免疫球蛋白基因ppt课件.ppt

第四章免疫球蛋白基因,1,.,免疫球蛋白是指具有与抗原决定簇特异性结合的许许多多球蛋白分子的总称。,因为抗原的种类极多，每种抗原上有不同的抗原决定簇，免疫球蛋白分子的种类可以多达百万以上。人的基因组总数也不过l0万-20万。研究发现，不同免疫球蛋白的数量如此庞大是由于基因重排的结果。,2,免疫球蛋白的基因库1.H基因库（重链基因连锁群）第14号染色体2.基因库（链基因连锁群）第2号染色体3.基因库（链基因连锁群）第22号染色体,3,免疫球蛋白基因结构,轻链有两种，即K链和链。,胚系DNA的K链基因由Vk，Jk，和Ck三类基因片段组成；每个v区基因上游都有一个L基因编码的信号肽；J基因片段由5个基因组成，其中JK3是无效基因；J基因之间相距较近，J基因编码的氨基酸也属于V区肽段的一部分，称为连接片段；只有一个C基因，编码K链C区肽段。,K链基因结构,4,胚系DNA的链由V、J和C三类基因组成；小鼠的链基因只有Vl和V2两个V基因，两个L基因即Ll，L2在V基因的上游；J基因片段有4个基因，C基因片段也有4个基因，但其中J4和C4为无效基因，其余基因成簇排列；V基因编码链的V区，J区基因编码链的V区。C基因编码链全部C区。,5,重链基因结构更为复杂，编码可变区的基因片段除V，J和C基因片段外，还有D基因片段。D片段位于VH和JH之间，编码的氨基酸位于CDR3，与抗体的多样性有关，故称D基因。,6,VDJ-CIgM,VDJ-C3IgG3,IgMIgG3?,IgM其他类别或亚类Ig的现象,称为类别转换,C基因的5端一段重复性DNA序列,称为转换区(switchregion),仅C区转换抗原特异性不变,5,C,C,7,免疫球蛋白基因的重排,轻链（K）基因重排,免疫球蛋白基因，是在B细胞发育到小前B细胞时才开始发生重排，使分布在胚系DKA上不同区域的V、J和C基因片段中的基因重排组合在一起，成为一个成熟的Ig基因，进而转录翻译为成熟的轻链。,K基因可以通过Vk区基因片段缺失、倒位的方式随机与一个相隔一定距离的任何一个Jk基因片段相连接；重排后的VkJk片段再与Ck连接形成完整K链DNA，其中还有少数内含子，转录后通过拼接除去；经加工修饰，在RNA前体的5和3端分别加上帽结构和PolyA尾，成为成熟的K链mRNA；mRNA从细胞核转移到细胞质中，翻译为K肽链。,8,9,重链基因重排与表达,重链基因是通过两次重排形成的。第一次基因重排是D基因片段与JH基因片段的重排连接，得到DJH基因片段；第二次基因重排是VH基因片段与DJH片段重排和连接，得到VHDJH的连接片段；经过两次重排的DNA仍有一内含子，经过转录以后得到初转录的RNA，再修饰成为成熟的H链mRNA，翻译出H链蛋白。,10,11,体细胞基因突变,V区基因在重排后仍可发生改变、这种改变是由体细胞突变产生的。体细胞突变只改变VJ或VDJ单个片段的个别核苷酸，也会导致免疫球蛋白的特异性变化。体细胞突变只发生在IgG和IgA，而不发生在IgM，因此这种突变可能与免疫球蛋白的种类转换有关。B细胞发生体细胞突变的频率很高，平均每次细胞分裂，每对碱基发生突变的概率为10-3，比其他基因的自发突变频率高106倍。,12,免疫球蛋白的合成与分泌,初次应答初次应答的特点是抗原第一次免疫后血清中抗体浓度缓慢地增加，从诱发免疫到抗体产生有一个较长的迟滞期。抗体产生的量较少，效价低。抗体以IgM为主并最早出现。IgG也有，但出现较IgM为迟。初次应答的高峰期大约在免疫后10d左右。初次应答答除了产生特异的浆细胞分泌抗体之外，还有一些受到刺激的幼B细胞发育到一定程度不再分化而保持体止状态，这就是记忆B细胞。记忆B细胞不分泌抗体，只有在受到特异性抗原刺激后才能激活而成为分泌抗体的浆细胞。记忆B细胞是长命B细胞，可以存活数月甚至机体终身存活。,13,免疫应答过程中抗体产生规律,14,再应答当用与初应答相同抗原再次或多次免疫同一动物产生的免疫应答即为再应答。再应答与初次应答不同的是：应答反应的速度快，记忆B细胞受到特异性抗原刺激后立即开始反应；产生的抗体以IgG为主，IgM很少，此外还出现IgA、IgE；产生抗体的量远远超过初次应答，抗体具高亲和力。,15,16,Td和Ti抗原的免疫应答蛋白质抗原在T细胞缺乏时不诱导抗体产生，故称为胸腺依赖抗原（Td抗原）。Td抗原激活B细胞，除必须有抗原作为第一信号外，还需Th细胞及其分泌的细胞因子作为第二信号。一些非蛋白抗原如多糖、脂类、核酸等诱导的抗体反应无需Th细胞，因此也称非依赖性抗原(Ti)。Ti抗原能诱导初次免疫应答，而无记忆细胞产生，因而也无重链转换和亲和力成熟的再次免疫应答。,17,抗体形成中抗体种类的转换机制,抗体免疫应答中首先出现IgM同种型，然后出现1gG；特别在再应答中有许多类型的同种型出现。