（分析化学专业论文）基于纳米沸石的生物传感器的研究.pdf

摘要 生物传感器是一门涉及化学，生物学，材料学，电子技术等诸多领域的交叉 学科，在临床医学、工农业生产、环境保护等许多领域有着广阔的应用前景。在 生物传感器的研究中，酶基电化学生物传感器是十分重要的一类。而对于研制酶 生物传感器，生物分子的固定化是一个关键因素。纳米材料颗粒比表面积大、表 面自由能高，吸阳能力较强，使更多的酶分子可以固定在纳米颗粒表面上。另外， 由于纳米颗粒尺寸很小，有可能与酶内部的亲水基团发生作用，从而引起酶构型 上的变化。这种变化使得酶的活性中心更接近底物，提高了酶的催化效率。纳米 沸石( n a n o z e o l i t e ) 作为新型纳米材料，除具有上述纳米材料的一般特征外，还具 有在溶液相和有机相中良好的分散性，表面电荷易调控，适合组装成膜等特点， 是固定生物分子的良好载体。本论文首先研究基于纳米沸石的生物传感器的制 作，进而用电分析化学的方法研究层层组装( l a y e r - b y - l a y e r , l b l ) 的纳米沸石膜 对酶的吸附能力，最后将纳米沸石组装膜应用于酶生物传感器和酶微反应器的制 作和研究中。论文包括以下四部分内容： 1 概述纳米材料及其在生物传感器中的应用 从以下几个方面对该领域研究概况进行评述 ( 1 ) 生物传感器的概念及制作 ( 2 ) 纳米材料及其在生物传感器中的应用 ( 3 ) 层层组装技术在传感器中的应用 ( 4 ) 本论文工作的目的与意义 2 基于纳米沸石的过氧化氢生物传感器的研究 本实验通过纳米沸石溶胶及纳米沸石组装膜分别固定辣根过氧化物制备新 型过氧化氢生物传感器。前种方法制作的酶传感器存在不稳定、使用寿命短的问 题，而后者能很好的克服这个缺点并具有优良的性能。工作条件经优化后，该传 感器在2 5 c ，外加电压为- 0 2 5 v ，p h7 4 缓冲溶液中检测h 2 0 2 溶液的线性范围 为2 x 1 0 4 m 1 o x l 0 4m ，检测限为l x l o m 。传感器有良好的重现性和稳定性， 在使用一个月后，仍能保持其响应活性的8 0 。实验说明纳米沸石是固定酶分子 良好的载体，为酶分子提供了适宜的微环境使固定化的酶能长期保持活性，在固 定化酶生物传感器的研究中有良好的应用前景。 3 纳米沸石组装的表面及其应用于酪氨酸酶传感器的研究 本实验通过纳米沸石与阳离子聚电解质采用层层组装技术( l b l ) 在导电玻璃 电极上构建功能性的表面，并用石英晶体微天平监测该组装膜的形成过程和酪氨 酸酶在该组装膜上的吸附行为。实验数据表明该表面具有很强的吸附酶的能力 ( 大约每l 克纳米沸石可吸附3 5 0 m g 的酪氨酸酶) 。将该组装膜应用于传感器的制 作并用其检测溶液中痕量的苯酚，具有很高的灵敏度( 4 0 0p am m 。1 ) 、低的检出 限( 0 5n m ) 和较宽的线性范围( 1 0n m 1 8 p m ) 。同时通过改变沸石的组装层数可调 控酶的负载量，从而控制酶电极的催化性能。由上述事实可见纳米沸石组装膜有 良好的生物相容性、强的固酶能力及可调控性，在生物分子固定方面具有很大的 应用潜力，在生物传感器、酶反应器等纳米生物器件中有广泛的应用前景。 4 纳米沸石组装的表面应用于芯片酶微反应器的研究 本实验利用层层组装的纳米沸石膜修饰p e t 芯片微通道内表面，并在通道 内固定胰蛋白酶制作出芯片酶反应器。( n a n o z e o l i t e p d d a ) n 多层膜提供了一个 亲水性和生物相容性的界面，使固定化的胰蛋白酶仍保持良好的催化活性，同时 由于大量的胰蛋白酶被限定在微通道中，使得标准蛋白质在该酶反应器上能实现 快速高效的酶解，酶解效率( 3 5 0m mm i n 。r t g 1 ) 远远优于传统溶液酶解的方法。 结合基质辅助激光解析离子化飞行时问质谱( m a l d i t o fm s ) 检测，该芯片微反 应器能够酶解低至o 5i _ t g m l 标准蛋白样品，并得到可信度较高的肽段质谱鉴定 图谱。该固定化酶的芯片酶微反应器制作简单，性能优越，有望应用于实际样品 的酶解和鉴定，为蛋白质的鉴定提供了新研究方法。 关键词：纳米沸石，层层组装，酶固定化，电化学，生物传感器，芯片微反应器 l i a b s t r a c t b i o s e n s o r sh a v ed e v e l o p e dt ob eaf r o n t i e ra n di n t e r d i s c i p l i n a r yi n c l u d i n g c h e m i s t r y , b i o l o g y , m a t e r i a l ，m e d i c a l s c i e n c ea n de l e c t r o n i c s e l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o ri se x t e n s i v e l yi n v e s t i g a t e da n db e c o m e so n eo ft h em o s tp r a c t i c a la n