e rc u l m ，n a r r o w e rl e a v e si n c l u d i n gv e g e t a t i v el e a v e sa n df l a gl e a v e s ， b l e a c h e du p p e rs u r f a c eo fl e a f , n a r r o w e rs e e d s ，s m a l l e ra n ds h o r t e rr o o t sw h e n p l a n t e d i nt h ef i e l d t h en u m b e ro fs e v e r a lk i n d so ft i s s u e sa n dc e l l si nc h d lw e r ed e c l i n e di n c l u d i n g b i g a n ds m a l lv a s c u l a rb u n d l e s ，b u l l i f o r mc e l l sa n dm e s o p h y l lc e l l s c e l ln u m b e r sw e r e a l s od e c r e a s e di nc u l mb u tb o t hc e l ln u m b e ra n ds i z ew e r en o ta f f e c t e di ns h o o ta p i c a l m e r i s t e m m o r e o v e r t h en u m b e ro ft r i c h o m e so nc h d ll e a fs u r f a c ew e r ed r a m a t i c a l l y i v 水稻染色质调控因子的功能分析 i n c r e a s e da n dt h ec o n t e n to fc h l o r o p h y l li nc h d il e a fw e r ed e c e a s e d 6 i nc h d lw e e le x p r e s s i o nw a si n c r e a s e db u to n l yi nl e a fw h e nt h em u t a n t sw e r e p l a n t e di nt h ef i e l da n dn o ti nt h eo t h e rt i s u e so ro r g a n ss u c ha ss h o o t ，s e e d l i n g ，r o o t w e e le x p r e s s i o nw a sc o n t r a r yt ot h a to fc h d l ，w h i c hw a sr e l a t i v e l yl o wi nl e a v e s e s p e c i a l l yi nm a t u r el e a v e sc o m p a r e dt ot h eo t h e rt i s s u e so ro r g a n s 7 i nr i c et h ee x p r e s s i o no fw e e lw a si n d u c e db ym m st r e a t m e n t a n dt h i si n d u c t i o n o n l yo c c u r r e di nl e a v e s c o n t r a r i l y , c h d le x p r e s s i o nw a sd o w n r e g u l a t e db ym m s t r e a t m e n t 8 c h d lp l a n t sw e r eh y p e r s e n s i t i v et om m st r e a t m e n t t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fw e e l w a sn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tb e t w e e nw i l dt y p ea n dc h d lp l a n t sw h e nt h e yw e r e t r e a t e dw i t hm m si nt h es a m ec o n c e n t r a t i o n 9 t h ew h o l eg e n o m em i c o a r r a ya n a l y s i si n d i c a t e dt h a ta m o u n t so fg e n e sr e l a t e dt o s t r e s sw e r ei n d u c e dt od i f f e r e n te x t e n ti nc h d l 1 0 h i s t o n em o d i f i c a t i o n ss u c ha sh 3 k 4t r i m e t h y l a t i