控制抗体类别转换的核酸序列称为转换区。活化后的B细胞DNA上每一类C区基因的上游都有一个个转换区。C的转换区S的结构是由(GAGCT)nGGCGTm重复序列组成的，n=17，以n3最常见，m可多达150。转换区的长短次序为SlS2bSS3S2a.,18,具有免疫球蛋白种类特异性的重组酶分别与这些转换区的序列结合成为基因重排中产生那种免疫球蛋白同种型及其亚型转换的重要环节。有报道表明转换信号来自Th细胞合成的细胞介素，如细胞介素IL-4。在转换中会发生转换区的重组，如转换区S与Sl通过缺失连接重组，重组的转换区DNA经过转录和剪接，除去S的3端与Sl的5端之间的一段DNA序列使VDJ则能与Cl最紧密地连接为VDJCl的mRNA，最后表达IgGl免疫球蛋白。,19,20,21,影响体液免疫应答的因素,不同种类的抗原和不同的免疫途径导致免疫应答的方式与特点的变化。不同种类细胞因子或其相对比例不同对B细胞的作用也不一样。Th1细胞主要诱导细胞免疫和迟发型变态反应；Th2细胞刺激IgE和IgG1(小鼠)或IgG4(人)抗体形成。刺激B细胞的增殖的细胞因子有多种，如来源于T细胞的细胞因子IL-2、IL-4和IL-5。,22,免疫球蛋白mRNA与其他蛋白基因的表达方式类似，免疫球蛋白基因转录产生的RNA前体需经过修饰才形成有功能的mRNA。在免疫球蛋白RNA前体近3端有一保守的多聚腺苷酸化信号（AAUAAA），poly(A)多聚酶识别此信号序列，在其下游1530核苷酸处切开，并加上约250个腺苷酸形成poly(A)尾，同时在5端形成帽结构。加帽和接尾完成后，RNA前体经过RNA剪接除去内含子并将外显子连接起来。mRNA一旦形成，即从核中转出，与胞质中的核糖体结合。,23,膜结合型和分泌型免疫球蛋白的表达,抗体的存在形式：膜型(membraneimmunoglobulin,mIg)膜表面免疫球蛋白，B细胞膜上的抗原受体；分泌型(secretedimmunoglobulin,sIg)分泌进入体液,介导体液免疫应答。,24,如CH基因片段由Cl，C2，C3和C4四个外显子分别编码；在C4外显子的下游约1.8kb处还有两个外显子M1和M2分别编码跨膜部分和胞内部分；在RNA前体中有两个poly(A)信号位点，位点1位于C4的3端，而位点2在M2外显子的3端；如果剪切相加尾发生在位点1，则形成分泌型的mRNA；如果剪切和加尾发生在位点2，则C4的3端的亲水序列除去并与M1外显子拼接，形成膜结合型mRNA。,25,26,B细胞发育与抗体形成,B细胞来源于骨髓的干细胞，早期的B细胞并不分泌免疫球蛋白；形成抗体分泌B细胞（浆细胞）需经过两个发育阶段：即非抗原依赖阶段和抗原依赖阶段前一阶段主要发生在骨髓，后一阶段发生在外周循环中。,27,从原始造血细胞分化发育为成熟的B细胞，需经过原B细胞，前B细胞，幼B细胞(包括小幼B细胞和幼B细胞)等中间发育阶段。在成熟B细胞阶段表达膜抗体即抗原受体mIgM和mIgD，并从骨髓迁至外周淋巴器官脾和淋巴结，在这里接受抗原的刺激，发育为抗体分泌的浆细胞和记忆B细胞。,28,29,抗体在细胞内的装配，运转与分泌,抗体是在细胞的粗面内质网上由不同的多聚核糖体参与分别翻译成L链和H链的。L链和H链在多聚核糖体上开始聚合装配。装配的Ig分子转入糙面内质网；脱下先导序列，进入平面内质网，直到高尔基体；在高尔基体内运转过程中继续完成链的装配及糖的修饰，通过“出芽”的方式形成许多允满抗体的小泡；小泡移动到胞膜，并与胞膜融合使抗体释放到细胞外。,30,31,在个体发育过程中，34个月的胎儿淋巴细胞已经达到了成人的水平；但胎儿主要形成B细胞表面上膜结合抗体；出生以后随年龄的增加依次形成IgM，IgG，IgA。大约到7岁IgG才能达到成年水平。,32,33,出生时婴儿的抗体IgG都来自母体，出生后迅速下降，到第7个月完全消失。同时婴儿自身形成的抗体是随浆细胞成熟的水平逐步增加。,34,35,免疫血清的制备,1.免疫动物选择2.免疫方法3.动物采血法4.免疫血清的分离及保存,36,一、免疫动物选择,能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。,一、免疫动物选择,1.抗原与免疫动物种属差异越远越好；,2.动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、体重合乎要求；,3.不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答；,4.按需要量选择大小不同的动物。,37,二、免疫方法,3.