d p r o s p e c t i v ed e v i c e sa m o n ga l l k i n d so fb i o s e n s o r s ，av e r yi m p o r t a n tf a c t o ri n b i o s e n s o r d e v e l o p m e n t i st h ei m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e s t h e r e c e n t l y d e v e l o p m e n to fn a n o m a t e r i a lp r o v i d e san e wo p p o r t u n i t yt ot h eb r e a k t h r o u g hi n b i o s e n s o r s n a n o p a r t i c l e sh a v eu n i q u ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e s ：t h e yh a v eh u g e s u r f a c ea r e aa n ds u r f a c ee f f e c t , w h i c hi sg o o df o ri m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e s ； a n db e c a u s eo ft h e i ru l t r as m a l ls i z ea n dh i g h e rs u r f a c ee n e r g y , t h e yc a ni n c r e a s e d c h e m i c a la n db i o l o g i c a la c t i v i t i e so fi m m o b i l i z e db i o m o l e c u l e sa n di m p r o v et h e i r c a t a l y t i cp e r f o r m a n c e a san e wn a n o m a t e r i a l ，n a n o z e o l i t e sp o s s e s ss p e c i a ls u r f a c e p r o p e r t i e s ，i n c l u d i n gl a r g e a n dc l e a ns u r f a c ew i t h o u ta n yp r o t e c t i o n o r s u r f a c e m o d i f y i n ga g e n t ，a d j u s t a b l es u r f a c ec h a r g ea n dc o m p o s i t i o n ，a n d s t a b l e c o l l o i d a lp r o p e r t yi nb o t ha q u e o u sa n d o r g a n i cs o l u t i o n s ，w h i c hm a k et h e ms u i t a b l ea s b u i l d i n gb l o c k st of a b r i c a t ef u n c t i o n a ls u r f a c ef o rt h ei m m o b i l i z a t i o no f b i o m o l e c u l e s i nt h i st h e s i s ，w eh a v ef a b r i c a t e db i o s e n s o r sb a s e do nn a n o z e o l i t e ，a n dt h e n i n v e s t i g a t e dt h ee n z y m e i m m o b i l i z a t i o nc a p a c i t yo fl a y e r - b y l a y e ra s s e m b l e d n a n o z e o l i t ef i l m ，a tl a s ta p p l i e dt h i sf i l mi nb i o s e n s o ra n db i o r e a c t o r 1 i n t r o d u c t i o no fn a n o m a t e r i a la n di t sa p p l i c a t i o ni nb i o s e n s o r ar e v i e wo nn a n o m a t e r i a la n di t sa p p l i c a t i o ni nb i o s e n s o r si sp r e s e n t e d a s p e c t sd e t a i l r e v i e w e di n c l u d e ： ( 1 ) i n t r o d u c t i o no