o n ，h 3 k 2 7t r i m e t h y l a t i o na n dh 3 ， h 4a c e t y l a t i o nw e r en o ta f f e c t e di nc h d l c h d lm u t a t i o na n dm m st r e a t m e n td i dn o t a f f e c th 3 k 2 7 t r i m e t h y l a t i o na tw e e l 1 1 p h dd o m a i no fc h d lc o u l db i n dt ot r i m e h 3 怼7 nv i t r oa n d t w ot a d e m c h r o m o d o a m i nc o u l da l s ob i n dt oh i s t o n e sb u tw i t hn os p e c i f i ch i s o t n em o d i f i c a t i o n b i n d i n gs i t e s 1 2 r n a it r a n s g e n i cp l a n t so fl h p lw e r ec o n s t r u c t e db u tn ov i s i b l ep h e n o t y p ew a s o b s e r v e di np o s i t v ep l a n t s r i c el h p lh a ds p l i c i n gi s o f o r m sa n dw e r ed i s t i n c ti n d i f f e r e n td e es u b s p e c i e s 。l h p lw a su b i q u i t i o u s l ye x p r e s s e di nd i f f e r e n td e eo r g a n s y e a s tt w oh y b r i da s s a ys h o w e dt h a tc h r o m o s h a d o wd o m a i no fc h d lc o u l df o r m h o m o z y g o u sd i m e r 1 3 w ef i n do u tad e e - s p e c i f i cg e n ew h i c hw a si n t e r a c t e dw i t hh d a c i ib yy e a s tt w o h y b r i ds c r e e n i n g t h i sg e n ed i d n th a v ec o n s e r v e dd o m a i na n dn oh o m o l o gw a sf o u n d o u ti no t h e rs p e c i e s t h i sg e n es h o w e dp o l y m o r p h i s mb e t w e e ni n d i c aa n d j a p o n i c a s o m en u c l e o t i d ec h a n g e sl e dt oa m i n oa c i d sc h a n g e sa n ds o m ed i dn o t d e l e t i o no f t h y m i n e ( 2 2 ) i ni n d i c aa l l e l el e dt ot h ep r e s t o p n - t e r m i n a lo ft h i sp r o t e i nw a sn o t i n v o l v e di nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h i sp r o t e i na n dh d a c l l i te x p r e s s e di na l l v v i 1 文献综述 1 1 表观遗传学概述 表观遗传学这一概念最早是由w a d d i n g t o n 在1 9 3 9 年提出，在此之前遗传学与 发育生物学一直作为两门独立的学科进行研究，遗传学家只是研究基因的遗传，而 发育生物学家只关心胚胎发生，w a d d i n g t o n 则认为这两门学科其实是有联系的，而 它们之间的联系即表观遗传学所要研究的问题，即基因型产生表型的过程，这是他 提出这一术语时所下的定义。到1 9 4 2 年他又对这一定义做了修订：表观遗传学是生 物学的分支，研究基因与决定表型的基因产物之间的因果关系。 1 1 1 表观遗传学定义 随着生物学的不断发展，表观遗传学的定义也一直在不断更新，1 9 9 4 年h o l l i d a y 曾提出过两种定义：1 ) 研究特定物种中的基因表达的变化，这些物种具有分化的细 胞和能经有丝分裂遗传的基因表达模式；2 ) 不基于d n a 序列变化的核遗传 ( h o l l i d a y , 1 9 9 4 ) ，但它认为这两种定义仍有不足之处，于是在2 0 0 6 年他又对这一定 义进行了修改：表观遗传学可以广泛的定义为可以揭示发育的遗传程序的所有机制 ( h o l l i d a y , 2 0 0 6 b ) 。