免疫方案全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐剂1月抗原混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉,二、免疫方法,1.免疫原的注射剂量,2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌,38,三、动物采血法,1.颈动脉放血法：最常用的方法2.心脏采血法：要求操作熟练3.静脉采血法：,1.4保存：可保存36个月2.低温保存：-20-40，可保存23年3.冰冻干燥保存：可保存35年,三、动物采血法,四、免疫血清的分离和保存,39,抗体的纯化和鉴定,1.抗体特异性的纯化2.特异性IgG类抗体的纯化3.特异性抗体的鉴定,40,一、抗体特异性的纯化,1.亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose4B上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异性抗体。,一、抗体特异性的纯化,2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。,41,1.盐吸沉淀法：经硫酸铵盐析提取球蛋白3次，基本为IgG类抗体，但不纯。,二、特异性IgG类抗体的纯化,2.A蛋白亲和层析：SPA与IgG的Fc段有很强的特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地与抗体结合，一个A蛋白至少可以结合二个IgG分子。适合纯化细胞培养上清中的McAb。,3.其它：凝胶过滤、离子交换层析等,42,三、特异性抗体的鉴定,1.抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定,三、特异性抗体的鉴定,2.抗体特异性鉴定：细菌类抗原的抗体用凝集试验可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验,3.抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法,43,1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。,2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。,3.可进行任意稀释。,抗体效价滴定,44,原理,凝集试验,抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。,操作步骤,方法评价：敏感度较低、简便、易受抗原抗体比例影响,临床意义：测定抗原抗体反应的最适比。,45,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,各管抗原倍比稀释,加入抗血清,各管抗体量不变,振摇混匀、37孵育,沉淀量不同,出现沉淀量最多的管为最适比例管。,轻摇,絮状沉淀试验,絮,状,沉,示,意,图,淀,Ag,AbAg,46,原理,二、双向琼脂扩散试验,将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成沉淀线。,操作步骤,应用：1.检测未知Ag或Ab2.Ag性质分析3.Ab效价滴定4.Ag或Ab纯度鉴定,47,双向琼脂扩散试验原理示意图,Ab,Ag,模拟图,染色标本图,1.抗原抗体双向自由扩散2.24小时出结果3.呈现沉淀线或弧,48,抗原抗体反应的特点,*1.特异性*2.比例性*3.可逆性,49,一、特异性（specificity）,*概念：抗原分子，只能与由它刺激所产生的抗体结合而起反应的专一性能。,一、特异性,*决定因素：由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补性决定的。抗体分子N端可变区形成3nm1.5nm0.7nm的槽沟，只有与其空间结构互补的抗原决定簇才能如楔状嵌入。,*交叉反应(crossreaction)两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇，则可与彼此相应的抗体反应。,50,特异性示意图,51,*最适比(optimalratio)或等价点(equivzlencepoint)最迅速出现沉淀时的抗原抗体的浓度比或量比。,二、比例性（proportionality）,等价带(equivalencezone)抗原与抗体分子比例合适的范围。,带现象：Ag与Ab比例不适而不出现可见反应。*前带(prozon