f b i o s e n s o r s ( 2 ) i n t r o d u c t i o no f n a n o m a t e r i a la n d i t sa p p l i c a t i o ni nb i o s e u s o r s ( 3 ) l a y e r - b y l a y e rt e c h n o l o g ya n di t sa p p l i c a t i o ni nb i o s e n s o r s ( 4 ) c o n c l u s i o no f t h i st h e s i s 1 1 1 2 n a n o z e o l i t ed e r i v e da m p e r o m e r t i cb i a s e n s o rf o rh y d r o g e np e r o x i d e an o v e lb i o s e n s o rf o rt h ea m p e r o m e t d cd e t e c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d ew a s d e v e l o p e db a s e d o nt h ei m m o b i l i z a t i o no fh o r s e r a d i s h p e m x i d a s e ( h r v ) o n n a n o z e o l i t ec o l l o i da n dn a n o z e o l i t em u l t i l a y e r - a s s e m b l yf i l mr e s p e c t i v e l y t h ef o r m e r b i o s e n s o rs h o w e dw e a k s t a b i l i t y a n dt h eb i o s e n s o rb a s eo nn a n o z e o l i t e m u l t i l a y e r - a s s e m b l yf i l ms h o w e dg o o dp e r f o r m a n c e ：b r o a dl i n e a rr e s p o n s er a n g e f r o m2 o 1 0 由mt o1 0 x 1 0 - 4ma n dl o wd e t e c t i o nl i m i t ( 1 1 0 - 6 m ) a n dr e m a i n e d8 0 o f i t so r i g i n a la c t i v i t ya f t e ro n e m o n t ho p e r a t i o n 3 n a n o z e o l i t e a s s e m b l e di n t e r f a c ea n di t s a p p l i c a t i o n t o w a r d ss e n s i t i v e b i o s e n s i n g ab i o c o m p a t i b l es u r f a c eh a sb e e nc o n s t r u c t e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c ev i a l a y e r - b y l a y e ra s s e m b l y o fb e t a - n a n o z e o l i t e sa n d p o l y d i a l l y l d i m e t h y l a n u n o n i u m ( p d d a ) f o rt h ea d s o r p t i o no fe n z y m e st o w a r d ss e n s i t i v eb i o s e n s i n g t h ef i l m a s s e m b l yp r o c e s sa n de n z y m ea d s o r p t i o nw e r em o n i t o r e db yq u a r t zc r y s t a l m i c r o b a l a n c em e a s u r e m e n t s t h en a n o z e o l i t ef i l me x h i b i t e da l la m a z i n ga d s o r p t i o n c a p a c i t y ( a b o u t3 5 0m g g ) f o rt y r o s i n a s ea sam o d e le n z y m e t h et y r o s i n a s eb i o s e n s o r b a s e do nt h i sb i o c o m p a t i b l es u r f a c es h o w e da h i g hs e n s i t i v i t y ( 4 0 0l a am m “) ，s h o r t r e s p o n s et i m e ( r e a c h9 5 w i t h i n5 s ) ，b r o a dl i n e a rr e s p o n s er a n g ef r o m1 0n m 一1 8p m ， v e r yl o wd e t e c t i o nl i m i t ( 0 5n m ) a n dh i 曲o p e r a t i o n a la n ds t o r a g es t a b i l i t y ( m o r e t h a n2m o n t h s ) t h ea p p a r e n tm i c h a e l i s m e n t e nc o n s t a n tk 胃w a sc a l c u l a t e dt ob e 2 4u mu s i n gp h e n o la st h es u b s t r a t e t h ea s s e m b l y c o n t r o l l e dn a n o z e o l i t ef i l mc o u l d p r o v i d eab i o c o m p a t i b l ef u n c t i o n a ls u r f a c ef o rt h ei n t e r a c t i o ns t u d yb e t w e e ne n z y m e s a n dt a r g e tm o l e c u l e s 4 a p p l i c a t i o no fn a n o z e o l i t e a s s e m b l e di n t e r f a c ei nm i e r o e h i pr e a c t o r st o w a r d s p r o t e i nd i g e s t i o n a no n c h i pm i c r o r e a e t o rw a sp r o p o s e dt o w a r d st h ea c c e l e r a t i o no fp r o t e i n d i g e s t i o nw i t ht h ec o n f i n e m e n to fan a n o z e o l i t e a s s e m b l e dm i c r o f l u i d i cn e t w o r k t h e c o n t r o l l e dt r y p s i n c o n t a i n i n gn a n o z e o l i t em u l t i l a y e r sw i t h i nap e tm i c r o c h a n n e l p r o v i d eal a r g es u r f a c e - t o v o l u m er a t i os t a t i o n a r yp h a s ef o rh i g h l ye f f i c i e n tp r o t e o l y s i s o fp r o t e i n sa tl o wl e v e l t h em i c r o s t r u c t u r e d c o a t i n gw a sa s s e m b l e du s i n g a l a y e r - b y l a y e rd e p o s i t i o no fp d d aa n dz e o l i t en a n o p a r t i c l e s t h em a x i m u m p r o t e o l y t i cr a t eo ft h ea d s o r b e dt r y p s i nw a sk i n e t i c a l l ym e a s u r e da b o u t3 5 0m m m i n l 嵋，m u c hf a s t e rt h a nt h a ti ns o l u t i o n ( o 2m m m i n - 1 哼1 ) d u et ot h em i c r o f l u i d i c c o n f i n e m e n te f f e c ta n dt h eb i o c o m p a t i b l em i c r o e n v i m n m e n tp r o v i d e db yt h e n a n o z e o l i t e ，t h el o w - l e v e ls t a n d a r dp r o t e i n ( 0 5p g m l ) w a sc o n f i d e n t l yi d e n t i f i e d u s i n gt h ea s p r e p a r e dm i c r o r e a c t o rw i t h i nav e r ys h o r tr e s i d e n c et i m eo