这个定义中的遗传程序应该是它的核心部分，基因应当怎样合理 地在合适的时期合适的部位表达来完成个体的发育，这就是遗传程序，一旦这种遗 传程序被打乱即使个体所有基因都正常也无法正常的发育。 1 1 2 表观遗传学与经典遗传学 经典遗传学主要研究基因在物种间是如何遗传的，父母本通过d n a 复制来将 自己的全部遗传信息传递给后代，而后代怎样利用这些遗传信息则是表观遗传学要 研究的问题，在一个个体中所有细胞的基因组应该完全一样，但是为什么会分化成 为不同类型的细胞，而同一类型的细胞在分裂的时候是如何保持这种特异性而不转 化为其它类型的细胞呢? 这些都是表观遗传学所要解释的。随着表观遗传学的出现， 其相对于经典遗传学的一些概念也相继被提出，例如，表观突变( e p i m u t a t i o n ) 、表 观基因型( e p i g e n o t y p e ) 、表观基因组( e p l g e n o m e ) 等，而且还有人提出了双重遗 传( d u a li n h e r i t a n c e ) 的概念，即生物体除了具有一套可以遗传的d n a 信息以外还 存在着一套表观遗传信息，这套信息对生物个体的发育以及相应外界环境的信号具 有重要作用( h o l l i d a y , 2 0 0 6 a ) 。 华中农业大学2 0 0 9 届博士研究生学位论文 。 早期认为d n a 甲基化是表观遗传信息的主要载体，d n a 甲基化与基因表达有 密切的关系，高度甲基化的基因通常表达量较低，而低甲基化基因表达量相对较高， 而且这种d n a 甲基化模式是可以遗传的，因此表观突变是指d n a 甲基化发生改变 而d n a 没有任何变化，表观基因型则是指特定区域的d n a 甲基化情况( h o l l i d a y , 2 0 0 5 ) ，而表观基因组是指整个基因组的d n a 甲基化信息，但是现在越来越多的报 道证明组蛋白修饰也可能承载着表观遗传信息，但是这种信息的遗传方式还有待证 明。 1 2 表观遗传调控分子机制 现在普遍认为d n a 甲基化和组蛋白修饰在表观遗传调控基因表达中起重要作 用，但是它们调控基因表达的具体机制还不是很清楚，有人认为d n a 甲基化以后 阻碍了转录因子与d n a 的结合从而抑制基因的表达，而组蛋白修饰则是因为当组 蛋白未发生修饰时氨基末端的碱性氨基酸带正电荷会与带负电荷的d n a 紧密结合 阻碍转录因子与d n a 结合，当这些碱性氨基酸发生修饰后与d n a 的结合不那么紧 密会脱落下来从而使转录因子能结合d n a 促使基因表达。也有人认为d n a 以及组 蛋白的这种修饰仅仅是提供一种信号表明该基因是应当表达还是沉默，而另一些能 够特异识别这些信号的蛋白结合到该区段通过某种机制抑制或者诱导基因的表达。 而现在随着各种文献的报道第二种推测似乎更具有说服力，下面将对表观遗传调控 的分子机制进行简单的描述。 1 2 1 真核生物染色质的结构 真核生物的d n a 通过与组蛋白结合以染色质的形式存在于细胞核中，染色质 是一种纤维状结构，它由最基本的单位核小体成串排列而成。在细胞核的大部 分区域，染色质的折叠压缩程度比较小，细胞着色比较浅，这部分染色质叫做常染 色质，与之相对的有一部分区域如着丝粒或者端粒染色质的折叠压缩比较紧密，细 胞着色比较深，这部分称为异染色质，异染色质又可分为组成型异染色质和机动性 异染色质，前者如卫星d n a ，后者如哺乳动物中的x 染色体。处于异染色质中的基 因一般处于沉默状态，也就是说基因要表达必须处于常染色质中，这是它的必要而 非充分条件。 核小体是构成染色质的基本单位( 图1 ) ，它由2 0 0 b p 的d n a 和组蛋白八聚体 2 水稻染色质调控因子的功能分析 以及组蛋白h 1 所组成，组蛋白八聚体核心颗粒包括两分子的h 2 a 、h 2 b 、h 3 、h 4 ， 核- l , d n a 则位于核心颗粒表面，而位于两个核心颗粒之间的d n a 称之为连接d n a ， 组蛋白h 1 结合与连接d n a 上。五种组蛋白除了h l ，其余四种组蛋白都是n 端富 含碱性氨基酸，c 端富含疏水氨基酸，他们有相互作用形成聚合体的趋势，通过c 端相结合，n 端的碱性氨基酸则与d n a 分子结合。 图1 真核生物染色质的结构 f i g 1c h r o m a t i nc o n f i g u r a t i o ni ne u k a r y o t e 1 2 2d n a 甲基化 d n a 甲基化是指将甲基转移到d n a 胞嘧啶的5 位碳原子上形成5 甲基胞嘧啶， 通常发生在c p g 二核苷酸上，在植物中，c p n p g 和c p n p n p ( n 为除了g 以外的 其它任意氨基酸) 也能被甲基化，d n a 甲基化由d n a 甲基化酶来完成，根据酶的 活性一般可分为两类；第一种是维持甲基化酶( 如d n m t i ) ，负责对于甲基化位点 在d n a 复制过程中新合成子链的甲基化，而d n a 甲基化模式之所以可以遗传有可 能是依靠这种酶的功能；第二种是从头甲基化酶( 如d n m t 3 a 和d n m t 3 b ) ，对新 的位点进行甲基化，通常被认为在发育的早期在建立d n a 甲基化模式中起作用( b i r d ， 2 0 0 2 ) 。