f af e ws e c o n d s c o u p l e dt om a l d i t o fm s d e t e c t i o n k e yw o r d s ：n a n o z e o l i t e ，l a y e r - b y - l a y e r , e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n , e l e c t r o c h e m i c a l ， b i o s e n s o r , m i e r o c h i pr e a c t o r v 论文独创性声明 术论文是我个人在导师指导f 进行的研究_ 作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名：围哇登f _ i 期：趔：丝 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：因喳爱导师签名：f 1 期：! 虹：丝 复旦大学硕士学位论文 第一章 第一章绪论 现代分析化学的各种新兴技术中，生物传感器作为直接或间接分析和检测各 种生命物质和化学物质的新方法，由于具有灵敏度高、响应快、操作简便、样品 用量少、可微型化等特点，在环境监测、医学研究、食品工业、发酵工业等领域 已得到广泛应用【l 卅。纳米技术主要是针对尺度为l n m - l o o n m 之间的分子世 界的- n 技术。该尺寸处在原子、分子为代表的微观世界和宏观物体的交界的过 渡区域，基于此尺寸的的系统既非典型的微观系统又非典型的宏观系统，具有独 特的性质，如表面效应、微尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应等，因此纳 米材料呈现出常规材料不具备的优越性能。将纳米技术引入到生物传感器领域 后，使生物传感器具有亚微米尺寸的换能器、探针，从而灵敏度等性能得以提高， 促进了新型生物传感器的产生和发展。目i i 基于纳米材料的生物传感器已成为研 究的热点，本章的内容就生物传感器的研究与制备、纳米材料的特性及其在生物 传感器中的应用等相关内容作介绍。 1 生物传感器概述 1 1 生物传感器 生物传感器是化学传感器的一个分支，是由固定化的生物敏感材料作识别元 件( 包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质) 与适当 的理化换能器( 如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等) 及信号放大装置构 成的分析工具或系统。 生物传感器主要由两部分组成，一是分子识别部件( 感应器、感受器) ，是 由对被测定的物质( 底物) 具有高选择性分子识别功能的膜构成( 如酶、微生物、 动植物组织切片、抗原或抗体和核酸等) ；二是信号转换部件( 转换器、换能器) ， 它能把膜上进行生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光、热等转化为电 信号，最后把所得的电信号经电子技术的处理后，在仪器上显示或记录下来。其 原理如图1 所示：待测物经扩散进入固定化生物敏感膜层，经分子识别，发生生 复旦大学硕士学位论文第一章 物学反应，产生的信息被相应的化学或物理换能器转变成可定量处理的电信号， 再经二次仪表放大并输出，从面达到分析检测的目的。 q 被涮物质 簟 担 诅嬲帮件转丧部件 l 、厂一 生黼髓 图l 生物传感器的组成及原理示意图 生物传感器的种类，按照其感受器中所采用的生物活性物质分类，可分为： 酶传感器、微生物传感器、免疫传感器，细胞传感器、组织传感器、d n a 传感 器等；按照其信号转换部件分类，可分为：电化学生物传感器、热敏生物传感器、 光学生物传感器、压电生物传感器、半导体生物传感器等。 在各类生物传感器中，由于电化学转换器件具有较高的灵敏度，易微型化， 能在浑浊的溶液中操作等许多优势，并且所需的仪器简单、便宜，因而与电化学 基础电极相结合的电化学生物传感器是非常重要的一类。由于酶分子结合了高度 的化学特异性和固有的生物催化信号放大功能，生物传感器发展至今，酶仍然是 最适当的生物识别元件。与电化学方法特有的优点相联合，使得酶基电化学生物 传感器一直是生物传感器研究的主流【5 1 0 】。本论文的研究工作集中在基于纳米 材料修饰的表面固定酶及在酶电化学生物传感器中的应用展开。 1 2 电化学生物传感器的制作f 1 1 】 根据生物传感器的定义，生物识别元件和信号转换器件应保持直接的空间接 触，因此生物传感器的构造就是涉及将上述两个部分通过恰当的方式紧密地结合 起来。这需要三个步骤：首先选择生物识别元件，然后选择信号转换器，最后固 定生物组分到转换器上。 2 复旦大学硕士学位论文第一章 ( 1 ) 生物识别组分的选择 生物传感器上直接和待检测物质接触的是具有特异性识别功能的生物分子。 构成分子识别元件的生物活性物质不仅要求对待测物有识别功能，即显示出选择 的亲合性，而且必须能产生一种能被换能器所检测的生物物理化学作用。目前的 生物传感器中，生物活性物质的分子识别一般涉及到生物催化、免疫化学反应、 化学接受等过程，可作为生物活性物质的有酶、微生物、动植物组织切片、抗原 或抗体和核酸等。 