现在发现多种表观遗传现象都与d n a 甲基化有关，例如基因组印记、x 染 色体失活以及副突变等等，具体分析其机制发现基因表达的关闭都是由于d n a 的 华中农业火学2 0 0 9 届博： 研究生学位论文 甲基化所造成的( l ie ta 1 ，1 9 9 3 ) ，而越来越多的报道也都证明了这个观点，但是对于 d n a 甲基化抑制基因表达的机制目前还不是很清楚，有人认为可能与组蛋白修饰以 及染色质的结构有关系，现在已经发现能够结合甲基化d n a 的蛋白被称为 m b d ( m e t h y l - c p g b i n d i n gd o m a i np r o t e i n s ) ，而这些蛋白可以招募组蛋白去乙酰化酶 或者组蛋白甲基化酶使组蛋白的修饰发生改变最终引起染色质结构的改变从而抑制 基因的转录( f u k se ta 1 ，2 0 0 3 ；j o n e se ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 1 2 3 组蛋白修饰 真核生物由核心组蛋白八聚体构成，包括h 2 a , h 2 b ，h 3 和h 4 ，在这些组蛋白的n 端或者c 端通常会发生一些修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、s u m o 化 以及a d p 核糖基化( b e r g e r , 2 0 0 7 ) ，而这些修饰对于基因表达调控具有重要作用，下 面将简单进行介绍。 组蛋白乙酰化是一种比较常见的修饰方式，修饰位点主要为赖氨酸( l y s ) ，由 组蛋白乙酰基转移酶( h a t s ) 和组蛋白去乙酰化酶( h d a c s ) 协调进行的，h a t s 将乙酰基加到赖氨酸上而h d a c s 功能相反，现在检测到的位点有h 3 的l v s 9 、l y s l 4 、 l y s l 8 、l y s 2 3 和l y s 5 6 ，h 4 的l y s 5 、l y s 8 、l y s l 2 、l y s l 6 以及h 2 a 和h 2 b ( w a t e r b o r g ， 1 9 9 2 ；w a t e r b o r g , 1 9 9 0 ) ，组蛋白乙酰化修饰与基因表达的关系相对简单，在转录活跃 的染色质区段组蛋白的乙酰化程度较高，而基因沉默区段则较低，但是也有少数文 献报道与这种情况不相符，除了参与基因表达调控，组蛋白乙酰化还与核小体的组 装、染色质的折叠、异染色质沉默有关，这里不作详细介窒f l ( s h a h b a z i a na n dg r u n s t e i n 2 0 0 7 ) 。 组蛋白甲基化相对较复杂，不仅表现在其修饰的位点，而且不同位点的修饰对 基因表达的影响也差异较大，组蛋白甲基化位点主要为赖氨酸( l y s ) 和精氨酸( a r g ) ， 赖氨酸可以发生单甲基化、二甲基化和三甲基化，精氨酸可以发生单甲基化，对称 二甲基化和不对称二甲基化，因此组蛋白甲基化酶可以分为赖氨酸甲基化酶和精氨 酸甲基化酶，而组蛋白去甲基化酶最近几年才被发现，包括l s d l 家族和j m j 家族 两类( s h ie ta 1 ，2 0 0 4 ；t s u k a d ae ta 1 ，2 0 0 6 ) ，现在检测到的组蛋白甲基化位点有h 3 的 l y s 4 、l y s 9 、l y s 2 7 、a r g l 7 、l y s 3 6 、l y s 7 9 和h 4 的a r 9 3 、l y s 2 0 ，其中精氨酸位点 的甲基化主要是激活基因的表达，而赖氨酸的甲基化随着修饰位点的不同与基因表 达的关系基因截然相反，它与基因表达的关系见表1 ，另外，某些甲基化修饰位点 4 水稻染色质调控因子的功能分析 更被认为是染色质状态的标志，例如h 3 k 9 二甲基化代表此染色质区段为异染色质， 而其它修饰位点通常会出现在常染色质，但是不同的物种这种染色质特异修饰位点 有所不m ( f u c h se ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 表1 组蛋白修饰位点及与基因表达的关系 t a b l e1h i s t o n eb i n d i n gs i t e sa n dt h e i re f f e c t so ng e n ee x p r e s s i o n a c e t y l a t e di g s i 懈h 3 ( 9 1 4 。1 8 ，s 6 ) h 4 ( 5 ，8 1 3 1 6 la c t i v a t i o n ( k a c )h 2 a h 2 8 p h o s p h o r y l a t e ds e f i n e h 3 ( 3 1 0 2 8 ) h 2 八h 2 b a c t i v a t i o n t h r e o n l n e ( s t p h ) m e t h y l a t e da r g i n i n e h 30 7 , 2 3 ) 。