酶是生物催化中最常使用的生物识别分子，具有高效、专一、反应条件温和 等特点，还可结合化学修饰电极进行表面结构和功能的特异性设计，因此酶电化 学生物传感器一直是研究热点。对于应用于复杂的反应过程的生物传感受器来 说，使用微生物或细胞更方便一些，而且在合适的培养基中微生物能再生，以补 充失活的微生物，所以微生物传感器使用寿命长而具有很好的应用前景，但它的 选择性和长期稳定性等还有待进一步提高。直接采用动植物组织切片作为敏感元 件的组织传感器，其原理是利用动植物组织中的酶，优点是酶的活性及其稳定性 均比离析酶高，材料易于获取，制备简单，使用寿命长等，但在选择性、灵敏度、 响应时间等方面还存在不足。 ( 2 信号转换器的选择 信号转换器提供生物识别元件发生反应的证据。信号转换器的选择依赖于反 应的类型和底液中物质的释放或消耗。如第一支酶电极就是采用c l a r k 型氧电极 检测0 2 的消耗，而近几年发展起来的表面等离子共振仪非常适合检测抗原和抗体 问的特异性结合作用。另外，信号转换器的选择也取决于所构造的生物传感器所 预期的应用。如果所构造的生物传感器是用在生物环境中，必须满足生物相容性 的标准，尤其要考虑关于蛋白质，磷脂或细胞在其表面的沉积作用。如果是用在 活体中，必须减小尺寸，并且形状应适合以致于对活体组织不能引起过多的损害。 ( 3 ) 生物组分的固定化 当选择好生物识别组分和信号转换器后，如何将生物活性物质固定到信号转 换器上并确保传感器的优良性能( 如灵敏度、选择性和稳定性等) 则是传感器制 作中最关键的步骤。选择理想的固定方法应该满足以下几个条件： a 固定后的生物识别分子仍能保持良好的活性。 复旦大学硕士学位论文 第一章 b 生物膜与转换器须紧密接触，且能适应多种测试环境。 c 固化层要有良好的稳定性与耐用性。 d 减少生物膜中生物组分的相互作用以保持其原有的高度选择性。 为了研制价格低，灵敏度高，选择性好和寿命长的生物传感器，生物识别分 子固定化技术显得非常重要。经过多年来的不断努力，已经建立了对各种不同的 分子功能物质的固定化方法，主要包括夹心法，吸附法，包埋法，共价键合法， 交联法等，如图2 所示。现已报道的较为成熟的固定方法可归纳如下。【1 2 ，1 3 】 攀爹蘩 筝辫 ( a ) 夹心法，( b ) 吸附法，( c ) 包埋法，( d ) 共价键法，( e ) 交联法 图2 生物分子的固定方法 ( a ) 夹心法：夹心法是将生物组分封闭在双层滤膜或电极滤膜之间，这种方 法用于酶反应器和早期的传感器中。 ( b ) 吸附法：吸附法需要先在电极表面修饰上载体分子，然后将生物功能物 质吸附到载体分子上。它是一种较温和的固定方法，对生物功能分子活性影响小， 能有效的保持生物功能分子的活性。但这种方法的生物功能分子负载量较低，容 易导致传感器灵敏度较低。近年来，随着纳米材料应用到生物传感器中，生物功 能分子负载量的问题得到很大程度上解决。 ( 包埋法：包埋法是将生物分子包埋在聚合物胶、膜等三维空间网状结构 中，包埋物质不易渗漏，最早是采用n a f i o n ，聚氯乙烯、聚碳酸脂、聚乙酞胺等 高分子膜中，但发现有在聚合物内生物活性降低的问题。 ( d ) 共价键法：共价键法是通过共价键将生物分子固化在固体表面，相对比 较稳定，不易发生脱附，但是生物功能分子与固体本身键合导致灵敏度降低或失 活，操作复杂，耗时，成本高。 4 复旦大学硕士学位论文 第一章 ( c ) 交联法：用戊二醛等双功能团试剂，使生物分子以共价键交联在固体表 面，其缺点是难以控制，形成的生物分子层比较膨松，导致扩散阻力大，且需要 的试剂量比较大，容易引起生物分子活性降低。 2 纳米材料及其在生物传感器中的应用 2 j 纳米材料发展概况 纳米技术是指在0 1 l o o n m 尺度空问内，研究电子、原子、分子的运动规律 和特性，从而研究在纳米尺度范围内物质所具有的物化性质、功能及其应用的高 新技术，其含义包括纳米材料设计、制造、测量、控制和产品。在纳米材料的发 展初期，纳米材料是指纳米颗粒和由它们够成的纳米薄膜和固体，现在广义的纳 米材料是指在三维空间中至少有维处于纳米尺度范围，或由它们作为基本单元 构成的材料。 纵观纳米材料发展的历史，大致可划分为三个阶段 1 4 1 。第一阶段( 1 9 9 0 年 以6 n ，主要是在实验室探索中合成、制备各种材料的纳米颗粒粉体并形成块体 的方法和手段( 包括薄膜1 ，研究评估表征的方法，探索纳米材料不同于常规材 料的特殊性能对纳米颗粒和纳米块体材料结构的研究在2 0 世纪8 0 年代末期 一度形成热潮研究的对象一般局限在单一材料和单相材料，国际上通常把这 类纳米材料称为纳米晶或纳米相材料第二阶段( 1 9 9 4 年以| i i ) ，人们关注的热 点是如何利用纳米材料所具有的奇特的物理、化学和力学性能，设计纳米复合 材料，通常采用纳米微粒和纳米微粒复合，纳米微粒和常规块体复合及发展复 合纳米薄膜，国际上通常把这类材料称为纳米复合材料这一阶段的纳米复合 材料的合成及物性的探索一度成为纳米材料研究的主导方向。第三阶段f 从1 9 9 4 年到现在) ，纳米组装体系、人工组装合成的纳米结构的材料体系或者被称为纳 米尺寸的图案材料越来越受到人们的关注它的基本内涵是以纳米颗粒以及纳 米丝、纳米管为基本单元在一维、二维和三维空i 、日j 组装排列成具有纳米结构的 体系，其中包括纳米陈列体系，介孔组装体系，薄膜嵌镶体系，纳米颗粒、丝、 管可以有序地排列如果说第一阶段和第二阶段的研究在某种程度上带有一定 的随机性，那么这一阶段的研究特点更强调按人们的意愿设计、组装、创造新 的体系，使该体系具有人们所希望的特性。 5 复旦大学硕士学位论文第一章 2 2 纳米材料的分类 广义上，纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或由它们 作为基本单元构成的材料，即纳米材料是物质以纳米结构按一定方式组装成的 体系，或纳米结构排列于一定基体中分散形成的体系，包括纳米超微粒子、纳米 块体材科和纳米复合材料等。组成纳米材料的基本单元在维数上可分为三类： 零维。指在空| 日j 三维尺寸均在纳米尺度内。如纳米尺度颗粒、原子簇等；一维。 指在空间有两维处于纳米尺度，如纳米丝、纳米棒、纳米管等；二维。是指在 三维空间中有维处于纳米尺度，如超薄膜、多层膜、超晶格等。构成纳米材料 的物质的类别可以有多种，分为金属纳米材料、半导体纳米材料、纳米陶瓷材料、 有机一无机纳米复合材料及纳米介孑l 固体与介孔复合体材料等。 2 3 纳米材料的特性1 1 5 1 1 ，j 、尺寸效应 当纳米微粒尺寸与光波的波长、传导电子的德布罗意波长以 及超导念的相干长度或穿透深度等物理特征尺寸相当时，晶体周期性的边界条件 将被破坏，声、光、力、热、电、磁、内压、化学活性等与普通粒子相比均有很 大变化，这就是纳米粒子的小尺寸效应( 也称体积效应) 。 2 表面与界面效应纳米微粒由于尺寸小，表面积大，表面能高，位于表面 的原子占相当大的比例。这些表面原子处于严重的缺位状冬，因此其活性极高， 极不稳定，遇见其它原子时很快结合，使其稳定化。这种活性就是表面效应。 3 量子尺寸效应当粒子尺寸下降到最低值时，费密能级附近的电子能级会 由准连续念变为分立能级，吸收光谱闽值向短波方向移动，纳米微粒的声、光、 电、磁、热以及超导性与宏观特性有着显著的不同，称为量子尺寸效应。 4 介电限域效应 当半导体超微粒表面被修饰以某种介电常数较小的材料 时，由于比表面积随微粒尺寸的减小不断增大，显著影响了其性质。 5 宏观量子隧道效应隧道效应是指微观粒子具有贯穿势垒的能力，后来人 们发现一些宏观量，如磁化强度、量子相干器件中的磁通量等也具有隧道效应， 称之为宏观量子隧道效应。 2 4 纳米材料的制备方法【1 6 1 8 】 复旦大学硕士学位论文第一章 纳米材料的合成与制备一直是纳米科学领域的一个重要的研究课题。目前纳 米材料的制各方法，以物料状态来分可归纳为固相法、液楣法和气相法三大类。 1 气相法是直接利用气体或者通过各种手段将物质变成气体，使在气体状态 下发生物理变化或化学反应，最后在冷却过程中凝聚长大形成纳米微粒。气相法 可制各出纯度高、颗粒分散性好、粒径分布窄而细的纳米微粒。 2 液相法是以均相溶液为出发点，通过各种方法使溶质和溶剂分离，并使溶 质形成一定形状和大小的颗粒，得到所需粉末的前躯体，热解后得到纳米微粒。 液相法主要有沉淀法，水解法，喷雾法，溶剂热法，氧化还原法，乳液法，溶胶 凝胶法等。 3 ，固相法是通过从固相到固相的变化来制备粉体。固相法的原料是固体，所 得固相粉体产品和最初固相原料可以是统一物质，也可以不是统一物质。 按照途径的不同，纳米材料的制备可分为物理方法和化学方法。其中物理方 法又包括蒸汽冷凝法、物理破碎法、机械球磨法、非晶晶化法、等离子体沉积法 和溅射法；化学方法包括溶胶凝胶法、微乳液法、喷雾热解法、金属醇赫水解 法、化学沉淀法等。 2 5 纳米材料在电化学生物传感器中的应用 纳米技术是用单个原子、分子制造物质的科学技术，纳米材料从根本上改变 了材料的结构，被公认为是2 1 世纪最具有前途的科研领域。近年来，纳米技术 逐步进入生物传感器领域后，提高了生物传感器的检测性能，促进了新型生物传 感器的产生和发展。下面就几种纳米材料在生物传感器上的应用分别进行介绍。 ( 1 ) 纳米颗粒在电化学生物传感器中的应用 1 9 2 2 1 纳米颗粒标记 纳米颗粒，如会和银纳米颗粒，现在被用于生物分子的标记或生物组织的着 色，从而被作为成像和观察生物学过程的有效方法。纳米颗粒可以用来定位肿瘤， 荧光素标记的识别因子，与肿瘤受体结合，可以在体外用仪器显影确定肿瘤的大 小和位置。另一个重要的方法是用纳米磁性颗粒标记识别因子，与肿瘤表面的靶 标识别器结合后，在体外测定磁性颗粒在体内的分布和位置，从而给肿瘤定位。 纳米颗粒用作固定载体 7 复旦大学硕士学位论文 第一章 纳米粒子具有高比表面积，用于生物分子的固定，可以增加固定的分子数量， 从面增强反应信号。研究表明，多种酶可以牢固地吸附在会纳米颗粒表面，并且 能保留其催化活性，所以纳米金胶逐渐被用于固定化酶。c h e n 等【2 3 时艮道了将金 电极表面通过巯基功能化，随后吸附会纳米颗粒，最后将血红蛋白、辣根过氧化 物酶通过静电作用吸附到金胶表面，实现了其直接电化学响应。c a i 等 2 4 1 把金纳 米颗粒固定在胱氨酸修饰的金电极表面，增大了有效固定面积，使得检测下限 延长。