h 4 ( 3 ) a c t i v a t k m ( r m e ) m e t h y l a t e di y s i n e h 3 他3 6 , 7 9 )a c t i v a t i o n ( k m e ) h 3 ( 9 2 7 ) ，h 4 ( 2 0 ) r e p r e s s i o n u b i q u i t y f a t e di y s i n e h 2 b ( 1 2 3 0 1 2 0 1 ) a c t i v a t i o n (kub)h2a(119q)r e p r e s s k ) n s u m o y l a t e dl y s i n eh 2 b ( 6 7 ) h 2 a ( 1 2 6 )r e p r e s s i o n ( k s u ) i s o m e r i z e d 口r o i 轴eh 3 ( 3 0 - 3 8 )a d w a t i o n ( p i s o m )c e 甜e s s i o n 其它的修饰方式位点相对较少，但对于基因表达调控的影响也不容忽视，例如 组蛋白磷酸化，组蛋白第1 0 位的丝氨酸的磷酸化对基因的激活有重要作用，在哺乳 动物以及果蝇中均证明了某些基因的激活会伴随着组蛋白第十位丝氨酸的磷酸化， 同时也有报道称组蛋白第十位的丝氨酸的磷酸化在有丝分裂时与染色体的凝集有关 ( j o h a n s c na n dj o h a n s e n ，2 0 0 6 ) 。组蛋白的泛素化以及s u m o 化是两种比较大的基团 修饰，组蛋白的泛素化主要发生在h 2 a k l l 9 和h 2 b k l 2 3 ，这两个位点的泛素化修饰 对于基因的转录有着相反的作用，h 2 a k l l 9 泛素化通常会抑制基因的转录而 h 2 b k l 2 3 泛素化则激活基因的转录，组蛋白的s u m o 化主要发生在h 2 b k 6 7 和 h 2 a k l 2 6 ，组蛋白的这种修饰通常会抑制基因的表达。 组蛋白的这些修饰并不是孤立存在的，它们之间既有协同作用又有拮抗作用， 例如组蛋白h 3 s 1 0 的磷酸化促进h 3 k 9 和h 3 k 1 4 的乙酰化而阻碍h 3 k 9 的甲基化， 相反h 3 k 9 的甲基化会阻碍h 3 s 1 0 的磷酸化以及h 3 k 9 和h 3 k 1 4 的乙酰化。在哺乳 动物中发现h 3 k 1 8 和h 3 k 2 3 的乙酰化会促进h 3 r 1 7 的甲基化从而激活雌激素应答 相关的基因( s u g a n u m aa n dw o r k m a n ，2 0 0 8 ) 。除了上述这种顺式组蛋白作用 ( c i s h i s t o n e ，即相互影响的修饰发生在同一个组蛋白上) ，还存在一些反式组蛋白 作用( t r a n s h i s t o n e ，即相互影响的修饰发生在不同的组蛋白上) ，例如h 3 k 4 和h 3 k 7 9 的甲基化需要h 2 b 的泛素化，而h 4 r 3 的甲基化是h 3 乙酰化所必须的( h u a n ge ta 1 ， 2 0 0 5 ；s u g a n u m aa n dw o r k m a n ，2 0 0 8 ) 。 誊_ 务 华中农业大学2 0 0 9 届博士研究生学位论文 1 2 4 表观修饰信号的识别 现在已经发现有许多结构域可以结合特异的组蛋白修饰位点，而报道相对较多 的是c h r o m o d o m a i n 平n p h d 锌指结构域，它们都可以与三甲基化的赖氨酸结合，但是 它们结合的位点有差异，而且不同的蛋白中相同的结构域所结合的位点也不同。对 于唧1 和p c 蛋白的c h r o m o d o m a i n 已经有了较为详细的研究，h p l 的c h r o m o d o m a i n 识 别并结合三甲基化h 3 k 9 ，但是这个结合发生的时候组蛋白h 3 的g l n 5 s e r l o 均参与了 ab y c 图2h p l 和p c 的c h r o m o d o m a i n 与组蛋白结合的结构示意图 f i g 2t h es t r u c t u r a ld i a g r a mo f h i s t o n eb i n d i n gt oh p la n dp ec h r o m o d o m a i n a h p i ( 绿色) 和p c ( 蓝色) 的c h r o m o d o m a i n 中的三个芳香氨基酸与三甲基化赖氨酸 ( t r i m e h 3 k 9 ( 黄色) ，t r i m e h 3 k 2 7 ( 红色) ) 的结合示意图。 b p c 与组蛋白结合的立体图 c h p i 与组蛋白结合的立体图 a t h ed i a g r a mo f t h r e ea r o m a t i cr e s i d u e si nh p l ( g r e e n ) a n dp c ( b l u e ) c h r o m o d o m a i nb i n d i n gt o t r i m e t