l ig e n x i 等 2 5 1 将纳米银溶胶与肌红蛋白混和膜修饰于热解石墨电极表面 上，得到了肌红蛋白可逆的氧化还原峰，对有较好的催化活性。s i n g h 等人1 2 6 1 用s 0 1 g e l 方法合成硅纳米颗粒，该纳米颗粒用于固定乙酰胆碱脂酶，具有较高 的比表活性，结合离子敏场效应管检测，响应迅速，灵敏度高。除外，纳米无机 氧化物也是一种适合于固定酶和蛋白质的新型纳米材料，这些纳米无机氧化物材 料具有多孔结构，热稳定和化学稳定性好等优点，能有效提高生物分子的固定量。 例如t i 0 2 ，z r 0 2 和s i 0 2 等纳米颗粒已经被广泛用于固定酶和各种电子传递媒介。 ( 2 ) 纳米微管在电化学生物传感器中的应用 碳纳米管 碳纳米管( c n t ) 是由碳原子形成的石墨片卷曲而成的无缝、中空的管体，是 一种纳米尺度的具有完整分子结构的新型碳材料，它所表现出的许多优良的物理 化学特性以及潜在的应用前景使得对c n t 的研究成为倍受关注的前沿课题。碳 纳米管的比表面积大，孔径大小在一定范围内可控，再加上优良的导电性能促进 生物电活性分子的电子传递，是一种良好的生物传感器的材料。据报道，a z a m i a n 等【2 7 】曾在单壁碳纳米管( s w n t ) 表面固定葡萄糖氧化酶( g o x ) ，结果发现对于相 同浓度的葡萄糖溶液，g o x s w n t 玻碳电极的催化响应电流l l g o x 玻碳电极提 高了一个数量级。l u ohx 等 2 8 1 研究了s 、价盯修饰电极对生物分子的电催化作 用，实验表明s w n t 修饰电极对肾上腺素、抗坏血酸( a 有类似的电催化作用。 把碳纳米管分散于n a f i o n 2 9 、壳聚糖p d 】等高聚物的溶液中修饰玻碳电极制备的 生物传感器，大大提高了传感器的响应灵敏度和抗干扰能力。例如z h a n gm g 等 【3 0 1 将多壁碳纳米管分散于天然生物高聚物壳聚糖中成膜，并通过交联法固定葡 萄糖脱氢酶制作的传感器对葡萄糖有很好的响应性能，在5um 至1 3 m m 葡萄糖 浓度范围内具有线性响应关系，灵敏度高达8 0 m a m - 1 c m ，响应时间小于5 s ， 复旦大学硕士学位论文 第一章 检测限可达到3pm 葡萄糖。 其他纳米微管 m i a o 等人 3 1 1 介绍了一种新的固定化方法聚吡咯纳米微管固定法。聚吡咯 微管是基于模板合成方法而得到的一种纳米微管，也就是利用化学或电化学方法 使毗咯单体在模板孔隙中生长，以得到与模扳相应结构的纳米管。这种微管具有 统一直径，上下连通，管壁多孑l 的特点。它具有较大的比表面积，能容纳大量的 酶分子，并减少反应物和产物的扩散障碍，有效地提高酶电极的性能。 3 层层组装技术在传感器中的应用 九十年代初期，d e h e r 等【3 2 】提出层层组装( l a y e r - b y l a y e r ，l b l ) 的概念， 为纳米超薄膜和纳米复合膜的制备及使用提供了峰实的基础。l b l 静电组装技术 是基于聚电解质分子在液固界面的静电吸附，交替沉积的关键在于吸附下一层聚 电解质时，会有稍过量的带相反电荷的聚电解质分子吸附在| ；i f 一层上，使基片表 面带上相反的电荷，从而保证了膜的连续生长( 如图3 ) 。整个过程易于自动化操 作，适用于各种聚电解质、纳米颗粒、胶体粒子及生物活性大分子等纳米尺度的 物质在几乎所有可能的基底上进行组装。通过这种技术组装得到的膜厚度可调， 重现性好，具有高的单一性和长期稳定性。更重要的是，由于该组装技术是一层 层进行组装的，所以很容易构建各种具有复杂界面的纳米超薄膜，使其具有单一 纳米材料所不具备的性质及功能。 图3 a l t e r n a t i n ga d s o r p t i o no fp o l y e l e c t r o l y t e si nt h el a y e r - b y - l a y e rt e c h n i q u e ( 该图引自文献【3 2 】) 9 复旦大学硕士学位论文 第一章 制备生物传感器的核心部分是生物活性分子( 如酶分子) 的固定化，功l 技术 用于传感器的研究中有多种形式： 1 以酶的层层组装为例，根据酶分子的等电点选择适当的p h ，使酶分子带 有过多的正电荷或负电荷，然后吸附酶到带有相反电荷的聚电解质上，接着重复 交替吸附聚电解质和酶。通常是把酶当作大阴离子，靠静电作用和其它的大阳离 子如聚赖氨酸，聚烯丙胺等，在电极表面上一层一层地吸附沉积组装酶电极 【3 3 ，3 4 1 。 2 利用生物特异性结合的特点束实现层层组装。例如在一个酶分子上修饰 多个抗体，预先在电极表厩上固定一层抗原，靠抗原抗体的特异性结合一层一 层地沉积组装酶电极【3 5 】。类似地，可用生物素把酶修饰，先在电极表面上固定 一层抗生物素蛋白，靠生物素一抗生物素的特异性结合一层一层地沉积组装酶电 极。这类方法实现了三维有序地组装生物分子，并能通过控制组装的层数来调节 酶电极响应的电流密度，在生物技术领域中具有潜在的优势。 3 先利用功l 技术构建纳米复合膜，然后将其用于固定生物分子 3 6 3 9 。由 于超分子静电自组装方法来修饰基底表面的操作方法简单，同时组装薄膜